体外研究 研究结膜杯状细胞中基于性别的差异的方法

摘要

在基于性别的差异研究中，无酚红/无胎牛血清培养基是比晚期 RPMI 更好的选择，可在不改变结膜杯状细胞正常功能的情况下消除外源激素。

摘要

干眼症是一种影响眼表健康的多因素疾病，女性的患病率要高得多。结膜杯状细胞 （CGC） 分泌到眼表的凝胶形成粘蛋白被破坏会导致多种眼表疾病。在CGC基于性别的差异的体外研究期间，消除外源性激素对于获得一致的结果至关重要。本文描述了一种在CGCs基于性别的差异研究中最大限度地减少外源性激素存在的方法，同时保持其生理功能。将来自死后人类供体的CGC在含有10%胎牛血清（FBS）（称为完全培养基）的RPMI培养基中从结膜碎片中培养，直至汇合。在实验开始前近48小时，将CGC转移到不含酚红或FBS但含有1%BSA（称为无酚红培养基）的RPMI培养基中。通过使用呋喃 2/乙酰氧基甲基 （AM） 显微镜测量卡巴酚 （Cch， 1 x ^10-4 M） 刺激后细胞内 [Ca 2⁺] （[Ca²⁺]_i） 的增加来研究正常细胞功能。结果表明，CGCs在无酚红培养基中48 h后仍能维持正常功能。在Cch刺激下，无酚红RPMI培养基和完全培养基之间的[Ca²⁺]_i反应没有显著差异。因此，在基于性别的差异研究中，我们推荐使用含有 1% BSA 的不含酚红的 RPMI 培养基来消除外源激素，而不会改变 CGC 的正常功能。

引言

基于性别的差异影响眼表的多个过程 ^1,2,3。这些基于性别的差异的临床表现是男性和女性之间许多眼表疾病患病率的差异，例如干眼症和结膜炎^4,5,6。有证据表明，基于性别的差异源于多个生物学水平，包括 X 和 Y 染色体⁷ 上基因的不同特征以及激素的影响⁸。研究基于性别的差异的分子基础可以更好地了解疾病，并最终改善个性化医疗。

眼表包括覆盖的泪膜、角膜和结膜。在眼表的多个组成部分中观察到基于性别的差异，包括泪膜 9,10、角膜 11、泪腺^12,13 和也分泌泪液的睑板腺¹²。许多机制研究调查....

方案

所有人体组织均经捐献者事先知情同意和授权捐献至眼库，用于科学研究。马萨诸塞州眼耳人类研究委员会审查了人类结膜组织的使用，并确定为豁免，不符合人类受试者研究的定义。

1. 原代人杯状细胞培养

1. 从眼库中，获得人结膜组织¹⁶.
2. 制备培养基，补充有10%胎牛血清（FBS），2mM谷氨酰胺，2mM非必需氨基酸（NEAA），2mM丙酮酸钠，100μg/ mL青霉素 - 链霉素和2mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）的RPMI-1640培养基。
3. 如下所述进行原代细胞培养。
   1. 用无菌手术刀将组织切成 1 mm³ 块，然后接种到培养罩中的培养板上。在 6 孔板的每个孔中接种 4 块，放入 1 mL 完全 RPMI 培养基中。虽然组织片的方向不会影响细胞生长，但要确保片粘附在培养板上，以确保使用手术刀刀片生长。
   2. 将组织块放入含有95%空气和5%CO₂ 的培养箱中，温度为37°C。 每隔一天刷新一次相同的培养基，直到杯状细胞在大约 14 天内达到 70%-80% 汇合度。接种后约72小时取出组织塞。
      注:人结膜上皮主要含有分层的鳞状细胞和杯状细胞。RPMI是杯状细胞的选择性培养基。在人CGC培养物中，成纤维细胞很少在第7天左右生长。纯化培养物的方法在先前的出....

结果

原代培养物中的人 CGC 在大约 14 天内增长到 80% 汇合度。通过对杯状细胞标志物CK7和HPA-1²⁵ 的抗体进行免疫荧光染色来确认细胞类型（图1）。尽管从培养基中去除FBS可以消除性激素，但缺乏FBS可能会影响细胞反应。为了验证激素消除方法，使用胆碱能激动剂（卡巴胆碱，Cch 1 × ^10-4 M）作为刺激物，以模拟由杯状细胞周围的不同神经末梢介导的生理性杯状细胞分泌²⁶。从对照完全RPMI培养基中观察到钙变化的幅度没有差异，表明该方法可用于研究细胞反应中基于性别的差异。

方案部分中描述的 Fura-2/AM 测定是在用完全 RPMI + 10% FBS 培养基、补充有 1% BSA 的高级 RPMI 培养基（RPMI 提供专有浓度的胰岛素）和含有 1% BSA 的无酚红 RPMI 处理的培养皿上进行的。结果来自四个人。将无酚红RPMI与1%BSA和完全RPMI培养基一起孵育的细胞进行比较时，未发.......

讨论

研究眼部组织中基于性别的差异有助于了解疾病的过程，尤其是干眼症和过敏性结膜炎，它们不成比例地影响一种性别 ^4,5,6。尽管动物模型可用于这些研究，但由于与体内人类细胞具有最高的相似性，直接从人体组织获得的数据是必不可少的。当前实验环境中使用的结膜组织来自年龄范围为 70-85 岁（绝经后）的已故供体，因此更容易在生前控制激素效应。在这里，我们提出了一种具有成本效益的方法来研究人类CGC中基于性别的差异。

获得一致数据的关键步骤是在实验前去除FBS和酚红48小时，以消除性激素的影响。性激素在细胞中的作用可分为非转录效应和转录效应。非转录效应在几秒钟到几分钟内通过 G 蛋白快速介导，某些基因被激活的转录效应需要 30 分钟到几个小时²⁷;雌激素诱导的雌激素受体α（ERα）的半衰期为2-6小时

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
含 1x EDTA 的 0.05% 胰蛋白酶	Gibco（纽约州格兰德岛）	25300-054
4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸	Fisher Bioreagent（宾夕法尼亚州匹兹堡）	BP310-500
高级 RPMI 培养基	Gibco（纽约州格兰德岛）	12633020
卡巴酚	Cayman Chemical（密歇根州安娜堡）	144.86
胎牛血清	研发&D （明尼苏达州明尼阿波利斯市）	S11150H
Fura-2- 乙酰氧基甲酯	Thermo Fisher Scientific （Waltham， MA， USA）	F1221
人结膜组织	Eversight Eye Bank （Ann Arbor， MI）	N/A
KRB 缓冲液无机盐	Sigma-Aldrich （圣路易斯，密苏里州）		任何品牌都可以使用
L-谷氨酰胺	Lonza Group（瑞士巴塞尔）	17-605F
非必需氨基酸	Gibco （纽约州格兰德岛）	11140-050
青霉素/链霉素	Gibco （纽约州格兰德岛）	15140-122
不含酚红的 RPMI 培养基	Gibco（纽约州格兰德岛）	11835055
普洛膦酸 F127	MilliporeSigma（美国马萨诸塞州伯灵顿）	P2443-250G
RPMI-1640 培养基	Gibco（纽约州格兰德岛）	21875034
手术刀Thermo	Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）	12460451	任何无菌手术刀都可以使用
丙酮酸钠	Gibco（纽约州格兰德岛）	11360-070
亚磺吡酮	MilliporeSigma （Burlington， MA， USA）	S9509-5G