本方案描述了一种用于中高通量类器官药物筛选的半自动化方法，以及一种不依赖显微镜型号的自动化图像分析软件，可用于定量和可视化分析多参数的单个类器官药物反应，以捕捉肿瘤内异质性。
本文内容
摘要
摘要
患者来源的肿瘤类器官（PDTOs）在临床前和转化研究中具有广阔前景，并可用于预测患者的治疗反应 离体 药物筛选。然而，目前基于三磷酸腺苷（ATP）的药物筛选检测方法无法充分反映药物反应（如抑瘤或杀瘤效应）的复杂性以及肿瘤内异质性，这是由于其依赖整体性读数所致，而类器官（PDTOs）已被证实能够保留这些特征。活细胞成像是一种克服该局限性的有力工具，可更深入地可视化药物反应过程。然而，现有的图像分析软件通常难以适应PDTOs的三维结构，常需依赖荧光活力染料，或无法兼容384孔微孔板格式。本文介绍一种半自动化的实验方法，可在高通量384孔板体系中利用常规的宽场活细胞成像系统对PDTOs进行接种、给药和成像。此外，我们开发了一种无需外源性活力标记物的图像分析软件，用于量化基于生长速率的药物反应指标，从而提高实验重复性，并校正不同PDTOs品系间的生长速率差异。通过采用归一化的药物反应指标——该指标将药物处理组的生长速率相对于阳性与阴性对照条件进行归一化评分——并结合荧光细胞死亡染料，可清晰区分细胞毒性与细胞抑制性药物反应，显著提升对响应者与非响应者的分类准确性。此外，通过对单个类器官的药物反应进行分析，可量化药物反应的异质性，进而识别潜在的耐药克隆。最终，该方法旨在通过获取包含动力学生长抑制与细胞死亡定量在内的多参数药物反应特征谱，提升对临床治疗反应的预测能力。
引言
近年来， 体外 癌症药物发现、药物筛选和基础研究正逐步从使用永生化细胞系的传统二维（2D）癌症模型，转向更具生理相关性的三维（3D）癌症模型。这一趋势推动了利用已建立的癌细胞系构建肿瘤类球体的发展，此类模型可重建实体瘤中更复杂的细胞间相互作用和结构。目前，患者来源的肿瘤类器官（PDTOs）是现有最先进的、最具生理相关性的3D癌症模型 体外 癌症研究，因为它们相较于肿瘤类球体具有额外优势，即能够体现癌症患者中存在的异质性1PDTO 来源于癌症患者的肿瘤组织，因此保留了肿瘤的表型和基因型。正因如此，PDTO 在基础和转化癌症研究中正变得不可或缺，并有望显著推动精准肿瘤学的发展2.
尽管这些复杂的3D技术具有广阔的应用前景 体外 由于缺乏先进的分析方法，癌症模型常常未被充分利用。最常用的检测方法是测定PDTO中活细胞的数量。 通过 细胞内ATP的定量3这些检测通常是单时间点、整体性分析，因而忽略了关键的时间依赖性反应，并未关注克隆水平的响应。特别是，监测PDTOs生长情况（生长速率）及其对特定治疗反应的能力具有重要意义4,5标准化药物反应（NDR）是一种基于生长速率并相对于阳性对照（ctrl+）和阴性对照（ctrl-）条件进行归一化的药物反应评分指标，最近被报道为评估基于细胞筛选的癌症药物敏感性的关键指标，尽管该方法此前主要应用于二维细胞系。6因此，需要更复杂的分析方法，以充分利用这些更具临床代表性且更为复杂的3D癌症模型。显微镜技术被认为是研究类器官模型复杂性的有力手段。7.
本文介绍了一种利用常规宽场显微镜和活细胞成像系统，在三维癌症模型中监测药物动力学反应的方法。该方法对Driehuis等人4所描述的实验方案进行了改进，使其能够与移液机器人、数字药物分配器和活细胞成像系统联用，实现自动化操作，从而提高实验的可重复性，并减少人工操作时间。该方法可在384孔微孔板和多类器官格式中，对使用已建立的癌细胞系形成的肿瘤类球体（参见补充表S1中已测试的细胞系）以及患者来源的肿瘤类器官（PDTOs）进行中高通量药物筛选。通过采用卷积神经网络机器学习算法，仅利用明场成像即可实现对单个肿瘤类球体或PDTOs的自动识别与追踪，无需使用荧光标记的活细胞染料8。这一优势极为显著，因为传统的明场成像识别通常需要人工标注（费时且劳动强度大），或需添加荧光染料，而后者可能因光毒性诱导的氧化应激干扰药物反应结果9。
本研究团队自主研发的图像分析软件拓展了传统活细胞成像系统的功能，因为现有的3D图像分析模块要么不可用，要么受限于特定平台，或无法兼容384孔微孔板及全孔成像。此外，这些模块通常价格昂贵，且对类器官的大规模检测读数能力有限。因此，本方法对于那些可获取广泛使用的活细胞成像系统、并希望相较于基于ATP的传统“金标准”但较为初级的检测方法获得更丰富药物反应信息的科研人员具有重要意义。通过引入特异性的细胞死亡指示剂，可区分细胞抑制性药物反应与细胞毒性反应，从而进一步揭示当前单时间点分析无法获得的药物作用机制。最后，活细胞成像技术可实现对单个类器官的追踪，获取单个类器官的药物反应参数，以捕捉反应异质性，并识别潜在的耐药亚克隆。
本方法及配套图像分析软件的目标是实现类器官药物筛选的低成本自动化，以减少人为干预，并降低在操作、图像分析和数据分析过程中的变异性。为了便于研究人员使用，该软件不依赖特定显微镜或实验平台，并提供基于云的应用程序。因此，通过支持常规的活细胞成像系统，我们还旨在提升其在三维培养应用及相关分析中的功能。
方案
采用人胰腺导管腺癌（PDAC）患者来源的类器官。组织切除片段来自在安特卫普大学医院接受根治性手术的患者。所有患者均签署书面知情同意书，研究经UZA伦理委员会批准（编号：14/47/480）。本方案中使用的所有材料、试剂、设备和软件的相关详细信息见材料表。图1展示了实验流程的概览。补充材料中提供了示例数据，可用于重复本方案。
1. 第0天：制备培养2至3天的类器官
- 将微孔板在 37 °C 下预热过夜，并在 4 °C 下解冻细胞外基质（ECM）。
- 配制完整的胰腺导管腺癌类器官培养基：在 ADF+++（高级 DMEM/F12，1% 谷氨酰胺补充剂，1% HEPES，1% 青霉素/链霉素）中添加 0.5 nM WNT surrogate-Fc-Fusion 蛋白、4% Noggin-Fc 融合蛋白条件培养基、4% Rpso3-Fc 融合蛋白条件培养基、1× B27、1 mM N-乙酰半胱氨酸（NAC）、5 mM 烟酰胺、500 nM A83-01、100 ng/mL FGF10 和 10 nM 胃泌素。
- 根据所选方法建立 PDTOs。
注意：Driehuis 等人提供了一份详细方案，描述了在 ECM 半球中建立、培养和传代 PDTOs 的常规方法4。 - 通过酶解法将 ECM 半球中的类器官解离。
- 吸除培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次。加入消化酶（例如，在 6 孔板中加入 2 mL），使用 1 mL 移液器上下吹打 10 次，以机械方式解离类器官和 ECM 半球。
- 在 37 °C 下孵育 10 分钟，吹打混匀，检查类器官是否已解离为单细胞。如有必要，重复此步骤。
- 将细胞悬液收集至 15 mL 离心管中，加入 ADF+++ 至总体积 10 mL，室温下以 450 × g 离心 5 分钟，使用巴斯德移液器和抽滤泵吸除上清液。
- 根据沉淀大小，用 100–200 µL 完全培养基重悬细胞沉淀，并使用合适方法计数细胞数量。例如：取 10 µL 细胞悬液与 10 µL 台盼蓝混合，使用自动细胞计数仪进行计数。
- 将单细胞接种于 ECM 半球中。
- 稀释细胞悬液，并根据 表 1 加入 2/3 体积的 ECM。在预热的 6 孔板中，每孔加入最多十个 20 µL 液滴。将培养板倒置，在 37 °C 下孵育 30 分钟。
- 加入含 10 µM Y-27632 的完全培养基覆盖，置于培养箱中培养 2–3 天。
注意：通常，十个各含 75,000 个细胞的半球足以在 384 孔板中以每孔 200 个类器官的密度接种（不包括边缘孔）。
2. 第2-3天：收获并接种培养2至3天的类器官
- 从ECM凝胶圆顶中收集完整的类器官。
注意：类器官容易黏附在塑料表面（例如离心管、移液枪头）。为避免此问题，可预先用0.1%牛血清白蛋白（BSA）/PBS溶液冲洗塑料器皿。- 吸除培养基，并用PBS洗涤一次。根据ECM凝胶圆顶的数量，向6孔板中加入1–2 mL冷（4 °C）类器官收获溶液，置于冰上并在摇床上孵育10分钟。
- 使用1 mL移液枪反复吹打以解离ECM凝胶圆顶，继续在冰上孵育10分钟，并在显微镜下观察ECM是否已完全解离。
- 可选步骤：若希望获得更均匀的尺寸分布，可在离心前将悬液通过70 µm细胞筛过滤。
- 将类器官收集至已预先用0.1% BSA/PBS包被的15 mL离心管中，加入ADF+++培养基至总体积达10 mL，在4 °C、200 × g条件下离心5分钟。吸除上清液，根据沉淀物大小，用最多1,000 µL完全PDAC类器官培养基重悬，使类器官浓度达到>6,000个/mL。
- 采用任意合适的计数方法对类器官进行计数，推荐使用基于图像的计数方法。
- 接种类器官。
注意：有关本实验方案中使用的两种384孔微孔板每孔最低体积，请参见材料表。- 使用前将所有塑料器皿在-20 °C或冰上预冷至少20分钟，以防止ECM凝固。
- 取1 mL类器官储备液（步骤2.1.4）用完全培养基配制接种液，使每50 µL接种液体积中含约200个类器官（此为填充一个孔所需的最小体积）。使用补充文件1计算所需类器官接种液体积。当使用25 mL储液槽和多通道移液枪或移液机器人时，额外保留1,500 µL余量。
- 使用移液机器人进行类器官接种。
注意：为防止ECM凝固，接种过程中接种液和微孔板均需保持在4 °C。因此，设计并3D打印了可与移液机器人配合使用的25 mL储液槽和微孔板支架，该支架可容纳材料表中列出的冷却元件。提供用于3D打印定制实验耗材的STL文件（补充文件2和补充文件3），以及适用于移液机器人的定制耗材JSON文件（补充文件4和补充文件5）。- 使用在线Protocol Designer工具设计分配程序。提供了一个示例JSON文件（补充文件6），其中已加载定制耗材，并使用八通道p300（Gen2）移液枪及其配套枪头。
- 打开移液机器人控制应用程序，选择protocols，点击Import，将补充文件6拖放至指定区域。
- 选择已导入的程序，并按照Deck Setup区域显示的布局，将所有实验耗材（包括冷却元件和塑料器皿）放置于工作台相应位置。左侧插槽用于放置25 mL储液槽及冷却元件，如补充文件7所示。
- 点击Run Protocol和Proceed to Setup。打开Labware Setup tab，点击Run Labware Position Check，并按照提示完成移液机器人对新硬件的校准。
注意：耗材偏移数据可保存以供后续使用，但建议每次运行前均执行耗材位置检查。 - 将冷却后的类器官接种液加入置于冷却元件上方的25 mL储液槽中，然后点击Start Run。
注意：由于使用八通道移液枪，边缘的顶部和底部孔也会被类器官悬液填充。 - 在4 °C、100 × g条件下对微孔板离心1分钟。
- 在37 °C孵育至少30分钟。
- 向外围空白孔中每孔加入至少50 µL H2O，以防止蒸发。
- 在37 °C过夜孵育，以消除可能干扰图像分析的气泡。
3. 第4天：使用数字药物分配器进行药物处理和试剂分配
- 使用数字药物分配器控制软件创建药物分配方案。
- 将鼠标悬停在板布局上方的“Plate 1”处，选择编辑板属性，并填写板类型：384孔，附加体积（µL）：50和DMSO限制（%）：1。
- 单击流体旁边的+按钮以添加流体。双击新创建的流体并为其命名；选择类别（基于DMSO或含Tween 20的水相）和浓度。
注意：所有药物和试剂必须溶解于100% DMSO或0.3% Tween-20中。可使用1–10 mM的储备液，同时需确保DMSO终浓度不超过<1%。表2提供了常用荧光试剂和治疗药物所需稀释倍数的示例。 - 板布局
- 进行药物梯度稀释时，选择孔位并单击梯度稀释。在流体中选择目标药物，设定最高浓度（例如2,000 nM）和最低浓度（例如10 nM）；在重复次数中选择至少2次重复，并选择所需的梯度稀释模式。
注意：梯度稀释模式取决于多种因素，包括单块板上需容纳的化合物数量、是否需要随机化孔位，以及重复数和对照的数量。 - 对于阳性对照，选择三个孔，单击设定值，输入DMSO中10 mM储备液稀释得到的2 µM星形孢菌素，以诱导最大细胞死亡。
- 对于Cytotox Green，选择所有已使用的孔，单击设定值，输入每孔60 nM。
注意：Cytotox Green荧光染色可标记已死亡的细胞，因此不会干扰药物反应的监测。此处无需使用活细胞荧光标记物。 - 对于阴性对照和DMSO归一化，选择所有含药物的孔，并额外选择四个溶剂对照孔，右键单击，选择归一化，选择归一化流体类别：基于DMSO，并将所有孔归一化至最大类别体积，以确保每孔DMSO浓度相等。
注意：DMSO终浓度应低于<1%。本文提供了一个TDD药物梯度稀释文件示例（补充文件8）。 - 单击左上角运行下方的箭头，选择始终模拟，然后单击模拟以检查错误并获取每种药物所需配制的体积。
注意：当初始分配体积过低而出现警告“建议每个板上每种流体的分配体积不低于30 nL”时，可在边缘选择两个装有水的孔，单击设定值，为触发警告的药物输入10 µM。此操作可使药物 cartridge 预充满高于30 nL的体积。同样的孔也可用于DMSO cartridge的预充满，方法是设置一个归一化至总体积百分比的值（例如0.5%）。
- 进行药物梯度稀释时，选择孔位并单击梯度稀释。在流体中选择目标药物，设定最高浓度（例如2,000 nM）和最低浓度（例如10 nM）；在重复次数中选择至少2次重复，并选择所需的梯度稀释模式。
- 取消勾选运行按钮下方的始终模拟；单击运行以启动药物分配程序，并按照提示操作。
- 在微孔板上覆盖密封膜，防止蒸发。
- 将Cytotox Green染料在37 °C培养箱中孵育1–2小时，随后进入步骤4。
4. 使用活细胞成像仪采集图像
注意：对于生长速率和NDR，必须在添加Cytotox Green后1-2小时获取时间点0（T0 = 开始处理）的扫描图像。
- 打开活细胞成像仪控制软件，选择 方法编辑 新，前往 文件 > 导入，并选择 示例方法 XML 文件 (补充文件 9）。或者，创建一个新文件并选择 培养板：（CORE384fb_OpticalImaging）— Corning 384 孔黑色平底板（Corning #4588），无盖，无加湿盒；应用类型：仅成像；物镜：4倍；扫描模式：中心点；检测通道：明场和绿色荧光（LED 光强 (%) = 40；曝光时间 (ms) = 200）
注意：60 nM Cytotox Green 浓度下，绿色通道设置效果良好。 实时查看器 该选项可用于实时调整焦距偏移和/或LED设置。 - 点击 开始 在 T0 开始扫描。
- 每24小时重复扫描一次，持续最多5天，使用相同方法。或者，若要自动运行延时成像测量，可在活细胞成像仪控制软件中通过点击并拖动将方法调整为动力学实验 动力学循环 切换到 方法 领域。同样地， 温度 和 气体 标签必须被拖入 方法 将系统设定为 37 °C 5% CO₂2 以确保活细胞成像仪在实验期间处于正确的环境条件下。
5. 图像与数据分析
- 数据合并与压缩
- 活细胞成像仪控制软件会在每个时间点生成一个扫描文件夹。创建一个新文件夹，将各个实验文件夹复制到该父文件夹中，并在相应实验文件夹名称后添加 _0h、_24h、_48h、_72h、_96h 和 _120h。
- 通过右键单击药物分配协议中的 plate map 布局，从数字药物分配器控制软件中导出XLSX格式的孔板图，并复制所有孔位信息；将数据粘贴至一个XLSX文件中。删除Cytotox Green和staurosporine相关数据，并添加细胞系和重复实验的矩阵。输入 ctrl- 和 ctrl+。示例孔板图见 补充文件10。
- 打开 数据压缩工具，点击 浏览，选择 父文件夹，然后点击 运行 以启动图像数据压缩。所有不同时间点的TIFF图像文件将被压缩为每个孔位一个HDF5文件，并存储在父文件夹内新建的datasets文件夹中。
- 图像分析
- 进入图像分析网络应用程序平台，登录后点击 首页 选项卡中的 添加新项目。输入 项目名称，点击 继续，选择 添加新实验，并上传包含HDF5文件的数据集文件夹。
- 上传完成后，进入 项目 和 实验文件夹，点击 上传孔板图 以启用附加功能。点击 运行分析，选择 多类器官分析 和 默认参数，然后点击 分析 以启动图像分析。
- 点击 下载结果 下载原始数据表，其中包含每个孔位的测量值（例如总明场面积、总绿色荧光面积等），以及分割后的图像/视频，用于验证分析准确性并进行后续数据处理。
- 基于生长速率的药物反应指标与归一化药物反应
- 从 结果 文件夹中选择 Raw_NDR.xlsx 文件（需提供孔板图）（补充文件11），并将其载入 Official_NDR_7point R脚本（补充文件12），以自动生成GR（相对于ctrl-归一化）和NDR（相对于ctrl-和ctrl+归一化）值表格（补充文件13、补充文件14、补充文件15 和 补充文件16）。GR和NDR值由R脚本（补充文件12）根据公式（1）所示参数计算得出。
总存活面积 = 总明场面积 - 总绿色面积 （1）
其中 0 < NDR < 1 表示细胞静止效应（生长停滞），NDR < 0 表示细胞毒性反应（细胞死亡）。
注：该R脚本改编自Gupta等人的研究6。 - 从 clonal_data.xlsx 表格中提取单个类器官的反应数据，并以气泡图形式绘制。
- 使用Z因子10评估一次药物筛选实验的质量（见公式（2））。若Z因子 < 0.5，则应舍弃该实验。
（2）
- 从 结果 文件夹中选择 Raw_NDR.xlsx 文件（需提供孔板图）（补充文件11），并将其载入 Official_NDR_7point R脚本（补充文件12），以自动生成GR（相对于ctrl-归一化）和NDR（相对于ctrl-和ctrl+归一化）值表格（补充文件13、补充文件14、补充文件15 和 补充文件16）。GR和NDR值由R脚本（补充文件12）根据公式（1）所示参数计算得出。
结果
自动化移液程序可确保PDAC_060 PDTO在384孔微孔板所有列中的均匀分布（图2A）。如预期所示，各孔之间的PDTO数量和平均面积存在差异（图2A，B）。总存活面积（总明场面积减去总绿色荧光面积）结合了无标记类器官分割与基于荧光的细胞死亡信号，在我们的经验中，这是研究随时间变化的药物反应最可靠的参数（图2C）8。为了校正细胞接种量和类器官大小的差异，应采用基于生长速率的指标以减少重复样本间的变异，这一点从图2D相较于图2C误差条减小以及Z因子更高（表明药物筛选质量显著提高）中可见（图2E）。
以 ctrl- 和 ctrl+ 为归一化对照的 NDR 剂量-反应曲线（图 2G）明显优于以 ctrl- 为归一化对照的 GR 剂量-反应曲线（图 2F），因其增强了药物反应曲线之间的分离度，并能更准确地反映细胞毒药物反应。ctrl-、ctrl+ 以及经 400 nM 吉西他滨/80 nM 紫杉醇处理的 PDTO 相应图像示例见于 图 3。一个有趣的观察结果是，在联合治疗中，吉西他滨的细胞毒性效应占主导地位，未观察到紫杉醇的额外增效作用。
接下来，使用了另外两个PDTO细胞系PDAC_052和PDAC_087。观察到这两个细胞系之间的生长速率存在明显差异（图4A），这支持了使用GR指标的合理性。同样，与GR曲线（图4B）相比，NDR剂量-反应曲线（图4C）在三位不同患者之间表现出更宽的动态范围和更清晰的区分度。此外，该方案允许随时间测定NDR，结果显示PDAC_052和PDAC_060对低剂量吉西他滨-白蛋白（gem-pac）表现出非常相似的细胞静止性药物反应（图4D），而在中剂量（图4E）和高剂量（图4F）吉西他滨-白蛋白（gem-pac）处理下，则可观察到明显的细胞静止性与细胞毒性反应差异。这些药物反应结果与患者临床观察到的治疗反应一致（图4G）。
最后，该方法和软件的一个主要优势在于能够量化单个类器官对药物的反应，从而研究反应异质性并识别潜在的耐药亚克隆。图5 清晰地展示了不同患者的克隆动态，显示PDAC-087在治疗后具有最多的耐药亚克隆，这与该患者体内观察到的侵袭性强且高度耐药的疾病特征一致。有趣的是，该患者对ctrl+staurosporin的敏感性也是所有患者中最低的。
图 1：工作流程概览。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：接种准确性与药物反应指标。（A）使用移液机器人将PDAC_060患者来源的肿瘤类器官（PDTO）接种至384孔微孔板后的每孔类器官数量。每个点代表单个孔中的计数，各图按384孔微孔板的列分开显示。（B）每孔PDTO的平均面积。（C）总存活面积（总明场面积减去总绿色荧光面积）以及（D）PDAC_060 PDTO在吉西他滨/紫杉醇5:1比例处理下的生长速率（以T0时刻为1进行归一化的总存活面积）。（E）用于评估检测质量的Z因子指标。（F）相对于对照组归一化的生长速率-剂量反应曲线，以及（G）相对于阴性对照和阳性对照归一化的药物反应曲线。误差棒表示两个孔的均值±标准差。缩写：PDAC = 胰腺导管腺癌；PDTO = 患者来源的肿瘤类器官；GR = 生长速率；NDR = 归一化药物反应。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 3：示例图像。 PDAC_060 患者来源的肿瘤类器官（PDTO）经溶剂对照（ctrl-）、400 nM 吉西他滨/80 nM 紫杉醇（GemPac）以及 2 µM 星形孢菌素（ctrl+）处理后的代表性图像。左列为明场图像，中列为 Cytotox Green 荧光信号图像，右列为使用类器官分析模块生成的无标记注释明场图像。比例尺 = 100 µm。缩写：PDAC = 胰腺导管腺癌；PDTO = 患者来源的肿瘤类器官；GemPac = 吉西他滨/紫杉醇。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：比较不同患者对药物的反应。 （A）PDAC_052、PDAC_060 和 PDAC_087 患者来源肿瘤类器官（PDTO）系的生长速率（基于总存活面积）比较。（B）以对照组（ctrl-）归一化的生长速率-剂量反应曲线，以及（C）以对照组（ctrl-）和阳性对照组（ctrl+）归一化的药物反应曲线。（D）低剂量、（E）中剂量和（F）高剂量吉西他滨/紫杉醇（5:1 比例）的归一化药物反应（NDR）动力学曲线。（G）胰腺导管腺癌（PDAC）患者的临床特征。误差条表示两个复孔的均值 ± 标准差（SD）。缩写：PDAC = 胰腺导管腺癌；PDTO = 患者来源肿瘤类器官；GR = 生长速率；NDR = 归一化药物反应；FFX = FOLFIRINOX。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：单个类器官的量化指标。 基于细胞死亡率（绿色区域/明场面积）和面积（明场）的单个类器官剂量反应结果，检测了PDAC_052、PDAC_060 和 PDAC_087 患者来源的肿瘤类器官（PDTO）在溶剂对照（ctrl-）、400 nM 吉西他滨/80 nM 紫杉醇（GemPac）以及 2 µM 星形孢菌素（ctrl+）处理下的表现。绿色区域表示存活的类器官；蓝色区域表示 GemPac 和 ctrl+ 曲线的 x 轴范围。缩写：PDAC = 胰腺导管腺癌；PDTO = 患者来源肿瘤类器官；GemPac = 吉西他滨/紫杉醇。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 细胞悬液原液 | 每滴细胞数 | 滴数（20 µL/滴） | 原液（1/3） | ECM（2/3） |
| 1.13 × 107 cells/mL | 75,000 | 10 | 75 uL | 150 µL |
| 1.13 × 107 cells/mL | 75,000 | 5 | 40 uL | 80 µL |
表1：ECM半球中铺板的稀释比例。 缩写：ECM = 细胞外基质。
| 化合物 | 储存浓度 | 稀释倍数 | 工作浓度 | 溶剂 | 孔内浓度 | 备注 |
| Cytotox Green | 1 mM (DMSO) | 1/10 | 10 µM | DMSO | 60 nM | 细胞死亡标志物 |
| Cytotox Red | 1 mM (DMSO) | 1/10 | 10 µM | DMSO | 250 nM | 细胞死亡标志物 |
| Caspase 3/7 Green | 5 mM (DMSO) | 1/2 | 2.5 mM | DMSO | 2.5 µM | 凋亡标志物 |
| Hoechst | 20 mM (H2O) | 1/200 | 100 µM | 0.33% Tween/PBS | 50 nM | 细胞核标志物 |
| Staurosporin | 10 mM (DMSO) | / | 1 - 10 mM | / | 2 – 5 µM | 阳性对照 |
| Gemcitabine | 10 mM (DMSO) | / | 1 - 10 mM | / | 滴定 | 化疗药物 |
| Paclitaxel | 10 mM (DMSO) | / | 1 - 10 mM | / | 滴定 | 化疗药物 |
| Cisplatin | 5 mM (0.9% NaCl) | 1/2 | 2.5 mM | 0.6% Tween/PBS | 滴定 | 化疗药物 |
表2：常用药物和荧光试剂的稀释示例。每种化合物需溶于100% DMSO或0.3% Tween/PBS中。
补充表 S1：兼容的癌细胞系概述。 静态：类球体不具迁移性。融合：类球体相互迁移并融合在一起。请点击此处下载该文件。
补充文件1：类器官接种溶液计算工具。 请点击此处下载该文件。
补充文件 2：用于 3D 打印定制实验器具“微孔板支架”的 STL 文件。 请点击此处下载该文件。
补充文件3：用于3D打印定制实验器具“2 x 25 mL储液槽支架”的STL文件。 请点击此处下载该文件。
补充文件4：用于定制化实验室移液机器人的“微孔板支架”JSON文件。 请点击此处下载该文件。
补充文件 5：用于定制实验室耗材移液机器人的 JSON 文件“2 x 25 mL 储液槽支架_带冷却器”。 请点击此处下载该文件。
补充文件6：移液机器人程序“Plating_PDO_384well_Cooled_Row2-23”的JSON文件。 请点击此处下载该文件。
补充文件 7：移液机器人工作台设置概览。 （A）冷却元件和（B）储液槽与微孔板。请点击此处下载该文件。
补充文件8：数字药物分配器操作协议的TDD文件。 请点击此处下载该文件。
补充文件9：用于明场和荧光成像活细胞成像仪实验方案的XML文件。 请点击此处下载该文件。
补充文件10：示例孔板图。 请点击此处下载该文件。
补充文件11：NDR R脚本的示例输入文件。 缩写：NDR = 标准化药物反应。请点击此处下载该文件。
补充文件12：标准化药物反应NDR R脚本。 缩写：NDR = 标准化药物反应。 请点击此处下载该文件。
补充文件13：NDR R脚本GR值的示例输出文件。 缩写：GR = 生长速率；NDR = 归一化药物反应。请点击此处下载该文件。
补充文件14：转置GR值后的NDR R脚本示例输出文件。 缩写：GR = 生长速率；NDR = 标准化药物反应。请点击此处下载该文件。
补充文件15：NDR R脚本NDR值的示例输出文件。 缩写：NDR = 标准化药物反应。请点击此处下载该文件。
补充文件16：NDR R脚本的示例输出文件，其中NDR值已转置。 缩写：NDR = 标准化药物反应。 请点击此处下载该文件。
讨论
中高通量的PDTO药物筛选通常依赖于仅能提取类器官潜在信息中一小部分的检测读数。人们越来越清楚地认识到，为了使快速发展的类器官技术实现更大的科学和临床潜力，迫切需要更先进的3D检测方法、读数系统和分析手段。本文介绍了一种先进的筛选流程，该流程不仅提高了实验的可重复性，还通过引入由人工智能驱动的活细胞成像读数，显著增强了临床转化能力。除了使用自主研发的分析软件外，本研究还采用了标准化药物反应度量指标（NDR），明确展示了其在定义患者间治疗反应差异方面的有效性6。
引入该归一化指标无疑具有重大价值，因为许多研究旨在根据曲线下面积（AUC）或半数最大抑制浓度（IC50）的微小差异来界定治疗反应（大多数剂量-反应曲线相互重叠或位置相近）11,12。生长速率指标已应用于基于ATP检测的类器官药物筛选方案中，但其依赖于在0时间点裂解的参考孔进行归一化4。相比之下，本方法实现了孔内生长速率的归一化，不仅能够校正不同患者来源的PDTO在生长速率上的个体间差异，还能校正因接种密度不同以及微孔板位置相关效应导致的孔间差异，从而提高实验的可重复性。此外，我们对NDR进行了改进，通过引入阳性对照用于归一化，进一步增强了不同患者来源PDTO反应之间的区分度6,8。
此外，该分析方法可兼容高通量和自动化操作模式，能够准确检测单个类器官的反应，从而实现对亚克隆耐药性的定量分析——亚克隆耐药性是肿瘤复发和进展的主要驱动因素。13例如，尽管PDAC052和PDAC060对治疗表现出良好的反应 体外 （基于NDR），额外的单个类器官分析能够检测到一小部分（在PDAC060中较大的群体）不响应治疗的亚克隆。有趣的是，这与临床观察结果高度一致，因为PDAC052和PDAC060最初表现出持久应答（未检测到肿瘤活性），但最终均被诊断为局部肿瘤进展（由耐药克隆的存在所致）。与传统的3D检测方法（基于ATP的检测以及大小/数量）相比，这一先进的筛选流程有望通过从这些“实验室中的患者”模型中提取更多具有临床相关性的信息，从而提高预测性能。该假设目前正在作者实验室中通过使用该方法对临床PDTO样本进行筛选，以验证其与临床结果的相关性。 离体 与 体内 反应与临床结局
为了更深入地了解药物反应的机制，除了细胞毒性染料外，传统的荧光活细胞成像试剂也可与本方法兼容，用于研究细胞死亡机制。我们此前已证明该方法与Sartorius Caspase 3/7 Green Reagent兼容，可用于研究顺铂处理后caspase依赖性的细胞凋亡诱导过程8。该方法与其他染料（如用于研究氧化应激的CellROX试剂或用于研究缺氧的Image-iT Hypoxia试剂）的兼容性仍有待验证。然而，这些试剂已在三维体外（in vitro）模型中成功应用14,15。
如果能够获取类器官清晰且聚焦的图像，则该图像分析软件也可兼容其他培养板格式或培养方法（例如微腔培养板、ECM半球形凝胶培养法）。对于在半球形凝胶中培养的类器官而言，这一要求往往较难实现，因为它们在不同的z轴平面上生长，需要显微镜具备z轴层扫功能，而该功能并非总是具备。因此，我们建议使用平底超低吸附384孔微孔板，以确保获得足够质量的图像。
此外，该分析方法可与其他活细胞成像系统兼容，此前已证实其可用于 IncuCyte ZOOM 系统采集的相差图像8。本研究中所使用的 Spark Cyto 活细胞成像系统的一个局限性在于其仅支持单块微孔板进行动力学检测。然而，通过 Spark Motion 扩展模块，系统容量可增至最多同时检测 40 块微孔板，实现高通量筛选。本课题组自主研发的软件兼容性将进一步拓展至此类及其他系统，旨在提供一种跨平台的通用解决方案，以实现图像与数据分析流程的标准化和自动化。该基于网络的应用程序还将包含交互式绘图工具和自动药物参数计算功能（如本文所示），以减少人工分析所需时间。
无标记PDTO分割算法在多种内部培养的具有显著形态学差异（实心、半实心、囊状）的类球体和PDTO模型上进行训练和测试，因此能够高精度地识别这些结构8该模型的一个局限性在于，囊性PDTO的加入增加了接种后孔中气泡的非预期检出。然而，过夜培养足以去除大部分气泡，从而实现时间点0的定性扫描。类器官图像分割的准确性及该方法本身需要由其他用户进行验证，并根据反馈进一步训练软件，以获得稳定且自动化的图像分析算法。此外，我们计划获取更多临床数据以进行相关性分析 离体 通过该方法量化药物反应，并与患者临床反应进行比较，以确定预测治疗反应的最佳参数，进一步推动该方法在功能性精准肿瘤医学中的应用16.
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究的部分经费来自不同捐赠方的捐助，包括 Dedert Schilde vzw 和 Willy Floren 先生。本工作还部分得到了佛兰德研究基金会的资助，项目编号为 12S9221N（A.L.）、G044420N（S.V.、A.L.、E.G）、1S27021N（M.L），以及安特卫普大学工业研究基金的资助，项目编号为 PS ID 45151（S.V.、A.L.、C.D.）。图 1 使用 BioRender.com 制作。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 6孔板 | Greiner | 657160 | |
| 8通道p300（GEN 2）移液器 | Opentrons | ||
| 300 µL吸头 | Opentrons | ||
| 384孔平底ULA微孔板 | Corning | 4588 | 最小体积50 µL |
| 384孔平底ULA Phenoplate | Perkin Elmer | 6057802 | 最小体积75 µL |
| A8301 | Tocris Bioscience | 2939 | |
| ADF+++ | 高级DMEM/F12，1% GlutaMAX，1% HEPES，1%青霉素/链霉素 | ||
| 高级DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 12634 | |
| B27 | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
| Breathe easy密封膜 | Sigma-Aldrich | Z380059 | |
| Caspase 3/7 Green | Sartorius | 4440 | |
| TC10/TC20细胞计数载片 | Bio-Rad Laboratories | 1450017 | |
| CellTiter-Glo 3D | Promega | G9681 | ATP检测 |
| 25 mL储液槽冷却器 | VWR (Diversified Biotech) | 490006-908 | |
| 12 x 8 x 3 cm冷却元件 | Bol.com | 9200000107744702 | 用于OT-2定制微孔板支架 |
| Cultrex类器官收获溶液 | R&D systems | 3700-100-01 | |
| Cultrex PathClear低生长因子BME，2型 | R&D systems | 3533-010-02 | 细胞外基质（ECM） |
| Cytotox Green | Sartorius | 4633 | |
| Cytotox Red | Sartorius | 4632 | |
| D300e | Tecan | 数字药物分配仪 | |
| D300e Control v3.3.5 | Tecan | D300e控制软件 | |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| 完全培养基 | ADF+++补充0.5 nM WNT surrogate-Fc-融合蛋白、4% Noggin-Fc融合蛋白条件培养基、4% Rpso3-Fc融合蛋白条件培养基、1x B27、1 mM N-乙酰半胱氨酸（NAC）、5 mM烟酰胺、500 nM A83-01、100 ng/mL FGF10和10 nM胃泌素 | ||
| 胃泌素 | Sigma-Aldrich | G9145 | |
| 吉西他滨 | Selleck Chemicals | S1714 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 35050 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
| Hoechst 33342溶液（20 mM） | ThermoFisher Scientific | 62259 | |
| 人胰腺导管腺癌（PDAC）患者来源类器官 | Biobank@uza（比利时安特卫普；ID：BE71030031000；由国家癌症计划资助的比利时虚拟肿瘤库） | ||
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | A9165-25G | |
| 烟酰胺 | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
| Noggin-Fc融合蛋白条件培养基 | Immunoprecise | N002 | |
| Opentrons App v6.0.1 | Opentrons | OT-2控制软件 | |
| Opentrons实验方案设计工具 | Opentrons | https://designer.opentrons.com/ | |
| Orbits数据压缩工具 | www.orbits-oncology.com 或联系通讯作者 | ||
| Orbits图像分析网络应用 | 安特卫普大学 | www.orbits-oncology.com 或联系通讯作者 | |
| OT-2 | Opentrons | 移液机器人 | |
| 紫杉醇 | Selleck Chemicals | S1150 | |
| 巴斯德吸管 230 mm | Novolab | A33696 | |
| 青霉素-链霉素 | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| Rspo3-Fc融合蛋白条件培养基 | Immunoprecise | N003 | |
| Spark Cyto 600 | Tecan | 活细胞成像及多功能酶标仪 | |
| SparkControl v3.1 | Tecan | Spark Cyto控制软件 | |
| 星形孢菌素 | Tocris Bioscience | 1285 | |
| 无菌25 mL储液槽 | VWR (Diversified Biotech) | 10141-922 | |
| T8 plus盒 | Tecan | ||
| TC20 | Bio-Rad Laboratories | 自动细胞计数仪 | |
| TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12604-021 | 解离酶 |
| 吐温-20 | Acros Organics | 233360010 | |
| WNT Surrogate-Fc-融合蛋白 | Immunoprecise | N001 | |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 |
参考文献
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