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方法文章

九日龄小鼠幼崽的肝外胆管和胆囊解剖

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DOI：

10.3791/64424

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2022年8月23日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 2Research Laboratory for Pediatric Surgery, 3Research Animal Facility, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

本文内容

摘要

为了观察小鼠新生仔鼠的胆管异常，需要保持胆管的完整性和高效的制备方法。因此，我们成功建立了一种新的方法，可在维持胆管完整性的前提下，分离出小鼠新生仔鼠的整个肝外胆管系统。

摘要

小鼠新生仔鼠胆管的解剖一直被认为具有难度。本描述的标准操作流程主要目的是在不损伤胆管的前提下，分离小鼠新生仔鼠的肝外胆管（EBD）。由于该方法对胆管上皮细胞系的干扰极小，并能完整获取整个肝外胆管系统（EBDS），因此在研究新生儿胆管疾病（如胆道闭锁）的动物模型中具有极高的应用价值。在实施安乐死后，打开腹腔，采用独特的整块切除法（En-bloc-Resection, EbR）将胆管系统、十二指肠和肝脏一并取出。将取出的组织样本置于泡沫垫上，以无创方式分离肝外胆管，避免接触污染细胞，无需直接触碰胆管即可完成操作。完整解剖整个EBDS是本方法的重要优势。由于胆管组织体积微小、数量有限，操作时必须格外谨慎。采用本技术可确保胆管上皮细胞不受损伤，且该操作的纯度具有良好的可重复性（n = 10），因而能够获得高度可比的样本。此外，在制备过程中可完全避免对胆管组织的损伤，因整个操作无需接触胆管系统，胆汁得以保留在胆囊内。尤为关键的是，在最终进行胆囊和胆管解剖时，仅在胆管侧方轻微使用无创显微器械，绝不挤压胆管。这是获得清洁且完整样本的关键，对后续组织学分析或胆管上皮细胞的分离至关重要。综上所述，本项创新性解剖技术使得即使经验不足的操作者，在具备必要设备的情况下，也能尽可能干净地分离出EBDS。

引言

胆道疾病（如胆道闭锁、原发性硬化性胆管炎（PSC）和原发性胆汁性胆管炎（PBC））的发生与进展机制目前尚不明确或尚未完全阐明1,2。对这些疾病起源与进展机制的认识有限，导致可用的治疗手段极为匮乏3。研究新生儿胆管疾病时最困难的障碍在于从分子层面理解其病理生理过程。要更深入地了解分子病理学，关键之一在于尽可能精确地观察受累组织。为避免研究之间因可比性降低或结果不一致而产生偏差（例如在观察胆道闭锁潜在病毒病因时4, ），迫切需要优化解剖技术的制备流程并实现技术共享。目标组织的纯净制备对于后续显微观察或建立细胞培养及三维类器官培养体系至关重要。然而，在小鼠新生儿疾病模型中，组织样本稀少且获取量极小，主要受限于其体积微小。就胆管疾病而言，已有文献描述在小鼠新生儿中进行胆管清洁解剖存在困难5。由于处于新生儿发育阶段，组织分化程度较低，这使得解剖操作更加复杂，难度远高于成年动物样本的处理。因此，本手术研究团队探索了一种在新生小鼠模型中制备胚胎胆道系统（EBDS）的新型策略。本研究中所述技术可实现对每一份样本的高效解剖。

胆道系统位于右上腹的腹膜内，起源于肝脏。胆囊位于肝右叶脏面的下方。胆管与门静脉和肝动脉一起包埋于肝十二指肠韧带中。它直接连接肝脏与十二指肠，并将胆汁排入十二指肠6。解剖学上，胆道系统可分为左、右肝管、肝总管、胆囊管以及由胆囊管与肝总管汇合形成的胆总管（Ductus choledochus）7。最终，胆总管通过Vater壶腹将来自胰管的胆汁和胰液排入十二指肠 via 的 Ampulla of Vater。

胆管上皮细胞在肝内和肝外胆管中形成衬里，存在于一个复杂的解剖微环境中，在此参与胆汁的生成与稳态维持8。每天，高浓度的胆汁液体流经这些特化的上皮细胞。其中，碳酸氢根（HCO3-）保护层的维持对于抵御胆汁酸的毒性作用尤为重要9。胆管上皮细胞在肝胆系统中构成抵御腔内微生物等病原体的第一道防线10。遗传易感性可能削弱胆管上皮细胞对抗毒性损伤的防御能力。毒性物质过载可导致细胞损伤和破坏，从而引发胆管疾病（cholangiopathies）。此外，发育中的胆管尚未完全具备所有自我保护机制，因此新生儿胆管对环境毒素更为敏感11。

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方案

在获得伦理批准（N045/2021）后，对雄性和雌性C57BL/6小鼠新生鼠进行观察直至出生后9天。实验动物由德国汉堡-埃彭多夫大学医学中心动物实验设施提供并用于实验。新生鼠与其亲代动物共同饲养于同一笼具中。环境条件控制在温度20–24 °C、12小时光照与12小时黑暗循环，以及相对湿度40%–70%。

1. 实验准备

  1. 准备手术所需设备，包括剪刀、镊子等（参见材料表）。
  2. 将已消毒并经高压灭菌的器械放置在手术台旁的无菌表面上。
  3. 使用手术剪迅速断头处死一只出生第9天（P9）的新生小鼠。将处死后的新生小鼠尸体置于无菌手术区域。解剖9日龄新生小鼠的EBDS（步骤5）。
    ​注意：所述解剖步骤可为任何科研人员提供从新生及较大龄小鼠中分离EBDS的适当技术。小鼠年龄越大，组织制备越容易。

2. 进入腹腔

  1. 用镊子夹住膀胱上方的皮肤。使用剪刀在皮肤上切开一个直径为2 mm的孔，注意不要损伤腹膜及深层结构。沿左侧腋前线将切口向断头处延伸。用无创镊子从左向右剥离皮肤。
  2. 抓住脾脏周围的腹膜。轻轻向上提起，使腹膜形成类似帐篷的结构，然后在其中心剪出一个直径约1 mm的小孔。等待 "腹膜牵开" 充满空气。此步骤及后续步骤均使用10倍显微镜放大倍数。
  3. 在下肋缘、双侧腹部侧区及膀胱下区所围成的区域，剪开腹膜形成窗状切口，以充分暴露肝脏、胆道系统、胃、小肠和结肠。
    ​注意：为了更好地暴露肝脏，可额外进行切口，切除最下方的三根肋骨，同时保持剑突、镰状韧带、肝脏及胆道结构完整。肝脏视野易于暴露。

3. 胆囊和胆管的检查

注意：在后续所有步骤中，需定期保持样本湿润。

  1. 将剑突轻轻向头侧腹面方向牵拉，以暴露胆囊。
    注意：此操作会增加镰状韧带的张力，使附着其上的胆囊变得可见。
    1. 仅需轻微牵拉，避免镰状韧带发生无法控制的撕裂，否则可能导致胆囊从胆道系统撕脱。在进行下一步操作前，应先释放对剑突的牵拉。
  2. 轻柔下拉十二指肠，以游离胆道系统。
    ​注意：随着肝十二指肠韧带张力的增加，胆管组织将变得可见。

4. 整块切除

  1. 按照以下步骤进行下部整块游离。
    1. 识别连接胆道系统与十二指肠的十二指肠乳头。
    2. 在乳头右侧约 2 cm 处横向切断十二指肠 。
    3. 切断幽门区域。确保在切开位置与十二指肠乳头之间的幽门区域中存在胃内容物。
      注意：此步骤对于后续确定十二指肠口侧和肛侧部分的正确方位至关重要。
  2. 进行上部整块游离。
    1. 轻柔牵拉剑突，暴露镰状韧带。
    2. 在胆囊与剑突之间，尽可能靠近剑突处，沿镰状韧带做长约 1 cm 的切口。注意避免损伤胆囊。
    3. 切断肝脏与胸腔之间的以下连接结构：食管、下腔静脉、胸主动脉、围绕肝裸区的所有韧带，以及所有背侧残余的组织连接。
      ​注意：整块标本已完全游离。标本包含肝脏、胆道系统以及与胃幽门部相连的十二指肠体部。

5. 胆囊和胆管的最终解剖

  1. 按照以下步骤进行大体标本制备。
    1. 将整块标本置于通常用于脱水的泡沫垫上。此步骤及后续步骤均使用20倍显微放大倍数以及两把最大尖端尺寸为6 mm的显微外科无创镊。
    2. 在泡沫垫上组装标本，将其重新排列至正确的解剖位置。轻柔操作，展平十二指肠的口侧和反口侧部分。
    3. 从十二指肠乳头开始，使用无创镊向切缘方向进行操作。轻柔展平胃内白色糊状内容物，该内容物仅出现在十二指肠的口侧部分。务必辨认十二指肠的口侧与反口侧部分，以排除可能存在的胆管旋转异常。
    4. 切除大量残留的肝组织，以开始胆管的解剖分离。
  2. 进行最终分离。
    1. 将残留的肝组织轻轻压入泡沫垫的孔隙中。确保刮除动作从胆管系统起始，朝向肝脏边界进行。
    2. 在多个不同方向进行数次刮除后，将标本转移至泡沫垫上更清洁的位置。利用背景中受压较少的肝组织，优化视野，以实现肝外胆管系统（EBDS）与非目标细胞之间的最佳分辨。从胆管上刮除肝组织，直至无残留或尽可能少地残留肝组织。
    3. 继续处理肝十二指肠韧带，直至仅剩分离出的EBDS。移除韧带内的血管结构，如肝动脉、门静脉及微小残留组织。将这一细小纤维束轻柔且谨慎地向左侧外侧牵拉并移除。此解剖步骤可能在先前去除肝组织过程中已无意中部分完成，但最终结果一致。
      注：血管结构表现为一条白色且极为纤细的纤维束，位于十二指肠乳头口侧约3–5 mm处，从左侧外侧汇入肝十二指肠韧带，并与胆管共同构成格利森三联征（glissonian triad）。完成此步骤后，最终标本即完全分离。如需记录，可在将胆管结构复位至解剖位置后拍摄图像（图1）。建议在泡沫垫上完成最后的制备步骤，因为标本在此表面不易粘连。若孔隙湿润，胆管可呈悬浮或漂浮状态；移动标本时，其粘附程度低于在手术布上操作的情况，从而避免移动过程中发生撕裂。

6. 组织学分析的准备工作

  1. 解剖后应尽快将分离的样本放入缓冲液、专用培养基或含甲醛的固定液中（参见材料表）。
  2. 根据后续计划的处理步骤选择合适的保存溶液。
    警告：含甲醛的固定液具有急性毒性、腐蚀性及多种健康危害，仅可在通风橱中使用。
    备注：在本研究中，EBDS 样本被置于多聚甲醛中固定，经脱水后包埋于石蜡中。样本在室温下保存，并在切片前进行冷却。切片厚度为 2 µm，在温育箱中放置过夜，随后采用常规苏木精-伊红染色法4进行染色（参见材料表）。

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结果

图1A 显示了一只新生小鼠的胆总管标本（EBDS），该标本使用所述技术进行解剖。显微镜下未见其他肝组织残留。在本方案的最后分离步骤中，肝组织已被完全去除，并可根据颜色和质地与胆管组织清晰区分。图1B 显示了分离后样本与毫米刻度尺的对比。EBDS的长度（从胆囊至十二指肠乳头测量）小于10 mm。极为纤细的胆总管（Ductus choledochus）直径在0.05–0.2 mm之间变化。图2 展示了EBDS纵向切面的苏木精-伊红染色图像，可见开放的管腔。胆管上皮细胞（cholangiocytes）围绕管腔呈单层排列，染色较深。显微观察使用20倍放大倍数。这些图像表明，采用所述解剖方案，操作者可在显微镜下精确地沿胆管边缘进行EBDS解剖，即使在新生小鼠中亦可实现。所有样本均取自出生后第9天的小鼠幼崽。

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讨论

本文报道并讨论了一种用于摘除安乐死后新生小鼠胚胎下颌唾液腺（EBDS）的新型外科手术方法的建立与验证。显微及组织学结果表明，该方法能够快速定位EBDS，并可在导管边缘附近进行精细分离，即使在新生小鼠中亦能有效操作。所述方案仅需常规手术器械和20倍放大倍数的显微镜即可完成。此外，该方法可实现完整EBDS的分离。该技术高效、简便，易于重复。

在研究胆道闭锁、原发性硬化性胆管炎（PSC）和原发性胆汁性胆管炎（PBC）等胆道疾病时，通常需要机械性完整提取整个胆道系统。由于胆道结构微小，尤其是在新生儿中，其分离、处理和分析均较为困难。尽管已有针对出生1天小鼠肝外胆管细胞分离的技术报道，但该方法被认为操作难度较高。通常，初学者在操作过程中会因解剖技术及微小胆管清洗方面的技术挑战而遇到困难5。因此，本操作团队探索了一种在新生小鼠模型中制备肝外胆管（EBD）的新策略。本研究所述技术可实现每份样本的高效解剖。新生小鼠在出生后第9天被处死，胆道组织按本方案所述方法获取。此外，该技术同样适用于更早期的新生小鼠。部分个体在未满9天时即死亡或需提前处死，包括体...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢Johanna Hagens、Pauline Schuppert、Clara Philippi、PD Dr. med Christian Tomuschat、Svenja Warnke、PD Dr. Diana Lindner、Prof. Dr. Dirk Westermann、Miriam Tomczak、Nicole Lüder、Nadine Kurzawa、Dr. rer nat. Laia Pagerols Raluy、Birgit Appl和Magdalena Trochimiuk所做出的贡献。 Hans Christian Schmidt获得了汉堡大学医学中心（UKE）伊尔泽·克勒纳-弗雷森纽斯基金会（Else Kröner-Fresenius-Stiftung）iPRIME奖学金（2021_EKPK.10）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-丙醇CHEMSOLUTE11365000用作脱水剂
30 G 套管针B Braun/Sterican，德国美尔森4656300用于样品水合的套管
通气孔C + P Möbelsysteme GmbH & Co. KG，德国布赖登巴赫Tec-Ononmic AZ 1200使用通气孔有助于避免吸入含甲醛的固定剂
注射用水 BraunB Braun，美尔松根，德国2351744生理盐水；容器：Mini-Plasco connect，20 × 10 mL，无菌
更大的显微外科镊子DIADUST von Aesculap，Trossingen，德国FD253R直的，180 mm（7"），平台尖端，圆柄，宽度：0.800 mm，金刚砂涂层，非无菌，可重复使用，可选工具，用于除最后精细制备外的所有观察和制备步骤；分割腹膜皮肤
相机 “SmartCAM 5” 巴斯勒与维景工程公司，英国森德EVC131A可选Lynx Exo相机模块：传感器类型：CMOS，分辨率：2560 × 1920像素，传感器尺寸：1/2"；用于视频制作和技术评估
脱水机/Citadel 2000 组织处理仪Fisher Scientific GmbH，德国施韦尔特12612613用于自动脱水，短程序（约 4.8 h）
脱水海绵 Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄TT56.1用于最终解剖步骤的海绵，其他孔径不低于每英寸60孔的海绵或泡沫垫也同样适用，可使用  每个包埋盒建议使用两块泡沫垫，分别置于样本的上下方，以防止样本从包埋盒的穿孔中滑出
杜尔贝科´磷酸盐缓冲液（PBS）Gibco14190-144不´不含钙或镁，500 mL
包埋盒Engelbrecht GmbH, Edermü德国17990
伊红MEDITE 医疗有限公司，德国布尔戈多夫41-6660-00即用型染色液
精细剪刀 CeramaCutFST，德国海德堡14959-09提示：尖端-尖端，材质：陶瓷涂层不锈钢，锯齿状：是；特性：CeramaCut，尖端形状：直型，切割刃长度：22 mm，总长度：9 cm；适用于皮肤切口、腹膜窗切开
格劳费镊子FST，德国海德堡11051-10长度：10 cm，尖端形状：弯曲、带锯齿，尖端宽度：0.8 mm，尖端尺寸：0.8 × 0.7 mm，合金/材料：不锈钢
苏木精MEDITE 医疗有限公司，德国布尔戈多夫41-5130-00即用型染色液
高分辨率显微镜Vision Engineering，发送至英国EVO503 可放大至60倍，但仅使用了6倍至20倍的放大倍数 
显微镜奥林巴斯光学有限公司，德国汉堡BX60F5
显微镜盖玻片Marienfeld, Lauda-Kö尼格斯霍芬，德国10124460 毫米宽，由 SCHOTT D 263 玻璃制成
显微镜载玻片R. Langenbrinck GmbH，德国恩门丁根03-0060
切片机徕卡，Nuß洛赫，德国SM2010R切片工具（2 µm-切片 
Omnifix-F 1 mL 注射器B Braun，美尔松根，德国9161406V无套管针头的注射器
石蜡Sakura Finetec，Torrance，美国4511Tissue-Tek 石蜡 Tek III，不含 DMSO
石蜡包埋机MEDITE 医疗有限公司，德国布尔戈多夫TES 99本研究中使用的包埋机包含以下三个独立模块：TES 99.420、TES 99.250、TES 99.600。样本在脱水后应立即进行石蜡包埋，不得中途存放在冰箱中，以免因冰箱内湿气导致样本收缩。
多聚甲醛（PFA）Morphisto1176201000将肝组织样本以1 mL分装至2 mL Eppendorf离心管中，肝外胆管样本以0.5 mL分装至1 mL Eppendorf离心管中，均用pH 7.4的磷酸盐缓冲液配制成4%溶液 
小型显微外科镊 EPM（Erich Pfitzer 医疗技术公司），Bütthard，巴伐利亚，德国(00)165圆柄直头，尖端0.3 mm，适用于观察和各个制备步骤的工具，尤其适用于最终制备阶段
不锈钢尺Agntho's AB，Lidingö瑞典30085-15150 毫米，公制 &英寸刻度
手术剪 – 用于断头的锐性-钝性器械FST，德国海德堡14001-14断头装置
温箱Haraeus，德国哈瑙T 6060切片样品应保存在温育柜中，以确保样品牢固附着于显微镜载玻片上

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