伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）复合体及回归热疏螺旋体的培养方法

摘要

体外 培养是一种直接检测活菌存在的方法。本方案描述了多种细菌的培养方法 伯氏疏螺旋体 螺旋体， 包括那些 Borrelia burgdorferi 广义复合体，回归热 伯氏疏螺旋体 物种，以及 Borrelia miyamotoi这些物种营养要求苛刻且生长缓慢，但可进行培养。

摘要

的 伯氏疏螺旋体 由三组物种组成，其中包括莱姆病（Lyme borreliosis，LB）组，也被称为 B. burgdorferi 广义（s.l.）并最近被重新分类为 Borreliella，回归热（RF）组 伯氏疏螺旋体，以及第三类与爬行动物相关的螺旋体。基于培养的方法仍然是实验室检测细菌感染的金标准，广泛应用于科研和临床工作，因为从体液或组织中培养出病原体可直接检测到正在复制的病原微生物，并为研究提供原始材料。 伯氏疏螺旋体 和 Borreliella 螺旋体 对培养条件要求苛刻且生长缓慢，因此通常不用于临床培养；然而，培养对于研究而言是必要的。本方案展示了成功培养LB和RF密螺旋体所需的方法学及培养基配方，包括所有已知物种 B. burgdorferi s.l. 复合群，包括 B. afzelii，B. americana，B. andersonii，B. bavariensis，B. bissettii/bissettiae，B. burgdorferi 狭义 (s.s.) 加州伯氏疏螺旋体、卡罗莱纳伯氏疏螺旋体、智利伯氏疏螺旋体、芬兰伯氏疏螺旋体、加里尼伯氏疏螺旋体、日本伯氏疏螺旋体、库尔滕巴赫伯氏疏螺旋体、莱氏伯氏疏螺旋体、卢西塔尼亚伯氏疏螺旋体、海洋伯氏疏螺旋体、梅氏伯氏疏螺旋体、斯皮尔曼伯氏疏螺旋体、田贯伯氏疏螺旋体、乌鸫伯氏疏螺旋体、中华伯氏疏螺旋体、瓦莱西斯伯氏疏螺旋体、扬子伯氏疏螺旋体 和射频螺旋体，B. anserina，B. coriaceae，B. crocidurae，B. duttonii，B. hermsii，B. hispanica，B. persica，B. recurrentis 和 B. miyamotoi培养LB和RF螺旋体的基本培养基是Barbour-Stoenner-Kelly（BSK-II或BSK-H）培养基，该培养基可稳定支持已建立的螺旋体培养物的生长。为了能够培养新分离的 伯氏疏螺旋体 从蜱虫或宿主来源的样本中分离螺旋体时，若接种物中螺旋体初始数量较少，首选改良凯利-佩滕科弗（MKP）培养基。该培养基 также 支持螺旋体的生长 B. miyamotoi RF螺旋体的培养成功与否在很大程度上取决于培养基成分的质量。

引言

Borrelia 是一种螺旋体细菌的属，包含三个主要进化枝：莱姆病（LB）群、回归热（RF）群，以及一个特征尚不明确且似乎仅限于爬行动物的类群。Borrelia 的分类体系正随着分子技术的发展而不断变化，这些技术使得基因组和蛋白质组的比较成为可能，这一点与其他大多数分类群的情况一致^{1,2,3,4,5,6,7}。LB 群（也称为莱姆病相关群）传统上以其特征最明确的成员 Borrelia burgdorferi sensu stricto 命名，统称为 Borrelia burgdorferi sensu lato。 本文采用目前最广泛使用的术语：LB 群、RF 群以及与爬行动物相关的类群，并描述了 LB 群和 RF 群的培养方案。

正如对该家族成员的预期一样 螺旋体科, 伯氏疏螺旋体 可呈现独特的细长螺旋....

方案

所有涉及从人类受试者获取样本的研究均经相关大学和/或医疗机构的机构审查委员会批准，并在采集样本前获得参与者的书面知情同意。所有涉及从动物获取样本的研究均经机构动物伦理委员会批准，并在其指导下进行。在适用的情况下，已获得环境采样的相关批准。

注意：培养的成功与否在很大程度上取决于试剂的质量。市面上有商业化的BSK培养基，可用于接种高剂量的实验室适应型纯种B. burgdorferi及相关物种，能有效支持其生长。但对于来自原始生物材料的菌株分离物，建议使用新鲜配制的培养基，且通常必不可少。

Borrelia 属是已知或疑似病原体，未经筛查的人体或动物组织也可能构成生物危害。处理潜在感染性材料时，为确保研究人员安全，必须使用个人防护装备并采用无菌技术。此外，由于培养基营养极为丰富，容易导致培养物污染。此类工作通常需要在生物安全二级条件下进行，所有涉及 Borrelia 属的操作或样本处理均应在生物安全柜中进行。

1. BSK-II 培养基制备说明

1. 完全BSK-II培养基的制备
   1. 获取用于配制1 L培养基的试剂，如表1所示。
      注意：BSA的纯度（或不纯程度）对螺旋体的最佳生长至关重要。特别是不....

结果

Borrelia 培养基 BSK 和 MKP 及其变体为富含营养的培养基，其成分需按顺序配制和灭菌。正确配制的 BSK 培养基应呈红橙色且澄清透明（图 1）。若培养基在加热后仍存在浑浊或沉淀，则提示原料、培养基制备过程或存在污染问题；此类培养基最好弃用。若在 BSK 或 MKP 中添加明胶，冷藏时培养基会呈凝胶状；加热后则变为液体，但略带黏稠。

纯培养的Borrelia生长不会改变培养基的浑浊度。然而，由于pH指示剂的存在，细菌培养物Borrelia以及污染物的生长均会导致培养基颜色发生变化。其他细菌过度生长会产生浑浊和团块状物质（图2）。

可通过相差显微镜或暗视野显微镜监测培养物的生长情况（图3 和 图4）。处于对数生长期的 B.......

讨论

细菌的实验室培养是科研工作的起点。培养能力所带来的巨大优势，体现在长达一个多世纪、直至近期才取得成功的Treponema pallidum培养研究中；这种螺旋体是梅毒的致病因子⁴⁴。Borrelia属螺旋体的培养同样具有挑战性，但已实现体外培养^{23,24,34,44,45,46,47,48,49}。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.7 mL 离心管	VWR	87003-294	标准物品——任何供应商均可
0.2 µm 无菌注射器滤器	VWR	28145-501	标准物品——任何供应商均可
10 µL型屏障吸头	海王星	BT10XLS3	标准物品——任何供应商均可
10 mL 血清移液管	Celltreat	229011B	标准物品——任何供应商均可
1000 µL型屏障吸头	海王星	BT1000.96	标准物品——任何供应商均可
15 mL 离心管	Celltreat	188261	标准物品——任何供应商均可
20 µL型屏障吸头	海王星	BT20	标准物品——任何供应商均可
20 mL 无菌注射器	BD	309661	标准物品——任何供应商均可
200 µL型屏障吸头	海王星	BT200	标准物品——任何供应商均可
25 mL 螺口培养管	Fisher Scientific	14-933C	标准物品——任何供应商均可
25 mL 血清移液管	Celltreat	229025B	标准物品——任何供应商均可
3 mL 无菌注射器	BD	309657	标准物品——任何供应商均可
35% BSA	Sigma	A-7409	来源很重要——参见注释
5 mL 血清学移液管	Celltreat	229006B	标准品——任意供应商均可
50 mL 离心管	Celltreat	229421	标准物品——任何供应商均可
6.5 ml MKP 玻璃管	Schott	Schott Nr. 26 135 115	标准物品——任何供应商均可
阿米卡星	Sigma	PHR1654	标准物品——任何供应商均可
两性霉素B	Sigma	A9528-100MG	标准物品——任何供应商均可
复方新诺明/甲氧苄啶/磺胺甲噁唑	Sigma	PHR1126-1G	标准物品——任何供应商均可
BBL 布氏菌肉汤	BD	211088	标准物品——任何供应商均可
生物安全柜	Labconco	302419100	标准物品——任何供应商均可
血液采集管（黄色管帽 - ACD）	Fisher Scientific	BD 含酸性枸橼酸葡萄糖（ACD）的真空采血管玻璃采血管	标准物品——任何供应商均可
BSK-H 培养基 [含 6% 兔血清]	达尔林生物制品	BB83-500	标准物品——任何供应商均可
离心机	Eppendorf	model 5430	标准物品——任何供应商均可
柠檬酸三钠二水合物	Sigma	C-8532 100 g	标准物品——任何供应商均可
CMRL	Gibco BRL	21540 500 mL	标准物品——任何供应商均可
CMRL-1066	Gibco	21-510-018	标准物品——任何供应商均可
低温冻存管（Nalgene）	Fisher Scientific	5000-0020	标准物品——任何供应商均可
带堆叠环的深型培养皿 100 mm × 25 mm	Sigma	P7741	标准物品——任何供应商均可
数字培养箱	VWR	model 1545	标准物品——任何供应商均可
DMSO	赛默飞世尔科技	D12345	标准物品——任何供应商均可
用于过滤除菌的滤器	Millipore 0.22μm GPExpressPLUS 膜	SCGPU05RE	标准物品——任何供应商均可
明胶	Difco BD	214340 500 g	标准物品——任何供应商均可
玻璃培养管	Fisher Scientific	99449-20	标准物品——任何供应商均可
葡萄糖	Sigma	G-7021 1 kg	标准物品——任何供应商均可
甘油	Sigma	G5516	标准物品——任何供应商均可
血细胞压积离心机（Hematocrit） && 免疫血液学离心机	实验室知识	Model 3220	标准物品——任何供应商均可
HEPES	Sigma	H-3784 100 g	标准物品——任何供应商均可
N-乙酰氨基葡萄糖	Sigma	A-3286 25 g	标准物品——任何供应商均可
Neopeptone	Difco  BD	211681 500 g	标准物品——任何供应商均可
血细胞计数板	Sigma	Z359629	标准物品——任何供应商均可
相差显微镜	Leitz		标准品——任意供应商均可
磷霉素	Sigma	P5396-1G	标准物品——任何供应商均可
磷霉素	Sigma	P5396	标准物品——任何供应商均可
Pipetboy	Integra		标准物品——任何供应商均可
精密标准天平	OHAUS	model TS200S	标准物品——任何供应商均可
丙酮酸（钠盐）	Sigma	P-8574 25 g	标准物品——任何供应商均可
兔血清	Gibco	16-120-032	来源很重要
兔血清	Sigma	R-4505  100 mL	来源很重要
利福平	Sigma	R3501-1G	标准物品——任何供应商均可
碳酸氢钠	Sigma	S-5761     500 g	标准物品——任何供应商均可
Sufametaxazole	Sigma	PHR1126	标准物品——任何供应商均可
TC酵母提取物	Difco  BD	255752 100 g	标准物品——任何供应商均可
移液管	VWR	470225-044	标准物品——任何供应商均可
甲氧苄啶	Sigma	PHR1056	标准物品——任何供应商均可