本方案描述了建立小鼠子宫内膜上皮类器官以进行基因表达和组织学分析的方法。
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本文内容
摘要
摘要
子宫内膜组织衬于子宫内腔，受雌激素和孕激素的周期性调控。该组织由腔上皮和腺上皮、间质区室、血管网络以及复杂的免疫细胞群体组成。小鼠模型已成为研究子宫内膜的有力工具，揭示了调控胚胎着床、胎盘形成及癌症发生的关键机制。近年来发展的三维子宫内膜类器官培养技术，为解析子宫内膜生物学背后的信号通路提供了前沿模型。利用基因工程小鼠模型建立子宫内膜类器官，分析其转录组，并在单细胞分辨率下观察其形态，是研究子宫内膜疾病的重要手段。本文概述了从小鼠建立子宫内膜上皮三维培养的方法，并描述了定量基因表达及分析类器官组织学的技术。目标是提供一种可用于建立、培养并研究子宫内膜上皮类器官基因表达与形态特征的资源。
引言
子宫内膜——子宫腔内层的黏膜组织——是一种独特且高度动态的组织，在女性生殖健康中发挥着关键作用。在生殖生命周期中，子宫内膜可在卵巢激素雌激素和孕激素的协同调控下，经历数百次的增殖、分化与脱落循环。通过对基因工程小鼠的研究，科学家揭示了子宫内膜对激素反应的基本生物学机制，以及胚胎着床、基质细胞蜕膜化和妊娠过程的调控机制1. 体外 然而，由于在传统二维细胞培养中难以维持未转化的原代小鼠子宫内膜组织，相关研究一直受到限制2,3近年来，子宫内膜组织以三维类器官（organoid）形式进行培养的技术取得了新进展，为研究调控子宫内膜细胞再生与分化的生物学通路提供了全新机遇。目前已利用包埋于不同基质中的纯子宫内膜上皮细胞，建立了小鼠和人类的子宫内膜类器官体系。4,5，而人类子宫内膜已被培养成无支架的上皮/间质共培养体系6,7，以及最近开发的胶原包封上皮/间质类组装体8上皮类器官培养物的生长与再生潜能依赖于一组经经验确定的生长因子和小分子抑制剂的特定组合，该组合可最大程度地促进类器官的生....
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方案
小鼠操作和实验研究均依照贝勒医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的方案，并遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物照护与使用指南》所制定的规范进行。
1. 使用酶法和机械法从小鼠中分离子宫上皮组织
注意：本节描述了利用凝胶基质支架建立、传代、冻存和复苏小鼠子宫内膜上皮类器官所需的步骤。既往研究表明，从小鼠动情期阶段获取的组织建立的小鼠子宫内膜类器官培养效果最佳4，动情期可通过阴道涂片的细胞学检查确定15。所有实验均使用成年雌性野生型小鼠（6–8 周龄，C57BL/6J 与 129S5/SvEvBrd 杂交品系）。小鼠依据 IACUC 批准的操作指南，经异氟烷麻醉后行颈椎脱位法人道处死。小鼠处死后，应按照以下步骤进行操作。有关本实验方案所用材料和溶液的详细信息，请参见材料表。
- 将凝胶基质置于冰上解冻约1-2小时后再使用。
- 解剖小鼠时，使用剪刀在腹部中线处做一纵向切口，轻轻掀开皮肤以暴露下方的腹膜层。用镊子提起腹膜层，并用剪刀做横向切口以暴露腹腔内容物。
- 轻轻拨开腹部脂肪垫以定位子宫角。从宫颈连接处夹住子宫角，用剪刀沿肠系膜脂肪进行剪切分离。在完成小鼠子宫的解剖后，使用小剪刀彻底清除....
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结果
小鼠子宫内膜类器官的相差显微图像
我们按照所附方案（参见示意图）所述，从野生型小鼠子宫内膜上皮建立了类器官。 图 1）。在小鼠子宫内膜上皮经酶解离后，通过机械方法将上皮片层与子宫基质细胞分离，并进一步使用胶原酶解离以获得单细胞悬液。若操作正确，这种上皮与基质细胞分离方法应能确保样品中异型细胞（即相反细胞类型）的污染率不超过10%-15%（参见免疫荧光图像于 图 2）。随后，将上皮细胞沉淀重悬于凝胶基质中，在室温下使其凝胶化，并铺板至25 µ将组织培养板上的凝胶基质圆顶。待凝胶基质圆顶凝固后，覆盖以类器官培养基并允许其生长。我们通常观察到，子宫内膜上皮细胞在3-4天内组装形成类器官，如图所示。 图 3类器官在培养中维持，每3天更换一次培养基，每5-7天进行一次传代。
小鼠子宫内膜类器官的组织学与免疫荧光染色成像
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讨论
本文描述了从小鼠子宫内膜建立子宫内膜上皮类器官的方法，以及常规用于其后续分析的实验方案。子宫内膜类器官是研究调控子宫内膜相关疾病（如子宫内膜异位症、子宫内膜癌和着床失败）机制的有力工具。2017年发表的几项里程碑式研究报道了从小鼠和人类上皮组织培养长期可传代且可再生的子宫内膜类器官的培养条件。4,5尽管类器官已被广泛用于研究其他系统中的生物学通路，但对子宫内膜组织的研究 体外 由于缺乏合适的模型来在培养条件下研究未转化的原代上皮组织，相关研究受到限制26利用通常用于培养其他器官组织（如肠道、肾脏和肺）类器官的条件，并将人和小鼠子宫内膜来源的子宫内膜类器官包埋于由凝胶基质组成的细胞外基质支架中，成功建立了子宫内膜类器官4自这些初步报道以来，科学界使用子宫内膜类器官研究子宫内膜生物学的现象已显著增加。
通过改进先前发表的小鼠子宫上皮分离方法
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢Stephanie Pangas博士和Martin M. Matzuk博士（M.M.M.）对本文稿的审阅与修改。本研究由Eunice Kennedy Shriver儿童健康与人类发育国家研究所资助，基金编号为R00-HD096057（D.M.）、R01-HD105800（D.M.）、R01-HD032067（M.M.M.）和R01-HD110038（M.M.M.），以及美国国家癌症研究所P30癌症中心支持基金（NCI-CA125123）。Diana Monsivais博士 获得Burroughs Wellcome基金会颁发的下一代妊娠奖（Next Gen Pregnancy Award）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 类器官培养基配方 | |||
| 名称 | 公司 | 货号 | 终浓度 |
| Corning Matrigel 生长因子减少型（GFR）基底膜基质，*无LDEV | Corning | 354230 | 100% |
| 牛胰蛋白酶 | Sigma Aldrich | T1426-1G | 1% |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634010 | 1X |
| N2 补充剂 | Life Technologies | 17502048 | 1X |
| B-27™ 补充剂（50X），不含维生素A | Life Technologies | 12587010 | 1X |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
| N-乙酰-L-半胱氨酸 | Sigma Aldrich | A9165-5G | 1.25 mM |
| L-谷氨酰胺 | Life Technologies | 25030024 | 2 mM |
| 烟酰胺 | Sigma Aldrich | N0636-100G | 10 nM |
| ALK-4、-5、-7 抑制剂 A83-01 | Tocris | 2939 | 500 nM |
| 重组人 EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50 ng/mL |
| 重组人 Noggin | Peprotech | 120-10C | 100 ng/mL |
| 重组人 Rspondin-1 | Peprotech | 120-38 | 500 ng/mL |
| 重组人 FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100 ng/mL |
| 重组人 HGF | Peprotech | 100-39 | 50 ng/mL |
| WNT3a | R&D systems | 5036-WN | 200 ng/mL |
| 其他耗材与试剂 | |||
| 名称 | 公司 | 货号 | 终浓度 |
| 梭菌胶原酶 | Sigma Aldrich | C0130-1G | 5 mg/mL |
| 牛胰脱氧核糖核酸酶 I | Sigma Aldrich | DN25-100MG | 2 mg/mL |
| DPBS，无钙、无镁 | ThermoFisher | 14190-250 | 1X |
| HBSS，无钙、无镁 | ThermoFisher | 14170112 | 1X |
| Falcon 聚苯乙烯微孔板（24孔） | Fisher Scientific | #08-772-51 | |
| Falcon 聚苯乙烯微孔板（12孔） | Fisher Scientific | #0877229 | |
| Falcon 细胞筛，40 µm | Fisher Scientific | #08-771-1 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep（50 µg） | Genesee Scientific | 11-331 | |
| Trizol 试剂 | Invitrogen | 15596026 | |
| DMEM/F-12，含 HEPES，无酚红 | ThermoFisher | 11039021 | |
| 胎牛血清，炭吸附处理 | Sigma Aldrich | F6765-500ML | 2% |
| 雌二醇（E2） | Sigma Aldrich | E1024-1G | 10 nM |
| 甲醛水溶液（16%），电镜级 | VWR | 15710 | 4% |
| Epredia 组织包埋盒（单槽） | Fisher Scientific | 1000961 | |
| Epredia 不锈钢包埋模具 | Fisher Scientific | 64-010-15 | |
| 乙醇，200 proof（100%） | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| Histoclear | Fisher Scientific | 50-899-90147 | |
| Permount 封片介质 | Fisher Scientific | 50-277-97 | |
| Epredia 尼龙活检袋 | Fisher Scientific | 6774010 | |
| HistoGel 组织处理凝胶 | VWR | 83009-992 | |
| 优质苏木精溶液 | VWR | 95057-844 | |
| 伊红Y（微黄色）溶液，优质 | VWR | 95057-848 | |
| TBS 缓冲液，20X，pH 7.4 | GenDEPORT | T8054 | 1X |
| TBST（10X），pH 7.4 | GenDEPORT | T8056 | 1X |
| 柠檬酸 | Sigma Aldrich | C0759-1KG | |
| 三水合柠檬酸钠 | Sigma Aldrich | S4641-500G | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma Aldrich | A2153-100G | 3% |
| DAPI 溶液（1 mg/mL） | ThermoFisher | 62248 | 1:1000 稀释 |
| VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片剂 | Vector Labs | H-1000-10 | |
| 透明指甲油 | Fisher Scientific | NC1849418 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus 显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 22037246 | |
| VWR 显微盖玻片 | VWR | 48393-106 | |
| SuperScript VILO Master Mix | ThermoFisher | 11755050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | ThermoFisher | 4364346 | |
| Krt8 抗体（TROMA-I） | DSHB | TROMA-I | 1:50 稀释 |
| Vimentin 抗体 | Cell Signaling | 5741S | 1:200 稀释 |
| 驴抗大鼠 IgG（H+L）高交叉吸附二抗 Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-21209 | 1:250 稀释 |
| 驴抗兔 IgG（H+L）高交叉吸附二抗 Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21206 | 1:250 稀释 |
| ZEISS Stemi 508 体视显微镜 | ZEISS | ||
| ZEISS Axio Vert.A1 倒置常规显微镜，带数码相机 | ZEISS | ||
| 引物序列 | 正向（5'-3'） | 反向（5'-3'） | _ |
| 脂质运载蛋白2（Lcn2） | GCAGGTGGTACGTTGTGGG | CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC | |
| 乳铁蛋白（Ltf） | TGAGGCCCTTGGACTCTGT | ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC | |
| 孕酮受体（Pgr） | CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC | TAACTTCAGACATCATTTCCGG | |
| 甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Gapdh） | CAATGTGTCCGTCGTGGATCT | GCCTGCTTCACCACCTTCTT |
参考文献
- Wang, H., Dey, S. K. Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models. Nature Reviews Genetics. 7 (3), 185-199 (2006).
- Hibaoui, Y., Feki, A. Organoid models of human endometrial development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biol....
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