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方法文章

伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）复合体及回归热疏螺旋体的培养方法

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DOI：

10.3791/64431

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2022年11月25日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Mt. Allison University, 2Department of Molecular Biology, Umeå University, 3Biology Centre Czech Academy of Sciences, Institute of Parasitology

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

体外 培养是一种直接检测活菌存在的方法。本方案描述了多种细菌的培养方法 伯氏疏螺旋体 螺旋体， 包括那些 Borrelia burgdorferi 广义复合体，回归热 伯氏疏螺旋体 物种，以及 Borrelia miyamotoi这些物种营养要求苛刻且生长缓慢，但可进行培养。

摘要

的 伯氏疏螺旋体 由三组物种组成，其中包括莱姆病（Lyme borreliosis，LB）组，也被称为 B. burgdorferi 广义（s.l.）并最近被重新分类为 Borreliella，回归热（RF）组 伯氏疏螺旋体，以及第三类与爬行动物相关的螺旋体。基于培养的方法仍然是实验室检测细菌感染的金标准，广泛应用于科研和临床工作，因为从体液或组织中培养出病原体可直接检测到正在复制的病原微生物，并为研究提供原始材料。 伯氏疏螺旋体 和 Borreliella 螺旋体 对培养条件要求苛刻且生长缓慢，因此通常不用于临床培养；然而，培养对于研究而言是必要的。本方案展示了成功培养LB和RF密螺旋体所需的方法学及培养基配方，包括所有已知物种 B. burgdorferi s.l. 复合群，包括 B. afzelii，B. americana，B. andersonii，B. bavariensis，B. bissettii/bissettiae，B. burgdorferi 狭义 (s.s.) 加州伯氏疏螺旋体、卡罗莱纳伯氏疏螺旋体、智利伯氏疏螺旋体、芬兰伯氏疏螺旋体、加里尼伯氏疏螺旋体、日本伯氏疏螺旋体、库尔滕巴赫伯氏疏螺旋体、莱氏伯氏疏螺旋体、卢西塔尼亚伯氏疏螺旋体、海洋伯氏疏螺旋体、梅氏伯氏疏螺旋体、斯皮尔曼伯氏疏螺旋体、田贯伯氏疏螺旋体、乌鸫伯氏疏螺旋体、中华伯氏疏螺旋体、瓦莱西斯伯氏疏螺旋体、扬子伯氏疏螺旋体 和射频螺旋体，B. anserina，B. coriaceae，B. crocidurae，B. duttonii，B. hermsii，B. hispanica，B. persica，B. recurrentis 和 B. miyamotoi培养LB和RF螺旋体的基本培养基是Barbour-Stoenner-Kelly（BSK-II或BSK-H）培养基，该培养基可稳定支持已建立的螺旋体培养物的生长。为了能够培养新分离的 伯氏疏螺旋体 从蜱虫或宿主来源的样本中分离螺旋体时，若接种物中螺旋体初始数量较少，首选改良凯利-佩滕科弗（MKP）培养基。该培养基 также 支持螺旋体的生长 B. miyamotoi RF螺旋体的培养成功与否在很大程度上取决于培养基成分的质量。

引言

Borrelia 是一种螺旋体细菌的属，包含三个主要进化枝：莱姆病（LB）群、回归热（RF）群，以及一个特征尚不明确且似乎仅限于爬行动物的类群。Borrelia 的分类体系正随着分子技术的发展而不断变化，这些技术使得基因组和蛋白质组的比较成为可能，这一点与其他大多数分类群的情况一致1,2,3,4,5,6,7。LB 群（也称为莱姆病相关群）传统上以其特征最明确的成员 Borrelia burgdorferi sensu stricto 命名，统称为 Borrelia burgdorferi sensu lato。 本文采用目前最广泛使用的术语：LB 群、RF 群以及与爬行动物相关的类群，并描述了 LB 群和 RF 群的培养方案。

正如对该家族成员的预期一样 螺旋体科, 伯氏疏螺旋体 可呈现独特的细长螺旋形态，通常长度为20-30 µm，宽度为0.2-0.3 µm。然而 伯氏疏螺旋体属 细胞具有高度多形性，在培养和体内均可呈现多种其他形态 体内1,8 由于其复杂的细胞和遗传结构，螺旋体在平面正弦波形态下，其周质空间内位于内膜和外膜之间的轴向端鞭毛旋转，从而形成该形态。这种结构使细胞具有高度运动能力，且外膜含有使细胞能够与宿主组织相互作用的蛋白质。9,10外膜蛋白的表达受到严格调控，不仅影响对宿主组织的侵袭，还影响与宿主免疫系统的相互作用11该复杂的基因表达使得 伯氏疏螺旋体 细胞在脊椎动物宿主和无脊椎动物媒介截然不同的环境之间穿梭。该基因组 伯氏疏螺旋体 在原核生物中较为罕见，其染色体为线性而非环状。除了线性染色体外， 伯氏疏螺旋体 物种含有7至21个质粒，部分为线性，部分为环状。这些质粒携带了大多数介导宿主适应性和毒力所必需的基因，而来源于前噬菌体的环状质粒被认为在螺旋体细胞间的大部分水平基因转移中起主要作用。12,13. 与在宿主适应中的作用一致，莱姆病包柔氏菌群中的某些成员（可能为许多或全部）在培养过程中会丢失质粒14研究最为深入的 "实验室适应的" 菌株 B. burgdorferi，B31仅含有该物种野生分离株中常见的九个质粒中的七个15同样地， B. garinii 在培养中丢失质粒16一些研究已表明，RF物种及 B. miyamotoi 在培养时保留质粒14,17，但近期研究显示，长期情况下质粒发生变化且感染性发生改变 体外 培养18.

基于培养的方法仍然是实验室检测细菌感染的金标准，广泛应用于科研和临床工作14,17。从体液或组织中培养病原体可直接检测正在复制的病原微生物，并为研究提供原始材料14,17。本实验方案展示了成功培养莱姆病（LB）组螺旋体以及回归热（RF）Borrelia 和 B. miyamotoi 所需的方法和培养基配方。培养 Borrelia 螺旋体的基本培养基为 Barbour-Stoenner-Kelly 培养基（BSK-II 或商业化 BSK-H），可添加或不添加抗生素以抑制污染性原核生物的生长。该培养基最初源自用于培养回归热 Borrelia 的培养基19，后经 Stoenner20 和 Barbour21 进一步改良。此后又发展出多种改良版本，每种改良均可能影响细菌的生理特性，从而影响其生长、感染性和致病性22。该培养基能稳定支持已建立的螺旋体培养物的生长，并已被用于从蜱、哺乳动物及临床样本中分离螺旋体23。近年来发展的改良 Kelly-Pettenkofer（MKP）培养基在从环境样本中分离新的 Borrelia 分离株时表现出更优的分离成功率、形态保持和运动能力，尤其适用于可用于接种培养的螺旋体数量较少的情况23,24。在所有情况下，培养的成功关键取决于新鲜配制的培养基和适当成分的使用；并非所有商业来源的试剂均能制备出高质量的培养基。接种后的培养物可方便地置于常规 32–34 °C 培养箱中静置培养，环境中保留少量残余氧气即可。Borrelia 螺旋体为厌氧菌，但在自然环境中会暴露于氧气和二氧化碳浓度的波动，并通过基因表达的变化作出响应26,27,28,29。因此，在进行基因表达、生长及其他代谢研究时，应使用控氧培养箱或厌氧培养舱来精确控制氧气和二氧化碳水平。在培养过程中，应每周或更频繁地通过暗视野显微镜或相差显微镜检查螺旋体的存在。培养物涂片可通过银染法、免疫组织化学染色或使用荧光标记菌株进行染色检测29,30。PCR 结合 DNA 测序是一种灵敏且特异的方法，可用于检测并从遗传学上鉴定或确认 Borrelia 物种30,31,32,33。

BSK-II 培养基存在多种微小的变体，其中一些已有商业化产品。本文第1节所述方案改编自 Barbour（1984）21。液体 MKP 培养基是一种较新开发的培养基，详见第2节。其制备依据先前报道的方案33,34，与 BSK 培养基类似，分为两个步骤：基础培养基的制备和完全培养基的制备。Borrelia 培养基可按需添加或不添加抗生素，如第3节所述；抗生素的作用是减少接种临床或环境样本时引入的污染细菌，如第4节所述；若接种的是纯的 Borrelia sp. 培养物，则可能无需使用抗生素。制备长期保存的 Borrelia 菌种通常十分重要，第5节描述了相应的操作方案。第6节介绍了如何利用这些培养基从临床或环境样本中分离出纯的 Borrelia sensu lato 克隆。目前已有多种可行方法36；以下介绍一种被证实有效的方法。本方案所用的平板培养基是对 BSK-II 平板培养基37 和 MKP 培养基34（兔血清浓度提高至 10%38）的改良版本。

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方案

所有涉及从人类受试者获取样本的研究均经相关大学和/或医疗机构的机构审查委员会批准，并在采集样本前获得参与者的书面知情同意。所有涉及从动物获取样本的研究均经机构动物伦理委员会批准，并在其指导下进行。在适用的情况下，已获得环境采样的相关批准。

注意：培养的成功与否在很大程度上取决于试剂的质量。市面上有商业化的BSK培养基，可用于接种高剂量的实验室适应型纯种B. burgdorferi及相关物种，能有效支持其生长。但对于来自原始生物材料的菌株分离物，建议使用新鲜配制的培养基，且通常必不可少。

Borrelia 属是已知或疑似病原体，未经筛查的人体或动物组织也可能构成生物危害。处理潜在感染性材料时，为确保研究人员安全，必须使用个人防护装备并采用无菌技术。此外，由于培养基营养极为丰富，容易导致培养物污染。此类工作通常需要在生物安全二级条件下进行，所有涉及 Borrelia 属的操作或样本处理均应在生物安全柜中进行。

1. BSK-II 培养基制备说明

  1. 完全BSK-II培养基的制备
    1. 获取用于配制1 L培养基的试剂，如表1所示。
      注意：BSA的纯度（或不纯程度）对螺旋体的最佳生长至关重要。特别是不同厂家及不同批次之间的BSA纯度存在差异。请参见表2，了解效果较好与较差的产品列表。从多个供应商处获取样品，测试其支持最佳生长的能力，然后大量采购表现最佳批次的产品，是解决该问题并制备优质培养基的有效策略。
    2. 首先将BSA加入烧杯中，通过搅拌溶于水，此过程至少需要半小时。
    3. 加入所有干性化学试剂并使其充分溶解，然后加入CMRL培养基补充液。
    4. 如有必要，用1 M NaOH将BSK-II培养基的pH值调节至7.6。
    5. 向BSK-II培养基中添加兔血清，使其终浓度为6%–10%。 使用0.22 µm孔径滤器对BSK-II培养基进行过滤除菌。所需血清量取决于Borrelia物种：对于RF型菌株及Borrelia burgdorferi sensu lato，使用6%–7%的兔血清；若生长状况不佳，可额外添加1%–2%无菌兔血清。
    6. 将BSK-II培养基原液分装为100 mL或400 mL等份后冷冻保存。
    7. 对于RF型菌株，需添加明胶。向400 mL BSK-II培养基中加入100 mL 7%无菌明胶溶液（稍加热以助溶解）。接种前需在37 °C下温育含明胶的BSK-II培养基，使明胶完全融化。
      注意：培养基可在过滤除菌及添加兔血清和明胶（针对RF型螺旋体）之前或之后冷冻（-20 °C）。冷冻状态下培养基可长期保持稳定。若存放于冰箱中，应在1个月内使用完毕。RF型菌株在新鲜培养基中生长最佳，通常不超过1周。若未冷冻保存，应目视检查培养基质量，观察是否出现浑浊。如发现污染迹象、成分沉淀或其他可疑情况，应弃用该培养基。
    8. 若需向培养基中添加抗生素，可将其加入新配制的培养基或先前已分装冷冻的培养基中；后者更具灵活性。抗生素使用浓度请参照Oliver等人的文献39。
    9. 在解冻培养基管的同时，使用精密天平将抗生素称量至无菌（经高压灭菌）的1.7 mL离心管或无菌15 mL锥形管中。按以下方法配制母液：将25 mg两性霉素B溶于10 mL DMSO中，20 mg磷霉素溶于1 mL高压灭菌去离子水中，50 mg利福平（美国称rifampin）溶于1 mL DMSO中。
    10. 使用0.2 µm注射器滤器对抗生素溶液进行过滤除菌，并转移至适当大小的新离心管中。
    11. 将抗生素按1:1000的比例稀释于培养基中以达到其终浓度。对于500 mL BSK培养基，加入0.5 mL两性霉素B母液（2.5 mg/mL，溶于DMSO），0.5 mL磷霉素母液（20 mg/mL，溶于无菌H2O），以及0.5 mL利福平母液（50 mg/mL，溶于DMSO）。
    12. 使用添加抗生素的培养基或将之分装后于-20 °C冷冻保存。
成分用量 (/L)
BSA fraction V50 g
CMRL-1066 (10x)100 mL
Neopeptone5 g
Hepes6 g
柠檬酸三钠二水合物0.7 g
葡萄糖5 g
TC Yeastolate2 g
丙酮酸（钠盐）0.8 g
N-乙酰-D-葡萄糖胺0.4 g
碳酸氢钠2.2 g
水（高纯度）900 mL

表1：1 L BSK-II 培养基的成分。

来源适用性
Serva GmbH, Heidelberg, Germany是
Proliant Biologicals, Boone IA, USA是
Sigma (Millipore-Sigma & Sigma- Aldrich), St. Louis, MO, United States否

表2：牛血清白蛋白（BSA）的来源及其在BSK-II培养基中的适用性。

2. 制备MKP的说明

  1. 基础培养基的制备
    1. 仔细称量并溶解以下所列的所有粉末成分 表3 在最终体积的3/4 ddH₂O中2O（约750 mL），搅拌至完全溶解，耗时约1小时。
    2. 完全溶解后，用 NaOH 调节 pH 至 7.6，并定容至 1000 mL，然后通过过滤（0.22 µm 滤膜）进行灭菌。
      注意：基础培养基可在 -20 °C 保存最长 3 个月。
  2. MKP完全培养基的制备
    1. 按所列成分混合所有组分 表4 以无菌方式操作；通过高压灭菌对明胶进行灭菌，并以无菌方式处理。在无菌生物安全柜中操作，使用经无菌过滤的血清。
    2. 将MKP分装至50 mL离心管中。取一小份样品置于33 °C下数天，随后在暗视野显微镜下检查，确认无污染。
      注意：MKP完全培养基在+4 °C下保存不得超过1个月，切勿冷冻。可通过使用0.22 µm滤膜过滤对完全培养基进行额外灭菌。
成分用量 (/L)
CMRL-1066 (10x 无谷氨酰胺)100 mL (若为液体)/9.7 g/L (若为粉末)
新胨 (Neopeptone)3 g
Hepes6 g
柠檬酸 (Citric acid)0.7 g
葡萄糖 (Glucose)3 g
丙酮酸 (Pyruvic acid)0.8 g
N-乙酰氨基葡萄糖 (N-acetylglucoseamine)0.4 g
碳酸氢钠 (Sodium bicarbonate)2 g

表3：1 L基础MKP（改良Kelly-Pettenkofer）培养基的组成。

成分体积 (mL)
基础培养基500
7% 明胶（溶于 H2O，新鲜高压灭菌但不加热）100
兔血清36
35% BSA17.5

表4：MKP（改良凯利-佩滕科弗）完全培养基的成分。

3. 培养 伯氏疏螺旋体，无论是否含有抗生素

  1. 所有实验步骤均须在生物安全柜内的无菌工作条件下进行。使用70%乙醇对台面及所有材料进行消毒，并立即将其转移至生物安全柜内。实验开始前，将所有非生物材料在生物安全柜内经紫外线照射灭菌5分钟。
  2. 尽可能使用最新鲜的培养基。
  3. 启动培养前，将培养基在培养箱中预热至33 °C - 37 °C。如需震荡，可进行振荡。
    注意：根据培养基体积不同，此步骤可能需要数小时。
  4. 取一支先前于-80 °C保存、室温（RT）下解冻至完全液化的甘油或其他保存液中的Borrelia培养物，立即加入5–15 mL预热的BSK培养基中，接种量约为1 mL。使用市售的带螺口盖玻璃或塑料小瓶进行小体积（5–15 mL BSK）接种。将小瓶几乎完全装满，以形成微氧或厌氧环境。拧紧瓶盖；若以此方式培养，则无需额外添加CO2。
  5. RF菌种（以及B. persica）在37 °C培养箱中静置培养，无需搅拌或振荡。B. burgdorferi sensu lato菌种则在33–34 °C下培养。
  6. 使用相差显微镜或暗视野显微镜在200x–400x放大倍数下监测Borrelia培养物的生长情况（图3）。为确保细胞均匀分布，可用移液管轻轻吹打混匀，或使用3 mL转移移液管反复吹吸以充分混悬。
    注意：Borrelia在较高倍数（200X–400X）下更易观察，但在血细胞计数板上以200X倍数进行计数最为准确40。Borrelia的运动方式 和形态特征可作为其存在的判断依据。
  7. 为定量细菌生长，分别在血细胞计数板两侧计数区域的十六格网格中选取多个（10个）小方格进行计数并取平均值。将每个小方格的平均细胞数乘以所用血细胞计数板对应的换算系数 ，以计算出每毫升的细胞数量。
  8. 每隔1–2天监测一次细菌生长情况。Borrelia的指数生长期依赖于细胞活性和初始密度，在34 °C条件下可能需要1周或更长时间。在将样品加载至血细胞计数板前，用培养基以1:2或1:4的比例稀释处于指数生长期的培养物。计算细胞浓度时应计入相应的稀释倍数。使用后，用稀释漂白剂（10%）和/或70%乙醇喷洒台面及血细胞计数板进行消毒。
    ​注意：当细胞浓度达到1–5 × 107 个细胞/mL时，Borrelia处于指数生长期，此范围内细胞生长状态良好。
  9. 长期培养会导致营养耗尽和培养基pH改变，因此需要进行传代培养。在生物安全柜内的无菌条件下，将原培养物体积的1/10转移至新试管中，并用新鲜培养基补足体积（使用与前一次传代相同的培养基新鲜分装液）。1:10的稀释比例为最佳。若需调整培养体积，应相应调整接种量，并继续培养。每次更换培养基即计为一次传代。
  10. 如需提取DNA或分离Borrelia细胞，将处于指数生长期的Borrelia以4000 × g离心10分钟以收集菌体。将上清液弃入合适的生物危害废物容器中。使用商业化的DNA提取试剂盒处理菌体沉淀，或将其重悬于适合后续实验的适当培养基中。
  11. 每次操作结束后，根据设备类型使用乙醇和紫外线对所有设备进行灭菌处理。将包括多余培养物在内的液体废弃物收集至废液瓶中，并加入漂白剂至终浓度为10%。将该废液瓶置于-80 °C冷冻后再行丢弃。或者，也可不使用漂白剂或酒精，通过高压灭菌方式对液体废弃物和培养物进行灭菌处理。

4. 伯氏疏螺旋体（Borrelia）培养物的长期保存

  1. 制备 Borrelia 培养物的甘油冻存液
    1. 取约 1.8 mL 处于对数生长期的培养物（细胞浓度约为 107-108 个细胞/mL），加入无菌甘油，使终浓度为 10%（5%-20% 的浓度范围均可使用）。
    2. ​分装至 2 mL 螺口冻存管中，于 -80 °C 保存。
    3. 每种菌株在冰箱中至少保留 10 支冻存管作为储备。
  2. 用于长期保存的甘油冻存液的另一种保存方案
    1. 将 2/3 体积的 Borrelia 培养物与 1/3 体积的含 15% 甘油的 Brucella 肉汤混合。配制方法：将 2.8 g Brucella 肉汤溶解于 100 mL 去离子水（ddH2O）中，经 0.22 µm 滤膜过滤除菌。
    2. 将样品的甘油冻存液保存在 -70 °C 至 -80 °C 条件下。

5. 从环境或临床样本中分离螺旋体

注意：若从人类、动物或环境来源分离材料，须根据具体情况获得相应的研究伦理、动物护理或生态认证许可。

  1. 培养 伯氏疏螺旋体 来自硬蜱
    1. 采集成年雌性、雄性 和/或 若虫期蜱虫。
    2. 将所有蜱虫样品浸入70%乙醇中2分钟进行表面消毒，随后在生物安全柜中风干。用无菌解剖刀将样品 individually 解剖成若干片段。将片段放入含有1.5 mL培养基（添加抗生素）的2 mL离心管中。
    3. 在34 °C条件下培养样本，前2周每周两次、之后6周每周一次，通过暗视野或相差显微镜检查螺旋体（回归热螺旋体需更频繁检查）。将培养阳性的样本转种至5 mL相同培养基中进行传代培养。
      注意：受污染的培养物可通过使用 0.2 µm 滤膜过滤在一定程度上进行纯化；但可能需要使用抗生素才能彻底消除污染。
  2. 培养 伯氏疏螺旋体 从血液样本中
    注意：血液样本应由合格的医疗、兽医或科研专业人员采集，具体取决于样本来源。样本采集后至室温下保存的时间应少于24小时
    移除并运送到实验室
    1. 采集10 mL血液，收集至含酸性柠檬酸葡萄糖（ACD； "黄顶管") 作为抗凝剂。置于室温保存。建议采血至接种的时间间隔不超过24小时。
    2. 将含抗凝剂的血液在200-400 × g 条件下离心10分钟 g 分离血浆与血细胞。
    3. 轻轻从试管中移除血浆，并将1 mL血浆接种至5 mL预热的MKP完全培养基中。MKP培养基可添加抗生素。将培养物置于33 °C培养，每日进行肉眼观察，并每周采用暗视野或相差显微镜检查，直至观察到疏螺旋体生长（回归热螺旋体更常出现此情况） 伯氏疏螺旋体），可能需要长达9周的时间。
      注意：若使用较大或较小的接种体积，需保持接种物与培养基1:5的比例。应使用血清或血浆，而非全血。
  3. 培养 伯氏疏螺旋体 来自皮肤活检
    1. 对皮肤活检样本进行表面消毒（理想大小为3 mm × 3 mm × 3 mm的立方体；即使用70%乙醇和过氧化氢处理），将活检样本置于生理盐水中。
      注意：应由合格的医疗、兽医或科研专业人员根据样本来源采集活检样本。样本取出后至送达实验室的时间应少于24小时，期间保持室温。
    2. 使用无菌剃刀片在无菌玻璃培养皿中将样本切成两到六个较小的组织块，操作过程中保持样本浸没于生理盐水中。将所有组织块及约1 mL保存皮肤活检样本的生理盐水转移至5 mL预热并添加了抗生素的培养基中，于33 °C条件下孵育。
    3. 若出现污染细菌过度生长的情况，可按照上述步骤1.1.10添加抗生素，或加入两片磺胺甲噁唑（23.75 mg；终浓度5 mg/mL）＋甲氧苄啶（1.25 mg；0.25 mg/mL）或复方新诺明（Bactrim）（最低抑菌浓度 >128 µg/mL）、阿米卡星片剂两片（2 × 30 µg；终浓度 12 µg/mL）和磷霉素片剂两片（2 × 200 µg；终浓度 80 µg/mL）。
      注意：在所有情况下，务必确保低于该抗生素对相应微生物的最低抑菌浓度 伯氏疏螺旋体 尝试培养的物种41,42,43.
    4. 如果培养结果为阳性 伯氏疏螺旋体， 继续培养3-4天，或直至细胞数量达到所需水平 伯氏疏螺旋体 在40倍物镜下，每个显微镜视野中螺旋体数量达到10个以上时，制备甘油菌种保存液以进行长期保存。

6. 单克隆细胞群体的分离  B. burgdorferi  广义螺旋体属螺旋体和  B. miyamotoi  通过在固体培养基上培养从液体培养物中分离

  1. 制备平板时，将300 mL 1.5X MKP完全培养基（不含明胶）加热至温热。同时将200 mL 1.7%琼脂糖（用去离子水灭菌，室温保存，使用前微波加热）加热至55 °C。混合两种液体。
  2. 将15 mL该混合物移液至16个深底培养皿中，以制备底层琼脂OSE层。
  3. 将剩余的培养基在55 °C水浴中保温。
    注意： 伯氏疏螺旋体 混入顶层琼脂糖层中。
  4. 首先，定量 伯氏疏螺旋体 使用血细胞计数板测定培养物密度，并用液体培养基稀释至所需密度。
    注意：每块平板接种 500、200、100 和 50 个螺旋体效果较好。
  5. 底部琼脂凝固后，加入10 mL剩余的琼脂混合液 加入含有适当数量螺旋体的15 mL离心管中。
  6. 将悬液倒入底部琼脂糖中 标记的培养皿。
    注意：由于 伯氏疏螺旋体 螺旋体对高温敏感，应避免细菌在55 °C下长时间暴露；将顶层琼脂加入培养基中的细菌细胞后，应立即倾注。
  7. 平板完全凝固后，盖上培养皿，倒置于34–35 °C、2.5% CO₂条件下培养2.
    注意：如果操作成功，平板接种后1周将出现菌落。
  8. 为筛选和扩增单个菌落，从平板上挑取单菌落，接种于无菌2 mL培养管中的1.5 mL改良液体MKP或其他适宜培养基中。
  9. 在 34 °C 条件下培养，通过暗视野或相差显微镜检查螺旋体。将这些培养物用于分析或制备保存菌种。 如上所述。

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结果

Borrelia 培养基 BSK 和 MKP 及其变体为富含营养的培养基，其成分需按顺序配制和灭菌。正确配制的 BSK 培养基应呈红橙色且澄清透明（图 1）。若培养基在加热后仍存在浑浊或沉淀，则提示原料、培养基制备过程或存在污染问题；此类培养基最好弃用。若在 BSK 或 MKP 中添加明胶，冷藏时培养基会呈凝胶状；加热后则变为液体，但略带黏稠。

纯培养的Borrelia生长不会改变培养基的浑浊度。然而，由于pH指示剂的存在，细菌培养物Borrelia以及污染物的生长均会导致培养基颜色发生变化。其他细菌过度生长会产生浑浊和团块状物质（图2）。

可通过相差显微镜或暗视野显微镜监测培养物的生长情况（图3 和 图4）。处于对数生长期的 B...

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讨论

细菌的实验室培养是科研工作的起点。培养能力所带来的巨大优势，体现在长达一个多世纪、直至近期才取得成功的Treponema pallidum培养研究中；这种螺旋体是梅毒的致病因子44。Borrelia属螺旋体的培养同样具有挑战性，但已实现体外培养23,24,34,44,45,46,47,48,49。

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本工作部分得到了加拿大自然科学与工程研究理事会和加拿大莱姆病基金会（AB 和 VL）、瑞典研究理事会（SB、M-LF 和 IN）、TAČR GAMA 2 项目——"支持生物学研究中心 CAS 应用潜力验证 2.0"（TP01010022）（MG 和 NR），以及捷克共和国卫生部资助项目 NV19-05-00191（MG 和 NR）的支持。我们感谢 S. Vranjes（2021 年，Rudenko 实验室）提供图 4 中的图像，以及 J. Thomas-Ebbett（2021 年，Lloyd 实验室）提供图 5 中的图像。我们感谢所有为该领域做出贡献的研究人员，并对因篇幅限制未能引用其研究成果的学者表示歉意。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.7 mL 离心管VWR87003-294标准物品——任何供应商均可
0.2 µm 无菌注射器滤器 VWR28145-501标准物品——任何供应商均可
10 µL型屏障吸头海王星BT10XLS3标准物品——任何供应商均可
10 mL 血清移液管 Celltreat229011B标准物品——任何供应商均可
1000 µL型屏障吸头海王星BT1000.96标准物品——任何供应商均可
15 mL 离心管Celltreat188261标准物品——任何供应商均可
20 µL型屏障吸头海王星BT20标准物品——任何供应商均可
20 mL 无菌注射器 BD309661标准物品——任何供应商均可
200 µL型屏障吸头海王星BT200标准物品——任何供应商均可
25 mL 螺口培养管Fisher Scientific14-933C标准物品——任何供应商均可
25 mL 血清移液管Celltreat229025B标准物品——任何供应商均可
3 mL 无菌注射器BD309657标准物品——任何供应商均可
35% BSA SigmaA-7409来源很重要——参见注释
5 mL 血清学移液管 Celltreat229006B标准品——任意供应商均可
50 mL 离心管Celltreat229421标准物品——任何供应商均可
6.5 ml MKP 玻璃管 SchottSchott Nr. 26 135 115标准物品——任何供应商均可
阿米卡星SigmaPHR1654标准物品——任何供应商均可
两性霉素BSigmaA9528-100MG标准物品——任何供应商均可
复方新诺明/甲氧苄啶/磺胺甲噁唑SigmaPHR1126-1G标准物品——任何供应商均可
BBL 布氏菌肉汤 BD211088标准物品——任何供应商均可
生物安全柜Labconco302419100标准物品——任何供应商均可
血液采集管（黄色管帽 - ACD）Fisher ScientificBD 含酸性枸橼酸葡萄糖（ACD）的真空采血管玻璃采血管标准物品——任何供应商均可
BSK-H 培养基 [含 6% 兔血清] 达尔林生物制品BB83-500标准物品——任何供应商均可
离心机 Eppendorfmodel 5430标准物品——任何供应商均可
柠檬酸三钠二水合物SigmaC-8532 100 g标准物品——任何供应商均可
CMRLGibco BRL21540 500 mL标准物品——任何供应商均可
CMRL-1066Gibco21-510-018标准物品——任何供应商均可
低温冻存管（Nalgene）Fisher Scientific5000-0020标准物品——任何供应商均可
带堆叠环的深型培养皿 100 mm × 25 mmSigmaP7741标准物品——任何供应商均可
数字培养箱VWRmodel 1545标准物品——任何供应商均可
DMSO赛默飞世尔科技D12345标准物品——任何供应商均可
用于过滤除菌的滤器Millipore 0.22μm GPExpressPLUS 膜SCGPU05RE标准物品——任何供应商均可
明胶Difco BD214340 500 g标准物品——任何供应商均可
玻璃培养管Fisher Scientific99449-20标准物品——任何供应商均可
葡萄糖SigmaG-7021 1 kg标准物品——任何供应商均可
甘油SigmaG5516标准物品——任何供应商均可
血细胞压积离心机（Hematocrit） && 免疫血液学离心机实验室知识Model 3220标准物品——任何供应商均可
HEPESSigma H-3784 100 g标准物品——任何供应商均可
N-乙酰氨基葡萄糖Sigma A-3286 25 g标准物品——任何供应商均可
NeopeptoneDifco  BD211681 500 g标准物品——任何供应商均可
血细胞计数板Sigma Z359629标准物品——任何供应商均可
相差显微镜 Leitz标准品——任意供应商均可
磷霉素SigmaP5396-1G标准物品——任何供应商均可
磷霉素SigmaP5396标准物品——任何供应商均可
PipetboyIntegra标准物品——任何供应商均可
精密标准天平OHAUSmodel TS200S标准物品——任何供应商均可
丙酮酸（钠盐）SigmaP-8574 25 g标准物品——任何供应商均可
兔血清 Gibco16-120-032来源很重要 
兔血清 SigmaR-4505  100 mL来源很重要 
利福平SigmaR3501-1G标准物品——任何供应商均可
碳酸氢钠SigmaS-5761     500 g标准物品——任何供应商均可
Sufametaxazole SigmaPHR1126标准物品——任何供应商均可
TC酵母提取物Difco  BD255752 100 g标准物品——任何供应商均可
移液管VWR470225-044标准物品——任何供应商均可
甲氧苄啶SigmaPHR1056标准物品——任何供应商均可

参考文献

  1. Aberer, E., Duray, P. H. Morphology of Borrelia burgdorferi: Structural patterns of cultured borreliae in relation to staining methods. Journal of Clinical Microbiology. 29 (4), 764-772 (1991).
  2. Estrada-Peña, A., Cabezas-Cruz, A. Phyloproteomic and functional analyses do not support a split in the genus Borrelia (phylum Spirochaetes). BMC Evolutionary Biology. 19 (1), 54(2019).
  3. Parte, A. C., Carbasse, J. S., Meier-Kolthoff, J. P., Reimer, L. C., Göker, M. List of prokaryotic names with standing in nomenclature (LPSN) moves to the DSMZ. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70 (11), 5607-5612 (2020).
  4. List of prokaryotic names with standing in nomenclature Genus Borrelia. , Available from: https://lpsn.dsmz.de/gnus/borrelia (2022).
  5. Margos, G., et al. The genus Borrelia reloaded. PLoS ONE. 13 (12), 0208432(2018).
  6. Gupta, R. S., et al. Distinction between Borrelia and Borreliella is more robustly supported by molecular and phenotypic characteristics than all other neighbouring prokaryotic genera: Response to Margos' et al. The genus Borrelia reloaded. PLoS ONE. 14 (12), 0221397(2019).
  7. Barbour, A. G., Qiu, W. Borreliella. Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria. Trujillo, S., Dedysh, P., DeVos, B., Hedlund, P., Kampfer, F. A., Rainey,, Whitman, W. B. , John Wiley & Sons. 1-22 (2019).
  8. Rudenko, N., Golovchenko, M., Kybicova, K., Vancova, M. Metamorphoses of Lyme disease spirochetes: Phenomenon of Borrelia persisters. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-10 (2019).
  9. Strnad, M., et al. Nanomechanical mechanisms of Lyme disease spirochete motility enhancement in extracellular matrix. Communications Biology. 4 (1), 268(2021).
  10. Niddam, A. F., et al. Plasma fibronectin stabilizes Borrelia burgdorferi-endothelial interactions under vascular shear stress by a catch-bond mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (17), 3490-3498 (2017).
  11. Anderson, C., Brissette, C. A. The brilliance of Borrelia: Mechanisms of host immune evasion by Lyme disease-causing Spirochetes. Pathogens. 10 (3), 1-17 (2021).
  12. Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).
  13. Schwartz, I., Margos, G., Casjens, S. R., Qiu, W. G., Eggers, C. H. Multipartite genome of lyme disease Borrelia: Structure, variation and prophages. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 409-454 (2021).
  14. Lopez, J. E., et al. Relapsing fever spirochetes retain infectivity after prolonged in vitro cultivation. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 8 (6), 813-820 (2008).
  15. Schwan, T. G., Burgdorfer, W., Garon, C. F. Changes in infectivity and plasmid profile of the Lyme disease spirochete, Borrelia Burgdorferi, as a result of in vitro cultivation. Infection and Immunity. 56 (8), 1831-1836 (1988).
  16. Biškup, U. G., Strle, F., Ružić-Sabljić, E. Loss of plasmids of Borrelia burgdorferi sensu lato during prolonged in vitro cultivation. Plasmid. 66 (1), 1-6 (2011).
  17. Gilmore, R. D., et al. Borrelia miyamotoi strain LB-2001 retains plasmids and infectious phenotype throughout continuous culture passages as evaluated by multiplex PCR. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (1), 101587(2021).
  18. Krishnavajhala, A., Armstrong, B. A., Lopez, J. E. The impact of in vitro cultivation on the natural life cycle of the tick-borne relapsing fever spirochete Borrelia turicatae. PLoS One. 15 (10), 0239089(2020).
  19. Kelly, R. Cultivation of Borrelia hermsi. Science. 173 (3995), 443-444 (1971).
  20. Stoenner, H. G. Biology of Borrelia hermsii in Kelly Medium. Applied Microbiology. 28 (4), 540-543 (1974).
  21. Barbour, A. G. Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes. Yale Journal of Biology and Medicine. 57 (4), 521-525 (1984).
  22. Wang, G., et al. Variations in Barbour-Stoenner-Kelly culture medium modulate infectivity and pathogenicity of Borrelia burgdorferi clinical isolates. Infection and Immunity. 72 (11), 6702-6706 (2004).
  23. Pollack, R. J., Telford, S. R., Spielman, A. Standardization of medium for culturing Lyme disease spirochetes. Journal of Clinical Microbiology. 31 (5), 1251-1255 (1993).
  24. Ružiæ-Sabljiæ, E., et al. Comparison of MKP and BSK-H media for the cultivation and isolation of Borrelia burgdorferi sensu lato. PLoS One. 12 (2), 0171622(2017).
  25. Ružić-Sabljić, E., et al. Comparison of isolation rate of Borrelia burgdorferi sensu lato in two different culture media, MKP and BSK-H. Clinical Microbiology and Infection. 20 (7), 636-641 (2014).
  26. Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels. Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).
  27. Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).
  28. Raffel, S. J., Williamson, B. N., Schwan, T. G., Gherardini, F. C. Colony formation in solid medium by the relapsing fever spirochetes Borrelia hermsii and Borrelia turicatae. Ticks and Tick-borne Diseases. 9 (2), 281-287 (2018).
  29. Margos, G., et al. Long-term in vitro cultivation of Borrelia miyamotoi. Ticks and Tick-borne Diseases. 6 (2), 181-184 (2015).
  30. Middelveen, M. J., et al. Culture and identification of Borrelia spirochetes in human vaginal and seminal secretions. F1000Research. 3, 309(2014).
  31. Moriarty, T. J., et al. Real-time high resolution 3D imaging of the Lyme disease spirochete adhering to and escaping from the vasculature of a living host. PLoS Pathogens. 4 (6), 1000090(2008).
  32. Cerar, T., Korva, M., Avšič-Županc, T., Ružić-Sabljić, E. Detection, identification and genotyping of Borrellia spp. In rodents in Slovenia by PCR and culture. BMC Veterinary Research. 11, 188(2015).
  33. Liebisch, G., Sohns, B., Bautsch, W. Detection and typing of Borrelia burgdorferi sensu lato in Ixodes ricinus ticks attached to human skin by PCR. Journal of Clinical Microbiology. 36 (11), 3355-3358 (1998).
  34. Ružić-Sabljić, E., Strle, F. Comparison of growth of Borrelia afzelii, B. gavinii, and B. burgdorferi sense strict in MKP and BSK-II medium. International Journal of Medical Microbiology. 294 (6), 407-412 (2004).
  35. Preac-Mursic, V., Wilske, B., Schierz, G. European Borrelia burgdorferi isolated from humans and ticks culture conditions and antibiotic susceptibility. Zentralblatt fur Bakteriologie Mikrobiologie und Hygiene. Series A, Medical Microbiology, Infectious Diseases, Virology, Parasitology. 263 (1-2), 112-118 (1986).
  36. Preac-Mursic, V., Wilske, B., Reinhardt, S. Culture of Borrelia burgdorferi on six solid media. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 10 (12), 1076-1079 (1991).
  37. Rosa, P. A., Hogan, D. Colony formation by Borrelia burgdorferi in solid medium: clonal analysis of osp locus variants. First International Conference on Tick Borne Pathogens at the Host-Vector Interface: An Agenda for Research. , 95-103 (1992).
  38. Wagemakers, A., Oei, A., Fikrig, M. M., Miellet, W. R., Hovius, J. W. The relapsing fever spirochete Borrelia miyamotoi is cultivable in a modified Kelly-Pettenkofer medium, and is resistant to human complement. Parasites and Vectors. 7 (1), 4-9 (2014).
  39. Oliver, J. H., et al. First isolation and cultivation of Borrelia burgdorferi sensu lato from Missouri. Journal of Clinical Microbiology. 36 (1), 1-5 (1998).
  40. Greenfield, E. A. Myeloma and hybridoma cell counts and viability checks. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), 689-690 (2019).
  41. Baradaran-Dilmaghani, R., Stanek, G. In vitro susceptibility of thirty borrelia strains from various sources against eight antimicrobial chemotherapeutics. Infection. 24 (1), 60-63 (1996).
  42. Ružić-Sabljić, E., Podreka, T., Maraspin, V., Strle, F. Susceptibility of Borrelia afzelii strains to antimicrobial agents. International Journal of Antimicrobial Agents. 25 (6), 474-478 (2005).
  43. Sicklinger, M., Wienecke, R., Neubert, U. In vitro susceptibility testing of four antibiotics against Borrelia burgdorferi: A comparison of results for the three genospecies Borrelia afzelii, Borrelia garinii, and Borrelia burgdorferi sensu stricto. Journal of Clinical Microbiology. 41 (4), 1791-1793 (2003).
  44. Edmondson, D. G., Hu, B., Norris, S. J. Long-term in vitro culture of the syphilis spirochete treponema pallidum subsp. Pallidum. mBio. 9 (3), 01153(2018).
  45. Wilhelmsson, P., et al. Prevalence and diversity of Borrelia species in ticks that have bitten humans in Sweden. Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 4169-4176 (2010).
  46. Toledo, A., et al. Phylogenetic analysis of a virulent Borrelia species isolated from patients with relapsing fever. Journal of Clinical Microbiology. 48 (7), 2484-2489 (2010).
  47. Elbir, H., et al. Genome sequence of the Asiatic species Borrelia persica. Genome Announcements. 2 (1), 01127(2014).
  48. Sapi, E., et al. Improved culture conditions for the growth and detection of Borrelia from human serum. International Journal of Medical Sciences. 10 (4), 362-376 (2013).
  49. Liveris, D., et al. Quantitative detection of Borrelia burgdorferi in 2-millimeter skin samples of erythema migrans lesions: Correlation of results with clinical and laboratory findings. Journal of Clinical Microbiology. 40 (4), 1249-1253 (2002).
  50. Wormser, G. P., et al. Comparison of the yields of blood cultures using serum or plasma from patients with early Lyme disease. Journal of Clinical Microbiology. 38 (4), 1648-1650 (2000).
  51. Lagal, V., Postic, D., Ruzic-Sabljic, E., Baranton, G. Genetic diversity among Borrelia strains determined by single-strand conformation polymorphism analysis of the ospC gene and its association with invasiveness. Journal of Clinical Microbiology. 41 (11), 5059-5065 (2003).
  52. Lin, Y. P., Diuk-Wasser, M. A., Stevenson, B., Kraiczy, P. Complement evasion contributes to Lyme Borreliae-host associations. Trends in Parasitology. 36 (7), 634-645 (2020).
  53. Real-time PCR: understanding Ct. Application Note Real-time PCR. Thermo Fisher Scientific Inc. , Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/Documents/PDFs/PG1503-PJ9169-CO019879-Re-brand-Real-Time-PCR-Undertanding-Ct-Value-Americas-FHR.pdf (2016).
  54. Adams, B., Walter, K. S., Diuk-Wasser, M. A. Host specialisation, immune cross-reaction and the composition of communities of co-circulating Borrelia strains. Bulletin of Mathematical Biology. 83 (6), 66(2021).
  55. Marosevic, D., et al. First insights in the variability of Borrelia recurrentis genomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (9), 0005865(2017).
  56. Koetsveld, J., et al. Development and optimization of an in vitro cultivation protocol allows for isolation of Borrelia miyamotoi from patients with hard tick-borne relapsing fever. Clinical Microbiology and Infection. 23 (7), 480-484 (2017).
  57. Kuleshov, K. V., et al. Whole genome sequencing of Borrelia miyamotoi isolate Izh-4: Reference for a complex bacterial genome. BMC Genomics. 21 (1), 16(2020).
  58. Replogle, A. J., et al. Isolation of Borrelia miyamotoi and other Borreliae using a modified BSK medium. Scientific Reports. 11 (1), 1926(2021).
  59. Stanek, G., Reiter, M. The expanding Lyme Borrelia complex-clinical significance of genomic species. Clinical Microbiology and Infection. 17 (4), 487-493 (2011).
  60. Seifert, S. N., Khatchikian, C. E., Zhou, W., Brisson, D. Evolution and population genomics of the Lyme borreliosis pathogen, Borrelia burgdorferi. Trends in Genetics. 31 (4), 201-207 (2015).
  61. Kurokawa, C., et al. Interactions between Borrelia burgdorferi and ticks. Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 587-600 (2020).
  62. Coburn, J., et al. Lyme disease pathogenesis. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 473-518 (2021).
  63. Wolcott, K. A., Margos, G., Fingerle, V., Becker, N. S. Host association of Borrelia burgdorferi sensu lato: A review. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (5), 101766(2021).
  64. Thompson, D., Watt, J. A., Brissette, C. A. Host transcriptome response to Borrelia burgdorferi sensu lato. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (2), 101638(2021).
  65. Chaconas, G., Moriarty, T. J., Skare, J., Hyde, J. A. Live imaging. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 385-408 (2021).
  66. Kerstholt, M., Netea, M. G., Joosten, L. A. B. Borrelia burgdorferi hijacks cellular metabolism of immune cells: Consequences for host defense. Ticks and Tick-borne Diseases. 11 (3), 101386(2020).
  67. Rudenko, N., Golovchenko, M. Sexual transmission of Lyme Borreliosis? The question that calls for an answer. Tropical Medicine and Infectious Disease. 6 (2), 87(2021).
  68. Cutler, S. J., et al. Diagnosing Borreliosis. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 17 (1), 2-11 (2017).
  69. Middelveen, M. J., et al. Persistent Borrelia infection in patients with ongoing symptoms of Lyme disease. Healthcare. 6 (2), 33(2018).
  70. Bernard, Q., Grillon, A., Lenormand, C., Ehret-Sabatier, L., Boulanger, N. Skin Interface, a key player for Borrelia multiplication and persistence in Lyme Borreliosis. Trends in Parasitology. 36 (3), 304-314 (2020).
  71. Bobe, J. R., et al. Recent progress in Lyme disease and remaining challenges. Frontiers in Medicine. 8, 666554(2021).
  72. Branda, J. A., Steere, A. C. Laboratory diagnosis of lyme borreliosis. Clinical Microbiology Reviews. 34 (2), 1-45 (2021).

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