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方法文章

微加工具有长程纤维取向的三维胶原水凝胶

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DOI：

10.3791/64457

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2022年9月7日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Kate Gleason College of Engineering, Rochester Institute of Technology

本文内容

摘要

本方案演示了使用沿流体流动方向具有变化几何结构的微流控通道，以产生拉伸应变（拉伸），从而在三维胶原水凝胶（<250 µm 厚度）中实现纤维的定向排列。所形成的纤维取向可延伸数毫米，并受拉伸应变速率的影响。

摘要

排列整齐的I型胶原蛋白（COL1）纤维可引导肿瘤细胞迁移，影响内皮细胞形态，调控干细胞分化，并且是心脏及肌肉骨骼组织的典型特征。为研究细胞对有序微环境的响应 体外，已开发出多种用于生成具有明确纤维取向的COL1基质的方案，包括磁控、机械、基于细胞以及微流控方法。其中，微流控方法具备更先进的能力，例如可精确控制流体流动及细胞微环境。然而，用于生成取向性COL1基质以实现高级应用的微流控技术仍存在挑战 体外 培养平台一直局限于薄层“膜片”（<厚度为40 µm的COL1纤维，其延伸距离小于500 µm，不适合用于三维细胞培养。本文介绍一种在微流控装置中制备具有毫米尺度内纤维取向明确的三维COL1基质（厚度为130–250 µm）的实验方案。该平台通过为细胞培养提供直接接触微结构基质的途径，实现了模拟有序组织微环境的先进细胞培养功能。

引言

细胞存在于一种称为细胞外基质（ECM）的复杂三维纤维网络中，其主要成分是结构蛋白I型胶原（COL1）。1,2细胞外基质的生物物理特性为细胞提供导向信号，细胞则相应地重塑细胞外基质的微结构3,4,5这些相互作用的细胞-基质互作可导致排列有序的COL1纤维区域的形成6 促进肿瘤微环境中血管生成和细胞侵袭的因子7,8,9 并影响细胞形态10,11,12，极化13，以及分化14排列整齐的胶原纤维也有助于促进伤口愈合15在组织发育中起关键作用16，并参与细胞间的长距离通讯17,18因此，复制天然 COL1 纤维的微结构 体外 是构建结构化模型以研究细胞对有序微环境响应的重要一步。

微流控细胞培养系统已被确立为开发微生理系统（MPS）的首选技术19,20,21,22,23利用微尺度下的有利缩放效应，这些系统可精确控制流体流动，支持机械力的可控引入，并定义微通道内的生化微环境21,24,25,26,27MPS 平台已被用于模拟组织特异性微环境并研究多器官相互作用28同时，水凝胶被广泛用于模拟细胞外基质（ECM）所具有的三维力学特性及其生物学影响 体内29,30. 随着三维培养与微流控平台整合的日益重视，已有多种方法可将COL1水凝胶应用于微流控装置中31,32,33然而，用于在微流控通道中排列COL1水凝胶的方法仅限于薄的二维结构 "垫子" (<40 µm 厚度的通道 <1 毫米宽，模拟细胞在有序三维微环境中响应的能力有限31,34,35,36.

为了在微流控系统中实现取向排列的三维COL1水凝胶，已有研究表明，当自组装的COL1溶液暴露于局部拉伸流场（沿流动方向的速度变化）时，所形成的COL1水凝胶其纤维取向程度与所经历的拉伸应变率大小呈正比37,38。本方案中的微通道设计具有两个独特之处：首先，分段式结构可对COL1溶液引入局部拉伸应变；其次，其"两片式"构造使用户能够在完成COL1纤维取向后拆卸通道，从而以开放形式直接接触取向纤维。该方法还可进一步拓展，用于构建具有有序COL1基质的模块化微流控微生理系统平台。以下方案详细描述了分段微通道的制备过程，并阐述了利用该通道实现牛脱端COL1纤维取向的具体操作。此外，本方案还提供了在开放孔格式中于COL1上进行细胞培养的操作指南，并讨论了通过模块化磁性基底层为平台增加功能性的方法。

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方案

1. 双件式通道与模块化平台基座的制备

注意：微流控通道由两部分构成——微流控通道“镂空部分”，该部分使用剃刀从特定厚度的聚二甲基硅氧烷（PDMS）片材上切割而成；以及通道盖，该盖可逆地与镂空部分键合并形成通道。通道周围环绕着聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）框架，该框架可作为培养基储液池（图1）。PMMA框架还可用于磁性卡接具有附加功能的专用模块。

  1. 使用剃刀从PDMS板材切割微通道：
    注意：本步骤的微流控通道设计见补充图1。该通道由五个长度均为5 mm的区段组成，宽度分别为10 mm、5 mm、2.5 mm、1.25 mm和0.75 mm。当通道宽度减小时，以恒定流速（50–400 µL·min−1）注入的胶原蛋白溶液在通道内的局部流速增加，从而产生拉伸流动。
    1. 将一张厚度为250 µm的PDMS板材固定在塑料载片上，使用手工切割刀以0.5 mm的刀深、1 cm·s−1的速度和高力度进行微流控结构的剃刀切割。
    2. 将切割出的微流控通道置于超声波清洗仪中清洗5分钟，随后用去离子水（DI水）冲洗超声处理后的通道，并在洁净的加热板上于100 °C干燥5分钟。
    3. 将通道存放在洁净、加盖的培养皿中，待用。
  2. 制备PDMS盖片及表面钝化：
    注意：第1.1节中切割出的通道需要一个盖片，覆盖其上以形成封闭通道，用于注入COL1溶液（见补充图1）。在COL1自组装完成后，可将盖片移除。为减少通道内COL1与盖片结合的可能性，需使用牛血清白蛋白（BSA）对盖片进行钝化处理。PDMS盖片的模具设计已提供。模具厚度至少为2 mm，其底面尺寸应与微流控通道切口的底面尺寸一致。本方案中，模具底面尺寸为35 mm × 15 mm。
    1. 准备模具时，将一张压敏胶（PSA）薄膜粘附于一张厚度为2.5 mm的PMMA板材上，并用激光切割出所需模具形状。
    2. 用湿润的无尘布清洁激光切割后的PMMA模具，并揭去PSA薄膜的背衬。将模具用力压紧在直径为100 mm的硅晶圆上。
    3. 按10:1（基础剂：交联剂）的比例配制PDMS，剧烈混合1分钟以确保充分混合，随后在真空腔中脱气以去除气泡。
    4. 将脱气后的PDMS溶液倒入PMMA/硅模具中，在加热板上100 °C条件下固化20分钟。待模具冷却后，取出固化的PDMS，并用剃刀修去多余部分。
      注意：确保在后续所有步骤中，PDMS盖片的硅晶圆接触面（平整面）始终朝上。
    5. 使用直径为1 mm的活检打孔器，在盖片上打出与微流控通道两端对应的进样口和出样口。第1.1步中切割出的通道切口可作为模板，用于指导打孔位置。
    6. 将盖片在异丙醇（IPA）中超声处理5分钟，用DI水冲洗，压缩空气吹干，然后存放在洁净、加盖的培养皿中。将培养皿放入紫外灭菌箱中（不加盖），照射1分钟以灭菌。
    7. 盖上培养皿并转移至生物安全柜（BSC）中。
    8. 用移液器将300 µL浓度为40 mg•mL-1的牛血清白蛋白（BSA）溶液加入1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，滴加至PDMS盖片表面，并用移液器吸头将溶液均匀涂布。置于4 °C冰箱中至少4小时，待用。
    9. 将盖片从冰箱中取出并转移至BSC中，用1× PBS洗涤5次，静置于空气中干燥10分钟。
      注意：PDMS盖片在BSA包被后可在冰箱中保存最多1周。
  3. 盖玻片的戊二醛处理
    注意：使用戊二醛对盖玻片进行功能化处理，可使COL1通过共价键结合于盖玻片表面，防止水凝胶脱落。
    1. 在玻璃烧杯中配制2%（v/v）的3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）溶液：将1 mL APTES加入49 mL丙酮中。
    2. 将25%的戊二醛溶液用DI水稀释至5%。每张24 mm × 50 mm的盖玻片需配制2 mL溶液；对于24 mm × 24 mm或22 mm × 22 mm的盖玻片，每张配制1 mL溶液。
    3. 使用异丙醇（IPA）在超声清洗仪中清洗盖玻片5分钟，随后用DI水冲洗去除IPA。当盖玻片表面形成均匀水膜时，表明IPA已完全冲洗干净。
    4. 在加热板上100 °C条件下干燥盖玻片5分钟。将干燥后的盖玻片放入洁净的培养皿中，确保彼此不重叠。
    5. 使用电晕放电笔对每张盖玻片进行1分钟的电晕放电处理。
      注意：此步骤应在通风良好的环境或化学通风橱中进行。
    6. 在电晕处理后5分钟内，将盖玻片从培养皿中取出并浸入APTES溶液中10秒，确保盖玻片完全浸没。
      注意：务必记录经等离子处理的一侧，并始终保持其朝上。
    7. 随后将盖玻片浸入丙酮中10秒，用压缩空气吹干。将干燥后的盖玻片放回培养皿中，处理面朝上。
      注意：对所有盖玻片重复步骤1.3.5–1.3.7。
    8. 用移液器将1 mL戊二醛溶液滴加至每张盖玻片表面，尽可能覆盖整个表面，避免溶液溢出边缘。必要时可补充更多戊二醛溶液。注意勿用移液器吸头划伤表面。
    9. 让盖玻片与溶液接触30分钟后，用DI水冲洗20秒。用压缩空气吹干，并将盖玻片放回培养皿中，等离子处理面朝上。
      注意：盖玻片可在室温（RT）下保存最多1周。
  4. 激光切割模块化磁性底座
    注意：模块化磁性底座的设计见补充图1。该模块化底座可作为容纳培养基的腔室，也可用于通过磁力连接特定功能模块，如先前发表的研究22,37,38,39中所述。
    1. 使用适当的激光参数（如扫描次数和功率）从PMMA层切割出设计结构。
      注意：应调整激光参数，使磁体能够压入PMMA层中。不同激光设备参数不同，需通过实验优化切割参数。对于45 W激光器，建议使用100%速度、100%功率，扫描3次以切割2 mm厚的PMMA板材。
    2. 用肥皂水清洗激光切割部件，以去除激光加工过程中产生的碎屑。
      注意：请勿使用溶剂清洗激光切割部件，溶剂可能导致激光切割边缘微裂纹扩展。
  5. 组装平台
    1. 用手将磁体（直径3/16英寸，厚度1/16英寸）压入激光切割的底座中。可使用软锤或螺丝刀末端辅助压入磁体。磁体厚度必须小于PMMA底座厚度，以确保磁体与底座表面齐平。
      注意：磁体可使用户通过附加模块扩展平台功能。
    2. 揭去PSA薄膜的背衬，将底座粘附于经戊二醛处理的盖玻片上，功能化面朝上。
    3. 将PDMS通道切口轻轻放入由框架定义的空腔中，用宽头镊子轻压以排除气泡并确保紧密贴合。
    4. 将经BSA处理的PDMS盖片置于通道切口上方，BSA处理面朝下。确保流体进样口和出样口与通道对齐。
    5. 装置现已准备就绪，可用于COL1溶液的注入。

2. 将COL1溶液注入微通道并移除盖子以用于细胞培养应用

  1. 准备 COL1 溶液
    1. 将所有所需试剂（COL1 储备液 [6 mg·mL−1]、超纯水、10x PBS、0.1 M NaOH）置于生物安全柜中的冰上。
    2. 按以下方式计算试剂体积
      胶原稀释方程：所需体积 = （终浓度 × 终体积）/ 储备浓度。
      化学稀释方程，0.1 M NaOH 体积计算，实验设置。
      实验室实验设置中 10x PBS 稀释的体积计算公式。
      PBS 溶液制备中超纯水的计算公式，显示终体积相减方程。
      注：因此，从 6 mg·mL−1 储备液制备 1 mL 浓度为 2.5 mg·mL−1 的中和胶原，需加入 416.67 µL 胶原、429.16 µL 去离子水、100 µL 10x PBS 和 54.16 µL 0.1 M NaOH，以获得终 pH 7。加入 20 µL 0.1 M NaOH 可达到 pH 9.0。
    3. 按以下顺序将试剂加入一个空的 5 mL 小瓶中：i) COL1 储备液，ii) 去离子水，iii) 10x PBS，iv) 0.1 M NaOH。
      注：使用排液式移液器处理 COL1 溶液。若使用普通移液器，可能导致显著样品损失，从而引起终溶液浓度波动。
    4. 将溶液 pH 调至所需值（通常为 7–9 之间）。
  2. 注射 COL1 溶液
    1. 将注射泵、预冷的无菌注射器、预冷的中和 COL1 溶液以及无菌 20 G 90˚ 角度 Luer 锁定针头放入生物安全柜中。将 COL1 溶液装入注射器，注意避免引入气泡。
    2. 将 90˚ 20 G 针头连接至注射器，将注射器装入注射泵，针头朝下，并用 COL1 溶液预冲洗针头。
    3. 将注射泵设置为所需的流速，介于 50–2,000 µL/min 之间。
    4. 将已制备的 PDMS 通道（第 1 节）置于实验升降台（lab jack）上，并与针头对齐。
    5. 将针头插入 PDMS 通道的入口端口（宽侧），注射至出口端出现约 30 µL 的 COL1 液滴。
    6. 降低实验升降台，轻柔地将针头从已填充的通道中分离。
    7. 重复步骤 2.2.5–2.2.9，直至所有通道均被 COL1 溶液填充。
    8. 将已填充的通道连同浸透去离子水的洁净无绒擦拭布一起放入培养皿中，以防止新形成的 COL1 凝胶脱水。
    9. 盖上培养皿，并将装载好的通道置于培养箱（37 ˚C，95% 湿度）中孵育 2 小时，再进行剥离步骤。
  3. 剥离及培养基平衡
    1. 用镊子揭去 PDMS 覆盖层，暴露出已聚合的 COL1 凝胶。BSA 处理可防止 COL1 附着于覆盖层。
    2. 向孔中加入 650 µL EGM 培养基。
    3. 将装置置于培养箱（37 ˚C，95% 湿度）中至少孵育 4 小时，以平衡凝胶与培养基。在接种细胞前更换培养基。
  4. 接种细胞
    1. 将预热的 0.25% 胰蛋白酶和培养基，以及所需数量的 5 mL 和 10 mL 移液管放入生物安全柜中。
    2. 在内皮细胞生长培养基（EGM）中，于 37 ˚C、95% 湿度条件下培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs），直至达到 80% 汇合度。在显微镜下检查汇合度后，将含 HUVECs 的组织培养瓶放入生物安全柜中。
    3. 弃去 T25 培养瓶中的培养基，用 1x PBS 洗涤细胞 2 次。向瓶中加入 1 mL 胰蛋白酶，并置于培养箱（37 ˚C，95% 湿度）中孵育 3 分钟。
    4. 3 分钟后在显微镜下检查培养瓶，确保细胞已完全从表面脱离。
    5. 向瓶中加入 3 mL 含血清的 EGM 以中和胰蛋白酶。随后，使用 5 mL 移液管将细胞悬液转移至 15 mL 锥形管中。在 150 xg 条件下离心 5 分钟。
    6. 将锥形管置于生物安全柜中，弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。用 1 mL 新鲜培养基重悬细胞。
    7. 在 1 mL 锥形管中加入并混合 15 µL 台盼蓝和 15 µL 重悬的细胞悬液。
    8. 将台盼蓝与细胞悬液分别加入细胞计数板两侧，然后将计数板插入细胞计数仪中。
    9. 根据细胞计数仪测得的细胞浓度，用内皮细胞生长培养基将细胞悬液稀释至所需浓度。
      注：一个 80% 汇合度的 T25 培养瓶中的 HUVECs，若用 1 mL 培养基重悬，可获得约 750,000 个细胞·mL−1。接种细胞悬液的体积计算公式为：培养表面积 × 细胞密度 / 细胞悬液浓度。示例：在 35 mm × 15 mm 的孔中接种 20,000 个细胞·cm−2，需要约 140 µL 细胞悬液。
    10. 吸除工程化 COL1 基质上的培养基。
    11. 将所需体积的细胞悬液加入 COL1 基质上，静置至少 4 小时后再进行成像。
  5. 标记细胞核与细胞骨架
    1. 吸除细胞上的培养基，用 1x PBS 洗涤 3 次，每次 500 µL。室温下用 4% 多聚甲醛覆盖细胞层固定 15 分钟。
    2. 吸除多聚甲醛，用 1x PBS Tween-20 洗涤 5 分钟。
    3. 使用 500 µL 含 0.1% Triton-X 的 PBS 溶液对细胞膜进行通透处理 15 分钟。再用 1x PBS Tween-20 洗涤 5 分钟。
    4. 室温下用 500 µL 含 4% BSA 的 PBS 封闭非特异性结合位点 30 分钟。
    5. 将鬼笔环肽-肌动蛋白荧光标记液用 4% BSA 稀释（1 µL 原液加入 400 µL BSA 中）。
    6. 吸除 BSA 溶液，加入鬼笔环肽溶液，室温孵育 30 分钟。
    7. 将核染料用 4% BSA 稀释（1 µL 加入 500 µL），吸除鬼笔环肽溶液，加入工作浓度的核染料溶液，室温孵育 15 分钟。
    8. 吸除核染料工作液，用 PBS Tween-20 洗涤 3 次，每次 5 分钟，成像前更换为 1x PBS。
    9. 使用落射荧光显微镜，配备 FITC 通道（激发 491 nm/发射 516 nm）和 DAPI 通道（激发 360 nm/发射 460 nm），采用 40x 物镜进行成像。使用激光扫描共聚焦显微镜，在反射模式下，采用 488 nm 激光线（15% 功率）和 40x 水浸物镜对胶原进行成像。

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结果

当自组装的 COL1 溶液流经横截面积逐渐减小的通道时，COL1 溶液的流向速度（vx）在两个区段之间的狭窄区域沿流动方向（∂x）局部增加一个量值 ∂vx，从而产生拉伸应变率（ε̇），其中 ε̇ = ∂vx/∂x。该拉伸应变率可通过测量流体速度计算得到，流体速度采用粒子图像测速法（PIV）进行测量，如图2所示。

先前研究表明，局部拉伸应变可促进长程 COL1 纤维的定向排列37,38,40 (图3）。Col1 的排列方向直接受缩窄区域拉伸应变率大小的影响，并可在该段5 mm长度范围内观察到均匀延伸。为测量纤维排列程度，采用共聚焦反射显微镜（CRM）获取纤维图像，并据此生成纤维取向角度的直方图。排列系数（CoA）定义...

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讨论

已有研究描述了利用磁性方法、直接施加机械应变以及微流控技术制备具有定向纤维的COL1基质的实验方案47。由于微流控方法具有明确的流动和传质特性，可实现对生化微环境的精确控制，因此常被用于构建微生理系统。由于定向排列的COL1纤维在伤口愈合、肿瘤细胞侵袭和组织发育等病理生理过程中提供关键的指导性信号，因而在微流控系统中构建定向COL1基质是迈向开发具有生物学相关性微生理系统的重要一步。

本方案能够制备具有特定纤维取向区域的毫米级、取向排列的I型胶原（COL1）基质。为诱导纤维取向，采用宽度呈阶梯式减小的微流控通道。当自组装的COL1溶液以恒定流速流经通道时，在收缩区域溶液流速增加，从而产生局部拉伸应变，促使自组装的COL1纤维实现长程有序排列。与剪切流诱导的纤维取向相比，我们观察到在厚度高达250 µm的通道中仍可实现纤维取向，使我们能够在微流控通道内构建三维水凝胶。由于COL1纤维的取向依赖于拉伸应变率，使用者可修改所提供的通道结构或设计定制化的通道，以产生拉伸流动，制备所需尺寸和形状的COL1基质。此外，通道采用无需软光刻技术的方法...

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披露

所有作者均声明无竞争利益。

致谢

本工作部分由美国国立卫生研究院资助，资助编号为 R21GM143658，以及由美国国家科学基金会资助，资助编号为 2150798。本内容仅由作者负责，不一定代表资助机构的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，99%（APTES）Sigma Aldrich440140-100ML
20 号 IT 系列斜角分配吸头Jensen GlobalJG-20-1.0-90
3/16" 直径 1/16 英寸" 厚镍镀层磁铁KJ MagneticsD31
3M (TC) 12X12-6-467MPDigiKey3M9726-ND
ACETONE ACS REAGENT ≥99.5%Sigma Aldrich179124-4L
BD-20AC 实验室电晕处理仪Electro-Technic Products12051A
牛血清白蛋白（BSA），第五组分，98%，试剂级，Alfa AesarVWRAAJ64100-09
透明浇铸亚克力板McMaster-Carr8560K181
Corning 100 mL 胰蛋白酶 10 倍浓缩液，含 2.5% 胰蛋白酶（HBSS 配制，不含钙、镁和酚红），经检测无猪细小病毒VWR45000-666
Countess II 自动细胞计数仪赛默飞世尔科技AMQAX1000
CT-FIRE 软件LOCI - 威斯康星大学
EGM-2 内皮细胞生长培养基-2 BulletKit（CC-3156） & CC-4176)，Lonza CC-3162，500 mLLonzaCC-3162
50% 戊二醛水溶液，试剂级，包装=高密度聚乙烯瓶，规格=100 mLVWRVWRV0875-100ML
Graphtec CELITE-50GraphtecCE LITE-50
HEPES (1 M)赛默飞世尔科技15-630-080
高纯度硅橡胶，0.010英寸" 厚，6" X 8" 片材，55A 邵氏硬度McMaster-Carr87315K62
人脐静脉内皮细胞赛默飞世尔科技C0035C
Invitrogen 0.4% 台盼蓝染色液赛默飞世尔科技T10282
异丙醇Fisher ScientificA4154
激光切割机全光谱20x12 H系列
微流控注射泵新型注射泵NE-1002X
Microman E 单通道移液器，Gilson，型号 M1000EGilsonFD10006
Molecular Probes Alexa Fluor 488 鬼笔环肽赛默飞世尔科技A12379
Molecular Probes Hoechst 33342，三盐酸盐，三水合物赛默飞世尔科技H3570
Nutragen 牛脱端胶原蛋白Advanced BioMatrix5010-50ML
PBS（10倍浓度），pH 7.4VWR70011044.00
PBS pH 7.4赛默飞世尔科技10010049.00
含吐温-20的磷酸盐缓冲液（PBS，10倍浓缩液）Alfa AesarJ63521
graphtec 手工 ROBO CC330L-20 替换载纸板USCUTTERGRPCARSHTN
Restek Norm-Ject 塑料注射器 1 mL 鲁尔滑动接头Restek22766.00
硅片大学晶圆452
氢氧化钠，ACS级，包装=聚乙烯瓶，规格=500 gVWRBDH9292-500G
Sylgard 184VWR102092-312
赛默飞世尔科技 Pierce 20x PBS Tween 20赛默飞世尔科技28352.00

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