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方法文章

从小鼠子宫建立三维子宫内膜类器官

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DOI：

10.3791/64448

⸱

2023年1月6日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology & Immunology, Baylor College of Medicine, 2Center for Drug Discovery, Baylor College of Medicine, 3Departments of Molecular Virology and Microbiology and Medicine, Baylor College of Medicine

本文内容

摘要

本方案描述了建立小鼠子宫内膜上皮类器官以进行基因表达和组织学分析的方法。

摘要

子宫内膜组织衬于子宫内腔，受雌激素和孕激素的周期性调控。该组织由腔上皮和腺上皮、间质区室、血管网络以及复杂的免疫细胞群体组成。小鼠模型已成为研究子宫内膜的有力工具，揭示了调控胚胎着床、胎盘形成及癌症发生的关键机制。近年来发展的三维子宫内膜类器官培养技术，为解析子宫内膜生物学背后的信号通路提供了前沿模型。利用基因工程小鼠模型建立子宫内膜类器官，分析其转录组，并在单细胞分辨率下观察其形态，是研究子宫内膜疾病的重要手段。本文概述了从小鼠建立子宫内膜上皮三维培养的方法，并描述了定量基因表达及分析类器官组织学的技术。目标是提供一种可用于建立、培养并研究子宫内膜上皮类器官基因表达与形态特征的资源。

引言

子宫内膜——子宫腔内层的黏膜组织——是一种独特且高度动态的组织，在女性生殖健康中发挥着关键作用。在生殖生命周期中，子宫内膜可在卵巢激素雌激素和孕激素的协同调控下，经历数百次的增殖、分化与脱落循环。通过对基因工程小鼠的研究，科学家揭示了子宫内膜对激素反应的基本生物学机制，以及胚胎着床、基质细胞蜕膜化和妊娠过程的调控机制1. 体外 然而，由于在传统二维细胞培养中难以维持未转化的原代小鼠子宫内膜组织，相关研究一直受到限制2,3近年来，子宫内膜组织以三维类器官（organoid）形式进行培养的技术取得了新进展，为研究调控子宫内膜细胞再生与分化的生物学通路提供了全新机遇。目前已利用包埋于不同基质中的纯子宫内膜上皮细胞，建立了小鼠和人类的子宫内膜类器官体系。4,5，而人类子宫内膜已被培养成无支架的上皮/间质共培养体系6,7，以及最近开发的胶原包封上皮/间质类组装体8上皮类器官培养物的生长与再生潜能依赖于一组经经验确定的生长因子和小分子抑制剂的特定组合，该组合可最大程度地促进类器官的生长与再生4,5,9此外，子宫内膜类器官的冻存与复苏能力使得小鼠和人类的子宫内膜类器官可长期保存，以供未来研究使用。

基因工程小鼠揭示了调控早期妊娠和蜕膜化的复杂信号通路，并已被用作妊娠丢失、子宫内膜癌和子宫内膜异位症的研究模型。这些遗传学研究主要通过在雌性生殖组织中特异性表达的Cre重组酶，实现对loxP位点侧翼等位基因（"floxed"）进行细胞特异性敲除而完成。这类小鼠模型包括广泛使用的孕酮受体-cre10，其在子宫内膜上皮和间质组织中具有强效的重组酶活性；乳铁蛋白i-cre，可在成年小鼠中诱导子宫内膜上皮的基因重组11；以及Wnt7a-cre，可在苗勒氏管来源的组织中触发上皮特异性基因删除12。将基因工程小鼠模型的子宫内膜组织以三维类器官形式进行培养，为研究子宫内膜生物学特性提供了极佳平台，并有助于鉴定调控子宫内膜细胞更新与分化的生长因子及信号通路13,14。已有文献描述了小鼠子宫内膜组织的分离与培养方法，报道了采用多种酶解策略分离子宫上皮组织，进而用于培养子宫内膜上皮类器官4。尽管既往研究为子宫内膜上皮类器官的培养提供了重要的技术框架4,5,6，本文则提供了一种清晰、全面的方法，用于此类类器官的建立、维持、处理与分析。标准化这些技术对于推动女性生殖生物学领域的进步至关重要。本文报道了一种详细的实验方法，通过酶解与机械法联合纯化小鼠子宫内膜上皮组织，继而在凝胶基质支架中培养子宫内膜类器官。同时，我们还描述了对凝胶基质包埋的小鼠子宫内膜上皮类器官进行下游组织学与分子分析的技术方法。

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方案

小鼠操作和实验研究均依照贝勒医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的方案，并遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物照护与使用指南》所制定的规范进行。

1. 使用酶法和机械法从小鼠中分离子宫上皮组织

注意：本节描述了利用凝胶基质支架建立、传代、冻存和复苏小鼠子宫内膜上皮类器官所需的步骤。既往研究表明，从小鼠动情期阶段获取的组织建立的小鼠子宫内膜类器官培养效果最佳4，动情期可通过阴道涂片的细胞学检查确定15。所有实验均使用成年雌性野生型小鼠（6–8 周龄，C57BL/6J 与 129S5/SvEvBrd 杂交品系）。小鼠依据 IACUC 批准的操作指南，经异氟烷麻醉后行颈椎脱位法人道处死。小鼠处死后，应按照以下步骤进行操作。有关本实验方案所用材料和溶液的详细信息，请参见材料表。

  1. 将凝胶基质置于冰上解冻约1-2小时后再使用。
  2. 解剖小鼠时，使用剪刀在腹部中线处做一纵向切口，轻轻掀开皮肤以暴露下方的腹膜层。用镊子提起腹膜层，并用剪刀做横向切口以暴露腹腔内容物。
    1. 轻轻拨开腹部脂肪垫以定位子宫角。从宫颈连接处夹住子宫角，用剪刀沿肠系膜脂肪进行剪切分离。在完成小鼠子宫的解剖后，使用小剪刀彻底清除子宫角上的脂肪组织。
      注意：细胞分离过程中需保持无菌，使用前对所有手术器械进行灭菌，用70%乙醇喷洒小鼠腹部，并在无菌细胞培养罩内进行解剖后的所有操作步骤。
  3. 将每侧子宫角切成若干小段，每段长约4-5 mm。
  4. 将来自一个子宫的所有子宫组织碎片放入含有0.5 mL 1%胰蛋白酶的24孔板的一个孔中。让酶溶液进入子宫腔，以实现子宫内膜上皮与下方间质的酶解分离。
  5. 将24孔板置于37 ˚C湿润的组织培养孵育箱中孵育约1小时。
  6. 孵育1小时后，将子宫组织碎片转移至含有1 mL杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）的35 mm组织培养皿中。
  7. 在解剖显微镜下，使用精细镊子和1 mL移液枪通过机械方法将子宫上皮从子宫管中分离。用镊子夹住一段子宫组织的一端，将移液枪头沿组织纵轴轻轻滑动，从子宫管的另一端挤出上皮。在解剖显微镜下观察从子宫组织中分离出的上皮片层。
  8. 使用1 mL移液器收集上皮细胞片，并轻柔地转移至1.5 mL离心管中。
  9. 对剩余的子宫组织片段重复上述步骤，将所有上皮细胞片转移至同一收集管中。
  10. 通过离心以375 × g的离心力在5分钟内沉淀解离的上皮细胞片 g.
  11. 小心吸去上清液，避免扰动细胞沉淀。
  12. 将细胞沉淀重悬于0.5 mL含2.5 mg/mL胶原酶和2 mg/mL DNase的溶液中，上下吹打约10次，或直至获得单细胞悬液。
  13. 加入0.5 mL DMEM/F12 + 10% 胎牛血清（FBS）+ 抗生素，375 × g离心5分钟 g.
    ​注意：有关细胞培养中使用的广谱抗生素的更多信息，请参见 材料表.
  14. 小心吸除上清液，将细胞重悬于 1 mL DMEM/F12 + 10% FBS + 抗生素中。在 375 × g 条件下离心 5 分钟。 g.

2. 间质组分的处理

注意：本部分概述了分离小鼠子宫内膜基质区室所需的实验方案。鉴于上皮/基质共培养实验日益受到关注，除能够生成类器官的上皮细胞外，对基质细胞群体进行处理也至关重要。

  1. 当所有上皮组织已通过酶解和机械方法从子宫碎片中分离后，剩余的管状结构即为"间质/子宫肌层"组分。将此组织收集至含有2.5 mg/mL胶原酶和2 mg/mL DNase的HBSS溶液中。
  2. 将间质/子宫肌层样本置于37 ˚C摇床中孵育15分钟。
  3. 孵育结束后，每只小鼠加入500 µL DMEM/F12 + 10% FBS + 抗生素，并通过40 µm细胞滤网过滤未解离的组织碎片。
  4. 以375 × g 离心5分钟，沉淀细胞。
  5. 小心吸除上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL DMEM/F12 + 10% FBS + 抗生素中，然后逐滴加入含10 mL DMEM/F12 + 10% FBS + 抗生素的10 cm细胞培养皿中。将培养皿置于37 ˚C、湿润的细胞培养箱中孵育。
  6. 为建立小鼠子宫内膜上皮细胞与间质细胞的共培养体系，可参照人子宫内膜类器官所描述的方法，采用无支架或胶原基质系统6,8。
    ​注意：尽管这些技术尚未在小鼠中正式发表，但可根据已发表的人子宫内膜方案进行适当调整。

3. 将子宫上皮包埋于凝胶基质中以建立类器官

注意：在准备使用前，应将凝胶基质保持在冰上。

  1. 移去上清液，将细胞沉淀重悬于体积为细胞沉淀20倍的凝胶基质中（例如，若细胞沉淀为20 µL，则加入400 µL凝胶基质重悬细胞）。轻轻重悬沉淀，避免产生气泡。
  2. 让凝胶基质/细胞悬液在室温下静置约10分钟。
  3. 当凝胶基质/细胞悬液变为半固体凝胶后，使用带有宽口200 µL吸头的P200微量移液器轻柔吸取25 µL凝胶基质/细胞悬液。在12孔板的每个孔中分别加入三个25 µL的液滴，置于37 ˚C、湿润的组织培养孵箱中孵育15分钟，使凝胶基质充分固化。
  4. 凝胶基质固化后，向每孔含有凝胶基质半球的孔中加入750 µL类器官培养基。在37 ˚C、湿润的组织培养孵育箱中孵育。
    ​注意：类器官培养基配方见文末 材料表类器官通常在初始培养后4天内形成。

4. 雌二醇处理后子宫内膜类器官的基因表达分析

注意：本节描述了使用实时定量聚合酶链式反应（qPCR）对经雌二醇（E2；见表1）处理后的子宫内膜上皮类器官进行基因表达谱分析的方法。由于子宫内膜受卵巢激素E2的周期性调控，检测类器官对E2的反应性是评估其生理功能的重要指标。我们已从子宫内膜上皮类器官中获得了高质量的RNA，并制备了足量的mRNA，可用于qPCR和/或RNA测序进行基因表达谱分析。本节介绍如何收集类器官并对其进行处理，以用于后续的基因表达分析。所选的处理培养基反映了用于培养子宫内膜细胞的常用培养基。然而，应注意的是，该处理培养基可根据具体实验需求进行优化，如同在人子宫内膜三维培养物的激素处理中所进行的优化8,16,17。

  1. 按照上述方法培养子宫内膜类器官。
  2. 接种后第四天，移除类器官培养基，并替换为 750 µL 饥饿培养基。过夜孵育。
  3. 次日早晨，移除饥饿培养基，加入含载体或 10 nM E2 的处理培养基 750 µL。孵育 48 小时。
  4. 按照试剂盒制造商提供的说明书进行 RNA 提取。

5. 子宫内膜类器官的组织学分析

注意：对子宫内膜类器官的形态特征进行成像，对于评估生长因子、基因操作或小分子抑制剂的细胞效应至关重要。本节介绍用于固定、处理和成像子宫内膜上皮类器官的技术，包括组织学染色和抗体免疫荧光染色方法。

  1. 准备含有1 mL 4%多聚甲醛（溶于1× PBS）的1.5 mL微量离心管，置于冰上。
  2. 吸除含有类器官的12孔板各孔中的培养基。
  3. 使用剪去尖端的1 mL移液枪头，向每个孔中加入500 µL 4%多聚甲醛，并轻轻将凝胶基质圆顶从孔底脱离。
  4. 轻柔地将整个凝胶基质圆顶吸入移液枪头，并转移至1.5 mL微量离心管中。
  5. 将类器官置于4 ˚C旋转仪上过夜，进行固定。
  6. 次日早晨，以600 × g 离心5分钟，使类器官沉淀。用移液器小心吸除4%多聚甲醛溶液并弃去。用70%乙醇洗涤类器官两次。
  7. 最后一次洗涤后，将管中乙醇保留50–100 µL，其余弃去。将离心管暂置一旁。
  8. 将一管组织处理胶置于水浴中，微波加热约30秒以融化胶体。注意观察胶体状态，防止其沸腾溢出。
    注意：组织处理胶融化后，若未过热沸腾，应迅速操作以包埋类器官。
  9. 转移足量的组织处理胶以完全覆盖模具表面（约250 µL）。
  10. 在组织处理胶仍处于熔融状态时，迅速将含有类器官的50 µL 70%乙醇溶液转移至模具中。确保类器官沉入或被推至模具底部区域。
  11. 将组织学模具置于盛有冰的容器上，使组织处理胶冷却并凝固。
  12. 待组织处理胶完全凝固后，小心将凝固的胶块转移至标本袋中，并记录类器官所在平面位置。
  13. 将标本袋放入组织学包埋盒中，采用常规组织固定与石蜡包埋的标准方法进行处理18。
  14. 固定并石蜡包埋后，使用切片机切成5 µm厚的切片19。随后按照下文所述步骤进行常规苏木精-伊红（H&E）染色或免疫染色。

6. 苏木精 & 伊红染色

  1. 脱蜡处理切片，步骤如下：二甲苯，2 次，每次 10 分钟；100% 乙醇，2 次，每次 3 分钟；80% 乙醇，3 分钟；60% 乙醇，3 分钟；dH2O，2 次，每次 3 分钟；苏木精染色 1 分钟；自来水冲洗（3 次，每次 5 秒）；伊红染色 1 分钟。
  2. 脱水处理切片，步骤如下：60% 乙醇，3 分钟；80% 乙醇，3 分钟；95% 乙醇，3 分钟；100% 乙醇，2 次，每次 3 分钟；二甲苯，2 次，每次 15 分钟。
  3. 使用封片介质封片。

7. 免疫荧光染色

  1. 按照步骤 6.1 所述方法对切片进行脱蜡。
  2. 进行抗原修复
    1. 将载玻片浸入耐微波容器中的抗原修复液中。
    2. 高火微波加热 20 分钟，每 5 分钟暂停一次，以防止溶液沸腾溢出。
  3. 完成 20 分钟抗原修复后，将载玻片继续浸没于抗原修复缓冲液中，在冰上冷却 40 分钟。
  4. 用 1× TBST 洗涤载玻片 3 分钟。
  5. 用含 3% BSA 的 TBST 在室温下孵育 1 小时，以封闭非特异性结合位点。
  6. 一抗孵育
    1. 用含 3% BSA 的 TBST 稀释一抗（稀释比例为 1:50–1:1,000，具体取决于抗体）。
    2. 在湿盒中 4 °C 过夜孵育。
    3. 用 TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
  7. 二抗孵育
    1. 用含 3% BSA 的 TBST（1:250 稀释）或 5% 正常驴血清稀释二抗。
    2. 由于二抗偶联了荧光染料，需在避光条件下室温孵育 1 小时。
  8. 细胞核染色
    1. 将 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）用 TBST 按 1:1,000 稀释。
    2. 室温孵育 5 分钟。
    3. 用 TBST 洗涤 2 次，每次 5 分钟。
  9. 封片
    1. 取一滴封片剂将盖玻片封固。
    2. 次日用指甲油密封盖玻片边缘。

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结果

小鼠子宫内膜类器官的相差显微图像
我们按照所附方案（参见示意图）所述，从野生型小鼠子宫内膜上皮建立了类器官。 图 1）。在小鼠子宫内膜上皮经酶解离后，通过机械方法将上皮片层与子宫基质细胞分离，并进一步使用胶原酶解离以获得单细胞悬液。若操作正确，这种上皮与基质细胞分离方法应能确保样品中异型细胞（即相反细胞类型）的污染率不超过10%-15%（参见免疫荧光图像于 图 2）。随后，将上皮细胞沉淀重悬于凝胶基质中，在室温下使其凝胶化，并铺板至25 µ将组织培养板上的凝胶基质圆顶。待凝胶基质圆顶凝固后，覆盖以类器官培养基并允许其生长。我们通常观察到，子宫内膜上皮细胞在3-4天内组装形成类器官，如图所示。 图 3类器官在培养中维持，每3天更换一次培养基，每5-7天进行一次传代。

小鼠子宫内膜类器官的组织学与免疫荧光染色成像

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讨论

本文描述了从小鼠子宫内膜建立子宫内膜上皮类器官的方法，以及常规用于其后续分析的实验方案。子宫内膜类器官是研究调控子宫内膜相关疾病（如子宫内膜异位症、子宫内膜癌和着床失败）机制的有力工具。2017年发表的几项里程碑式研究报道了从小鼠和人类上皮组织培养长期可传代且可再生的子宫内膜类器官的培养条件。4,5尽管类器官已被广泛用于研究其他系统中的生物学通路，但对子宫内膜组织的研究 体外 由于缺乏合适的模型来在培养条件下研究未转化的原代上皮组织，相关研究受到限制26利用通常用于培养其他器官组织（如肠道、肾脏和肺）类器官的条件，并将人和小鼠子宫内膜来源的子宫内膜类器官包埋于由凝胶基质组成的细胞外基质支架中，成功建立了子宫内膜类器官4自这些初步报道以来，科学界使用子宫内膜类器官研究子宫内膜生物学的现象已显著增加。

通过改进先前发表的小鼠子宫上皮分离方法

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢Stephanie Pangas博士和Martin M. Matzuk博士（M.M.M.）对本文稿的审阅与修改。本研究由Eunice Kennedy Shriver儿童健康与人类发育国家研究所资助，基金编号为R00-HD096057（D.M.）、R01-HD105800（D.M.）、R01-HD032067（M.M.M.）和R01-HD110038（M.M.M.），以及美国国家癌症研究所P30癌症中心支持基金（NCI-CA125123）。Diana Monsivais博士 获得Burroughs Wellcome基金会颁发的下一代妊娠奖（Next Gen Pregnancy Award）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
类器官培养基配方
名称公司货号终浓度
Corning Matrigel 生长因子减少型（GFR）基底膜基质，*无LDEVCorning354230100%
牛胰蛋白酶Sigma AldrichT1426-1G1%
Advanced DMEM/F12Life Technologies126340101X
N2 补充剂Life Technologies175020481X
B-27™ 补充剂（50X），不含维生素ALife Technologies125870101X
PrimocinInvivogenant-pm-1100 µg/mL
N-乙酰-L-半胱氨酸Sigma AldrichA9165-5G1.25 mM
L-谷氨酰胺Life Technologies250300242 mM
烟酰胺Sigma AldrichN0636-100G10 nM
ALK-4、-5、-7 抑制剂 A83-01Tocris2939500 nM
重组人 EGFPeprotechAF-100-1550 ng/mL
重组人 NogginPeprotech120-10C100 ng/mL
重组人 Rspondin-1Peprotech120-38500 ng/mL
重组人 FGF-10Peprotech100-26100 ng/mL
重组人 HGFPeprotech100-3950 ng/mL
WNT3aR&D systems5036-WN200 ng/mL
其他耗材与试剂
名称公司货号终浓度
梭菌胶原酶Sigma AldrichC0130-1G5 mg/mL
牛胰脱氧核糖核酸酶 ISigma AldrichDN25-100MG2 mg/mL
DPBS，无钙、无镁ThermoFisher14190-2501X
HBSS，无钙、无镁ThermoFisher141701121X
Falcon 聚苯乙烯微孔板（24孔）Fisher Scientific#08-772-51
Falcon 聚苯乙烯微孔板（12孔）Fisher Scientific#0877229
Falcon 细胞筛，40 µmFisher Scientific#08-771-1
Direct-zol RNA MiniPrep（50 µg）Genesee Scientific11-331
Trizol 试剂Invitrogen15596026
DMEM/F-12，含 HEPES，无酚红ThermoFisher11039021
胎牛血清，炭吸附处理Sigma AldrichF6765-500ML2%
雌二醇（E2）Sigma AldrichE1024-1G10 nM
甲醛水溶液（16%），电镜级VWR157104%
Epredia 组织包埋盒（单槽）Fisher Scientific1000961
Epredia 不锈钢包埋模具Fisher Scientific64-010-15 
乙醇，200 proof（100%）Fisher Scientific22-032-601 
HistoclearFisher Scientific50-899-90147
Permount 封片介质Fisher Scientific50-277-97
Epredia 尼龙活检袋Fisher Scientific6774010
HistoGel 组织处理凝胶VWR83009-992
优质苏木精溶液VWR95057-844
伊红Y（微黄色）溶液，优质VWR95057-848
TBS 缓冲液，20X，pH 7.4GenDEPORTT80541X
TBST（10X），pH 7.4GenDEPORTT80561X
柠檬酸 Sigma AldrichC0759-1KG
三水合柠檬酸钠Sigma AldrichS4641-500G
Tween20Fisher ScientificBP337-500 
牛血清白蛋白（BSA）Sigma AldrichA2153-100G3%
DAPI 溶液（1 mg/mL）ThermoFisher622481:1000 稀释
VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片剂Vector LabsH-1000-10
透明指甲油Fisher ScientificNC1849418
Fisherbrand Superfrost Plus 显微镜载玻片Fisher Scientific22037246
VWR 显微盖玻片VWR48393-106
SuperScript VILO Master MixThermoFisher11755050
SYBR Green PCR Master MixThermoFisher4364346
Krt8 抗体（TROMA-I） DSHBTROMA-I 1:50 稀释
Vimentin 抗体Cell Signaling5741S1:200 稀释
驴抗大鼠 IgG（H+L）高交叉吸附二抗
Alexa Fluor 594		ThermoFisherA-212091:250 稀释
驴抗兔 IgG（H+L）高交叉吸附二抗
Alexa Fluor 488		ThermoFisherA-212061:250 稀释
ZEISS Stemi 508 体视显微镜ZEISS
ZEISS Axio Vert.A1 倒置常规显微镜，带数码相机ZEISS
引物序列正向（5'-3'）反向（5'-3'）_
脂质运载蛋白2（Lcn2）GCAGGTGGTACGTTGTGGGCTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
乳铁蛋白（Ltf）TGAGGCCCTTGGACTCTGTACCCACTTTTCTCATCTCGTTC
孕酮受体（Pgr）CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTCTAACTTCAGACATCATTTCCGG
甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Gapdh）CAATGTGTCCGTCGTGGATCTGCCTGCTTCACCACCTTCTT

参考文献

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从小鼠子宫建立三维子宫内膜类器官
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