在研究性别差异时，使用无酚红/无胎牛血清的培养基比使用高级RPMI培养基更能有效消除外源性激素，同时不干扰结膜杯状细胞的正常功能。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
干眼症是一种影响眼表健康的多因素疾病，在女性中的发病率显著更高。结膜杯状细胞（CGCs）分泌至眼表的凝胶形成型黏蛋白发生紊乱，可导致多种眼表疾病。在实验过程中，消除外源性性激素的干扰对于获得一致的结果至关重要。 体外 研究基于性别的杯状细胞差异。本文描述了一种在维持杯状细胞生理功能的同时，减少外源性激素干扰以研究其性别差异的方法。取自不同性别尸体供体结膜组织的杯状细胞（CGCs），在含10%胎牛血清（FBS）的RPMI培养基（称为完全培养基）中进行培养，直至细胞融合。实验开始前约48小时，将CGCs转移至不含酚红和FBS、但含1%牛血清白蛋白（BSA）的RPMI培养基（称为无酚红培养基）。通过检测细胞内[Ca²⁺]浓度升高来评估细胞正常功能。2+] ([Ca2+]i) 加入卡巴胆碱（Cch，1 × 10-4 M）刺激下使用fura 2/乙酰氧基甲酯（AM）显微技术进行检测。结果显示，小脑颗粒细胞在无酚红培养基中培养48小时后仍保持正常功能，其[Ca2+]i 在Cch刺激下，酚红-free RPMI培养基与完全培养基之间观察到反应差异。因此，在研究性别差异时，我们建议使用含1% BSA的酚红-free RPMI培养基，以消除外源性激素干扰，同时不改变颗粒细胞（CGCs）的正常功能。
引言
性别差异影响眼表的多种生理过程1,2,3。这些性别差异在临床上表现为男性和女性在多种眼表疾病患病率上的不同，例如干眼症和结膜炎4,5,6。研究表明，性别差异源于多个生物学层面，包括X染色体和Y染色体上基因表达谱的不同7以及激素的作用8。研究性别差异的分子基础有助于更深入理解疾病机制，并最终推动个体化医疗的发展。
眼表包括表层的泪膜、角膜和结膜。在眼表的多个组成部分中均观察到性别差异，包括泪膜9,10、角膜11、泪腺12,13以及同样参与泪液分泌的睑板腺12。已有大量机制性研究探讨了性激素对角膜及其相关组分的影响14,15；然而，关于结膜及其杯状细胞的性别差异仍知之甚少。结膜是一种覆盖巩膜及眼睑内表面的黏膜组织。结膜上皮由非角化的多层复层鳞状细胞构成16。
在结膜的复层鳞状上皮细胞中，杯状细胞（CGCs）散布于上皮的顶端表面。这些杯状细胞的特征是其顶端极含有大量分泌颗粒。17杯状细胞合成并分泌凝胶形成型黏蛋白MUC5AC，以润湿眼表并在眨眼时提供润滑作用17黏蛋白分泌受到细胞内[Ca2+]（[Ca2+]i以及激活的 Ras依赖性细胞外信号调节激酶（ERK1/2）18无法分泌黏蛋白会导致眼表干燥及一系列病理性异常后遗症。然而，在炎症的眼表环境中，炎症介质会刺激大量黏蛋白分泌，从而引起眼部黏滞感和瘙痒感。19这些导致黏蛋白分泌紊乱的状况最终将引起眼表的恶化。
杯状细胞作为眼部分泌黏蛋白主要来源的作用早已被公认20然而，生理性与病理性状态下黏蛋白调控的性别差异仍不明确。 体外 该系统可用于在无激素影响或性激素水平精确控制的条件下监测杯状细胞的功能。尽管已有结膜上皮细胞系的建立21，目前尚无具备功能性黏蛋白分泌的杯状细胞系可用。因此，我们改进了已建立的原代人结膜杯状细胞（CGC）培养方法，以建立一种分析性别差异的实验方法 体外16，并按如下方式呈现。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有人体组织均在捐献者事先知情同意并授权用于科学研究的前提下捐赠给眼库。使用人眼结膜组织的研究已由麻省眼耳医院人体研究委员会审查，认定属于豁免范围，不符合涉及人体受试者的研究定义。
1. 原代人杯状细胞培养
- 从眼库获取人结膜组织16。
- 配制培养基：RPMI-1640 培养基，添加 10% 胎牛血清（FBS）、2 mM 谷氨酰胺、2 mM 非必需氨基酸（NEAA）、2 mM 丙酮酸钠、100 µg/mL 青霉素-链霉素和 2 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）。
- 按以下步骤进行原代细胞培养。
- 在无菌条件下用手术刀将组织切成 1 mm3 大小的组织块，并在超净工作台中接种至培养板。每孔 6 孔板中加入 4 块组织，加入 1 mL 完全 RPMI 培养基。尽管组织块的方向不影响细胞生长，但需使用刀片确保组织块紧贴培养板表面，以促进细胞爬出。
- 将接种后的培养板置于 37 °C、含 95% 空气和 5% CO2 的培养箱中培养。每两天更换一次相同培养基，直至杯状细胞在约 14 天内达到 70%–80% 汇合度。接种后约 72 小时移除组织块。
注意：人结膜上皮主要包含复层鳞状上皮细胞和杯状细胞。RPMI 培养基对杯状细胞具有选择性。在人结膜杯状细胞（CGC）培养中，成纤维细胞偶尔可能在第 7 天左右开始生长。纯化培养物的方法已在先前发表的研究中描述 22。 - 采用免疫荧光显微镜（IFM）检测 GC 培养物的纯度，靶标为细胞角蛋白（CK）7 和蓬莱蜗牛凝集素-1（HPA-1）22，操作步骤参照文献19中所述的标准 IFM 方法；参见代表性结果。
2. 人结膜杯状细胞传代与实验准备
- 用 PBS（pH = 7.4）冲洗细胞，并使用含 0.05% 胰蛋白酶和 1x EDTA 的溶液进行消化以脱离细胞。每隔一分钟在显微镜下观察细胞。一旦细胞从培养皿底部脱落，立即用完全 RPMI 培养基终止胰蛋白酶的消化作用。
- 在室温下以 150 × g 离心 5 分钟。将细胞沉淀重悬于完全 RPMI 培养基中，并重新接种至玻璃底培养皿中用于检测细胞内钙离子浓度 [Ca2+]i。每皿培养基总体积为 300 µL。将培养基保持在培养皿玻璃区域的中央位置。
- 去除培养基中的激素：培养基中可能含有性激素，尤其是胎牛血清（FBS）。由于 RPMI-1640 中含有的酚红具有雌激素活性23,24，因此需将 RPMI 培养基替换为不含酚红的 RPMI 培养基，并在配制完全培养基后使用 pH 试纸调节 pH 至 7.45。完全培养基中所含的 HEPES 可将 pH 维持在一个相对稳定的范围内。
3. 用于测定[Ca2+]i的Fura-2/乙酰氧甲基（AM）检测法
- 按照以下步骤进行 Fura-2/AM 负载。
- 将细胞接种于玻璃底培养皿中，在 37 °C、常压、避光条件下，用含有 119 mM NaCl、4.8 mM KCl、1.0 mM CaCl2、1.2 mM MgSO4 和 25 mM NaHCO3 的 Krebs-Ringer 碳酸氢盐缓冲液（KRB）（表 1）孵育 1 小时，缓冲液中另含 0.5% HEPES、0.5% BSA、0.5 µM fura-2/AM、8 µM 普流尼克酸 F127 和 250 µM 磺吡酮。
- 使用 pH 计在使用前将 pH 调至 7.45。在完成 fura-2/AM 负载后，于进行 [Ca2+]i 测定前，立即用含 250 µM 磺吡酮的 KRB 缓冲液洗涤细胞。
- 按照以下步骤进行 [Ca2+]i 测定。
- 将负载了 fura-2 的细胞培养皿置于显微镜下，于 200 倍放大倍数下选择一个包含 20 至 50 个细胞的代表性视野，并使用 Freehand 工具围绕每个细胞绘制轮廓，以向软件标明背景荧光区域与非背景荧光区域。
- 等待软件自动扣除背景荧光，然后点击 Start Experiment 按钮开始实验。
- 随后等待 8 至 15 秒，以建立细胞的基础钙水平，再小心加入感兴趣的激动剂。在加入激动剂后继续至少 120 秒的测定，或直至钙水平恢复至基线。
- 按照以下步骤进行数据分析。
- 使用 [Ca2+]i 峰值的变化来表示刺激物的作用。根据测量开始后前 8 至 15 秒的数据，计算每个细胞的平均基础钙水平。若该数值等于或高于 500 nM，则将该细胞从数据集中剔除，因其可能正在经历凋亡或坏死。
- 在计算出每个细胞的基础水平后，从该细胞测得的最大 [Ca2+]i 值中减去该基础值。对同一培养皿中所有细胞的 [Ca2+]i 峰值变化取平均值。
- 为确保一致性，每种刺激物的反应需重复测定两次，并将两次重复实验所得的 [Ca2+]i 峰值变化的平均值作为来自单个个体样本的一个数据点。根据研究设计，采用适当的数据分析方法比较不同组之间的数据。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
原代培养的人杯状细胞（CGCs）约在14天内生长至80%融合度。通过使用针对杯状细胞标志物CK7和HPA-1的抗体进行免疫荧光染色，确认了细胞类型25（图1）。尽管从培养基中去除胎牛血清（FBS）可消除性激素的影响，但缺乏FBS可能会影响细胞的反应。为验证激素去除方法的有效性，采用胆碱能激动剂（卡巴胆碱，Cch 1 × 10-4 M）作为刺激物，以模拟由环绕杯状细胞的不同神经末梢介导的生理性杯状细胞分泌过程26。结果显示，与完全RPMI培养基对照组相比，细胞内钙离子变化幅度无显著差异，表明该方法可用于研究细胞反应中的性别差异。
方案部分所述的Fura-2/AM检测在以下培养条件下进行：完全RPMI + 10% FBS培养基、添加了专有浓度胰岛素的高级RPMI培养基（advanced RPMI）并补充1% BSA，以及含1% BSA的酚红-free RPMI培养基。结果来自四名个体。比较含1% BSA的酚红-...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
研究眼部组织的性别差异有助于理解疾病发生机制，尤其是干眼症和过敏性结膜炎等在性别间发病率存在显著差异的疾病4,5,6尽管这些研究可以使用动物模型，但直接从人体组织获得的数据至关重要，因为其与人类细胞具有最高的相似性 体内当前实验所用的结膜组织来自年龄为70至85岁（绝经后）的已故供体，有利于控制激素影响。 死前在此，我们提出了一种经济高效的方法来研究人类颗粒细胞中基于性别的差异。
获得一致数据的关键步骤是在实验前去除胎牛血清（FBS）和酚红48小时，以消除性激素的影响。性激素在细胞中的作用可分为非转录效应和转录效应。非转录效应通过G蛋白在数秒至数分钟内快速介导，而转录效应则需30分钟至数小时，以激活特定基因27；雌激素诱导的雌激素受体α（ERα）的半衰期为2–6小时28
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
本工作由国家眼科研究所资助项目 EY019470（D.A.D）资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 含1x EDTA的0.05%胰蛋白酶 | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
| 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸 | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
| 高级RPMI培养基 | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
| 卡巴胆碱 | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144.86 | |
| 胎牛血清 | R&D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
| Fura-2-乙酰氧甲基酯 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | F1221 | |
| 人结膜组织 | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
| KRB缓冲液用无机盐 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 任何品牌均可使用 | |
| L-谷氨酰胺 | Lonza Group (Basel, Switzerland) | 17-605F | |
| 非必需氨基酸 | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
| 无酚红RPMI培养基 | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
| Pluronic F127酸 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | P2443-250G | |
| RPMI-1640培养基 | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
| 手术刀 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 12460451 | 任何无菌外科手术刀均可使用 |
| 丙酮酸钠 | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
| 磺吡酮 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | S9509-5G |
参考文献
- Gao, Y., et al. Female-specific downregulation of tissue polymorphonuclear neutrophils drives impaired regulatory T cell and amplified effector T cell responses in autoimmune dry eye disease. Journal of Immunology. 195, 3086-3099 (2015).
- Wang, S. B., et al. Estrogen negatively regulates epithelial wound healing and protective lipid mediator circuits in the cornea. FASEB Journal. 26, 1506-1516 (2012).
- Sullivan, D. A., Block, L., Pena, J. D. Influence of androgens and pituitary hormones on the structural profile and secretory activity of the lacrimal gland. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 74, 421-435 (1996).
- Schaumberg, D. A., Dana, R., Buring, J. E., Sullivan, D. A. Prevalence of dry eye disease among US men: estimates from the Physicians' Health Studies. Archives of Ophthalmology. 127, 763-768 (2009).
- Tellefsen Nøland, S., et al. Sex and age differences in symptoms and signs of dry eye disease in a Norwegian cohort of patients. The Ocular Surface. 19, 68-73 (2021).
- Sullivan, D. A., et al. TFOS DEWS II Sex, gender, and hormones report. The Ocular Surface. 15, 284-333 (2017).
- Meester, I., et al. SeXY chromosomes and the immune system: reflections after a comparative study. Biology of Sex Differences. 11, 3(2020).
- Yang, J. -H., et al. Hormone replacement therapy reverses the decrease in natural killer cytotoxicity but does not reverse the decreases in the T-cell subpopulation or interferon-gamma production in postmenopausal women. Fertility and Sterility. 74, 261-267 (2000).
- Orucoglu, F., Akman, M., Onal, S. Analysis of age, refractive error and gender related changes of the cornea and the anterior segment of the eye with Scheimpflug imaging. Contact Lens & Anterior Eye. 38, 345-350 (2015).
- Strobbe, E., Cellini, M., Barbaresi, U., Campos, E. C. Influence of age and gender on corneal biomechanical properties in a healthy Italian population. Cornea. 33, 968-972 (2014).
- Sullivan, D. A., Jensen, R. V., Suzuki, T., Richards, S. M. Do sex steroids exert sex-specific and/or opposite effects on gene expression in lacrimal and meibomian glands. Molecular Vision. 15, 1553-1572 (2009).
- Bukhari, A. A., Basheer, N. A., Joharjy, H. I. Age, gender, and interracial variability of normal lacrimal gland volume using MRI. Ophthalmic Plastic and Reconstructive Surgery. 30, 388-391 (2014).
- Sullivan, B. D., Evans, J. E., Dana, M. R., Sullivan, D. A. Influence of aging on the polar and neutral lipid profiles in human meibomian gland secretions. Archives of Ophthalmology. 124, 1286-1292 (2006).
- Ebeigbe, J. A., Ebeigbe, P. N. The influence of sex hormone levels on tear production in postmenopausal Nigerian women. African Journal of Medicine and Medical Sciences. 43, 205-211 (2014).
- Suzuki, T., et al. Estrogen's and progesterone's impact on gene expression in the mouse lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, 158-168 (2006).
- Shatos, M. A., et al. Isolation and characterization of cultured human conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, 2477-2486 (2003).
- Huang, A. J., Tseng, S. C., Kenyon, K. R. Morphogenesis of rat conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 29, 969-975 (1988).
- Li, D., et al. Resolvin D1 and aspirin-triggered resolvin D1 regulate histamine-stimulated conjunctival goblet cell secretion. Mucosal Immunology. 6, 1119-1130 (2013).
- Dartt, D. A., Masli, S. Conjunctival epithelial and goblet cell function in chronic inflammation and ocular allergic inflammation. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 14, 464-470 (2014).
- Mantelli, F., Argüeso, P. Functions of ocular surface mucins in health and disease. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 8, 477-483 (2008).
- García-Posadas, L., et al. Characterization and functional performance of a commercial human conjunctival epithelial cell line. Experimental Eye Research. 223, 109220(2022).
- Shatos, M. A., et al. Isolation, characterization, and propagation of rat conjunctival goblet cells in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 42, 1455-1464 (2001).
- Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Molecular and Cellular Endocrinology. 57, 169-178 (1988).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 2496-2500 (1986).
- García-Posadas, L., et al. Interaction of IFN-γ with cholinergic agonists to modulate rat and human goblet cell function. Mucosal Immunology. 9, 206-217 (2016).
- Li, D., Jiao, J., Shatos, M. A., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Effect of VIP on intracellular [Ca2 ], extracellular regulated kinase 1/2, and secretion in cultured rat conjunctival goblet cells. Investigative Opthalmology & Visual Science. 54, 2872-2884 (2013).
- Contrò, V., et al. Sex steroid hormone receptors, their ligands, and nuclear and non-nuclear pathways. AIMS Molecular Science. 2, 294-310 (2015).
- Valley, C. C., Solodin, N. M., Powers, G. L., Ellison, S. J., Alarid, E. T. Temporal variation in estrogen receptor-alpha protein turnover in the presence of estrogen. Journal of Molecular Endocrinology. 40, 23-34 (2008).
- Campen, C. A., Gorski, J. Anomalous behavior of protein synthesis inhibitors on the turnover of the estrogen receptor as measured by density labeling. Endocrinology. 119, 1454-1461 (1986).
- Yang, M., et al. Sex-based differences in conjunctival goblet cell responses to pro-inflammatory and pro-resolving mediators. Scientific Reports. 12, 16305(2022).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
