评估小鼠卵母细胞中纺锤体组件检查点完整性

Summary

染色体分离错误是卵母细胞的常见特征。因此，研究纺锤体组装检查点为生产健康卵子所需的机制提供了重要线索。本协议描述了三种互补测定，以评估小鼠卵母细胞中的纺锤体组装检查点完整性。

Abstract

非整倍性是导致人类早期流产和妊娠失败的主要遗传异常。导致非整倍性的染色体分离中的大多数错误发生在卵母细胞减数分裂期间，但为什么卵母细胞减数分裂容易出错仍然不完全清楚。在细胞分裂过程中，细胞通过激活纺锤体组装检查点（SAC）来防止染色体分离错误。这种控制机制依赖于检测动粒（KT）-微管（MT）附着和感应纺锤纤维产生的张力。当KT未连接时，SAC被激活并阻止细胞周期进程。SAC首先由MPS1激酶激活，MPS1激酶触发由MAD1，MAD2，BUB3和BUBR1组成的有丝分裂检查点复合体（MCC）的募集和形成。然后，MCC 扩散到细胞质中并螯合 CDC20，这是一种促进后期的复合物/环小体 （APC/C） 激活剂。一旦KT附着在微管上并且染色体在中期板上对齐，SAC被沉默，CDC20被释放，APC / C被激活，触发细胞周期蛋白B和Securin的降解，从而允许后期发作。与体细胞相比，卵母细胞中的SAC并不那么有效，因为尽管具有未连接的KT，但细胞仍可能经历后期。 了解为什么SAC更宽容，以及这种允许性是否是卵母细胞染色体分离错误的原因之一，仍然需要进一步研究。本协议描述了全面评估小鼠卵母细胞中SAC完整性的三种技术。这些技术包括使用诺考达唑解聚 MT 以评估 SAC 反应，通过跟踪 Securin 破坏的动力学来跟踪 SAC 沉默，以及通过免疫荧光评估 MAD2 募集到 KT。这些技术一起通过提供对SAC完整性的完整评估来探索生产健康卵子所需的机制。

Introduction

由染色体分离错误引起的非整倍性是早期流产的主要原因，与减数分裂的错误高度^相关1。减数分裂与有丝分裂不同，因为它由两轮细胞分裂组成，没有干预DNA复制步骤。在减数分裂I中，同源染色体分离，而姐妹染色单体保持在一起。在卵母细胞中，此步骤容易出错，导致非整倍体卵子产生²。

为了防止染色体分离错误，大多数细胞类型会激活一种暂停细胞周期的监视机制，称为纺锤体组装检查点（SAC）。这种机制感测动粒（KT）-微管（MT）附着，当染色体以双极方式定向时产生张力³。未连接的动粒体触发 SAC 反应，该反应从 MPS1（SAC 的主调节因子）募集到动粒^3，4 开始。MPS1 启动其他 SAC 组件的募集，充当形成有丝分裂检查点复合体 （MCC） 的平台。MCC 由 MAD1、MAD2、BUB3 和 BUBR1 组成，通过隔离其激活剂 CDC20 扩散到细胞质中并抑制 APC/C 活化。一旦所有动粒稳定地附着在MT上并且染色体在中期板上对齐，SAC被沉默，MCC分解并释放CDC20，从而允许APC / C激活。活性APC/C降解Securin和细胞周期蛋白B，这是触发后期发病的两个关键步骤5^，6。在体细胞中，SAC是严格的，因为它由单个未连接的动粒激活，并且足以诱导细胞周期停滞⁶。然而，在卵母细胞减数分裂期间，SAC更宽松，卵母细胞可以通过一个或多个未连接的动粒进入I期6，⁷，⁸，^9，10。了解为什么SAC在卵母细胞中更宽容是该领域持续关注的领域。导致SAC活化或SAC沉默缺陷的机制可能导致染色体分离错误或延长的细胞周期停滞和细胞死亡。因此，评估维持卵母细胞中SAC完整性的机制对于理解形成健康整倍体卵子的过程非常重要。

该协议描述了通过检查检查点的不同关键步骤来全面评估小鼠卵母细胞减数分裂中SAC完整性的技术。首先，描述了诱导SAC激活后SAC反应的评估。这种激活是通过使用诺考达唑（一种解聚^{MTs 11}的药物）产生未连接的动粒来实现的。其次，通过跟踪卵母细胞成熟过程中Securin降解的动力学来描述监测SAC沉默的方法。最后，采用基于免疫荧光的测定法来测量MAD2（MCC组分之一）对动粒的募集。总之，这些测定全面评估卵母细胞减数分裂成熟过程中的SAC完整性。

Protocol

这些协议中使用的所有小鼠均根据罗格斯大学机构动物使用和护理委员会（协议201702497）和美国国立卫生研究院指南进行饲养和饲养。这些监管机构批准了所有涉及动物研究的实验程序。本研究中使用的所有小鼠均为6-8周龄的CF-1雌性。

1. 实验准备

1. 在开始SAC评估之前，按照先前发表的报告收集小鼠卵母细胞¹²。将收集的卵母细胞分成三个大小均匀的组，并将它们保存在含有2.5μM米力农的Chatot，Ziomek和Bavister（CZB）培养基中（参见 材料表），以避免减数分裂恢复¹³。
   注意:CZB 组成:81.6 毫米氯化钠;4.8毫米氯化钾;1.2 毫米千米₂PO₄;1.2 毫米镁硫_4-7小时₂盎司;0.27 mM 丙酮酸;1.7毫米氯化钙₂;30.8 mM DL-乳酸;7毫米牛磺酸;0.1毫米乙二胺四乙酸;25 毫米氢氧化钠₃;庆大霉素;和0.3%的BSA。
2. 如前所述制备用于显微注射的cRNA12^，14。从小鼠生发囊泡卵母细胞克隆的cDNA中扩增小鼠Securin基因，然后亚克隆到含有Gfp序列^15，16的pMDL2载体中。
   1. 为了制备Securin-Gfp cRNA，用Nde I酶切线性化质粒。通过使用 T3 RNA 聚合酶和纯化 cRNA¹⁶ 进行体外转录。
      注意:将cRNA以2-3μL的等分试样在-80°C下储存直至使用。

2. 诺考达唑治疗和活体成像

1. 制备 1 mL 含有 5 μM 诺考达唑 （NOC） 的培养基 （CZB）、1 mL 含有 5 μM NOC 和 0.5 μM 逆转因子 （NOC + REV） 的培养基和 1 mL 含有二甲基亚砜 （DMSO） （1:2000） 的培养基作为对照（参见 材料表）。
2. 对于卵母细胞成熟和活体成像，请使用在培养箱中以37°C，5%CO₂和80%湿度预热的96孔板。在第一个孔中，加载150μL对照DMSO处理;在第二个孔中，上样 150 μL NOC 处理;在第三个孔中，加载 150 μL NOC + REV 处理。将板保持在与上述相同的条件下的培养箱中，直到需要为止。
   注意:在96孔板中，避免使用第一行和第一列，因为边框的阴影会干扰图像的质量。
3. 要开始减数分裂成熟，请去除米力农。在立体显微镜下使用30x-64x放大倍数观察卵母细胞时，通过六滴含有DMSO的100μL无米力农培养基依次转移卵母细胞，将它们放入96孔板的相应孔中，将它们从培养基中洗出米力农使用手动或嘴操作移液管。
   1. 通过使用手动或口腔操作的移液管拾取卵母细胞并将它们运送到下一滴以避免丢失任何卵母细胞来计数卵母细胞。卵母细胞是单个，大（直径~80μm）和圆形细胞。细胞核在细胞中心看起来像一个按钮，膜和透明带包围着卵母细胞。
      注意:在滴剂之间转移卵母细胞，同时移动尽可能少量的液体。这允许从培养基中以最佳方式去除米力农。如果卵母细胞未能恢复减数分裂，则很可能是米力农没有被有效去除。
4. 对NOC和NOC + REV处理重复相同的过程（步骤2.3）。
5. 在以下条件下，使用配备有培养箱室的明场显微镜对卵母细胞进行成像，在受控环境中:37°C，5%CO₂和80%湿度。以20分钟的间隔在卵母细胞的中间平面捕获图像24小时。
6. 通过鉴定经历不对称细胞分裂的细胞来量化挤出极体 （PB） 的卵母细胞数量。结果将是卵子旁边和共享透明带内的一个小细胞（PB）。使用成像软件查看图像（ImageJ，请参阅 材料表）。
7. 将图像序列导入图像分析软件并推进帧，直到一个或多个细胞经历不对称细胞分裂。计算挤出PB的卵母细胞占卵母细胞总数¹⁷的百分比。

3. 监测减数分裂成熟过程中Securin-gfp降解的模式

1. 在4°C¹⁸下以19，283×g离心3μLSecurin-Gfp cRNA（步骤1.2）30分钟。
   注意:使用上清液以避免在显微注射过程中加载可能导致针头堵塞的杂质。
2. 遵循分步卵母细胞显微注射，详见参考^文献12。在步骤1.2中制备的具有100ng / μLSecurin-gfp cRNA的微注射期I期I-阻滞卵母细胞。
3. 显微注射后，让卵母细胞在CO₂ 培养箱中恢复并翻译RNA至少3小时。通过在自动多通道荧光成像系统（参见 材料表）中观察卵母细胞来检查表达以查看GFP信号。
4. 如步骤2.2中所述，在96孔板的三个不同孔中加载150μL含有或不含有5μM诺考达唑的培养基和150μL含有0.5μM逆转的培养基。
5. 通过六滴无米力农培养基洗涤显微注射的卵母细胞，并将1/3的卵母细胞转移到每次治疗中。
6. 将板保持在培养箱中，温度为37°C，湿度为5%CO₂ 和80%，直到卵母细胞恢复减数分裂，米力农洗涤后约3小时。
   注意:使用放大倍数在30x-64x之间的体视显微镜来评估核包膜分解作为减数分裂恢复的标志。
7. 如步骤2.6所述，使用配备有培养室的荧光显微镜记录卵母细胞成熟的图像。使用明场设置查找孔中的卵母细胞。使用488滤光片检测Securin-gfp信号并调整荧光强度以避免细胞过度曝光。
   1. 如果成像系统是自动化的，则在每个孔中保存卵母细胞的位置。由于Securin-gfp均匀分布在细胞质中，因此以20分钟的间隔捕获卵母细胞中间平面的图像，持续24小时。要在一张图片中捕获卵母细胞组，请使用较低放大倍率的物镜，例如10倍。
8. 使用图像分析软件量化 Securin-gfp 破坏。打开 GFP 频道的图像。从时间点 1 开始。在首选的分析软件中，使用选择或形状工具标记每个卵母细胞并为每个细胞生成感兴趣区域（ROI）。
   1. 使用相同的 ROI 选择要稍后减去的背景区域。测量每个ROI中的GFP像素强度。
9. 使用步骤3.8中产生的每个卵母细胞的ROI，测量所有时间点的GFP强度。
   注意:在某些软件程序中，"分析"选项卡允许选择测量功能。
   1. 然后，前进到下一个时间范围并重复此过程以测量每个时间范围内的GFP强度。最后，对于每个GFP值，减去步骤3.8中选择的背景ROI的测量值。该分析将给出每个时间点每个卵母细胞的Securin-gfp强度值。
10. 从Securin破坏模式中提取不同的参数:（a）Securin-gfp降解开始的时间。这说明 SAC 静默何时开始;（b） Securin-GFP最小信号的时间。这说明SAC沉默何时降至阈值水平以下，以允许高APC / C活化和完全Securin-GFP降解;（c） Securin-GFP销毁率¹⁹.这说明了SAC活性降至APC / C活化和Securin-GFP降解的阈值水平以下的速度。

4. 减数分裂成熟过程中通过免疫荧光在动粒上募集MAD2

注意:有关卵母细胞的收集和成熟，请参阅先前发表的报告¹²。

1. 将卵母细胞分成三组。将每组卵母细胞转移到 100 μL 滴无米力农培养基中。用矿物油覆盖液滴，并将它们放入培养箱（37°C，5%CO₂和80%湿度）中3小时，5小时和7小时，分别达到早期中期I，晚期中期I和中期I期。
   注意:将每个时间点放在不同的培养皿中，以避免多次从培养箱中取出相同的培养皿，这会影响减数分裂成熟的正常时间。
2. 在指定的时间点，通过将卵母细胞转移到 1x PHEM 缓冲液中的 500 μL 2% PFA 滴剂中，在室温下固定卵母细胞 20 分钟，使用 9 孔玻璃培养皿如前所述²⁰。然后，将细胞转移到含有 500 μL 封闭溶液（PBS + 0.3% BSA + 0.01% 吐温-20 + 0.02% NaN₃）的干净孔中。
   注意:PHEM 成分:60 mM 管道;25毫米HEPES;10毫米埃格塔;和 2 毫米氯化镁₂.
   注意:此时可以停止并将卵母细胞储存在4°C的9孔板中的封闭溶液中，直到方便的时间完成免疫荧光。
3. 为了继续MAD2检测，将卵母细胞转移到含有500μL透化溶液（PBS + 0.3%BSA + 0.1%TritonX-100 + 0.02%NaN₃）的干净孔中。在室温下孵育20分钟，然后将细胞转移到封闭溶液的新孔中并孵育10分钟。
4. 对于其余的免疫荧光步骤，使用带有压痕的96孔培养皿盖，如前所述²⁰。使用加湿的暗室以避免光照和蒸发。将卵母细胞转移到含有抗MAD2抗体（1:1000，兔）和抗着丝粒抗体（ACA）（1:30，人）（参见 材料表）的30μL封闭溶液中，并在室温下孵育2小时。
   注意:96孔培养皿盖为同时处理多种蛋白质和基团提供了空间。
5. 为了洗涤多余的一抗，将细胞转移到补充有0.5%Triton的30μL滴1x PHEM缓冲液中，并在加湿室中孵育10分钟。再重复此步骤两次。
6. 进行第四次洗涤，将细胞转移到不含0.5%1x Triton的30μL滴1x PHEM缓冲液中，并孵育10分钟。
7. 将细胞转移到含有抗人-633（1:200）和抗兔-568（1:200）（参见 材料表）等二抗的30μL封闭溶液中，并在室温下孵育1小时。
   注意:根据您的显微镜激光器或滤光片选择荧光团的组合。
8. 要清洗多余的二抗，请重复步骤4.5-4.6。
9. 要将细胞安装在显微镜载玻片上，将细胞转移到含有DAPI（0.1 mg/mL）的10 μL封片剂中（参见 材料表）。在盖玻片的每个角添加小点凡士林，小心地将它们放在安装介质滴的顶部，然后慢慢按压以分布。使用透明的指甲油将盖玻片密封在载玻片上。有关安装过程的更详细说明，请参阅参考^{文献 20}。
10. 使用配备40x或63x物镜的共聚焦显微镜（参见 材料表）对电影进行成像。使用 ACA 信号，确定允许对整个染色体区域进行成像的 z 范围。
    注意:在某些成像系统上可以使用 4.0 的光学变焦和 0.5 μm 的 z 步长。这些参数可能因系统而异，因此需要进行优化。
11. 使用图像分析软件分析动粒处的MAD2强度。进行 z 堆栈最大投影，然后拆分通道。
12. 首先，通过选择 ACA 通道来使用 ACA 通道创建掩码，以建立识别所有动粒信号的阈值。转到 编辑 选项卡并创建选择。然后，使用此选择创建 ROI。
13. 选择 MAD2 通道并引入在步骤 4.12 中创建的选择。选择一种能更好地适应MAD2信号的阈值方法。测量强度。
    注意:在对照处理中选择阈值方法，并在分析不同处理时保持恒定。
14. 要进行相对像素强度计算，请将每个细胞的强度除以实验中WT卵母细胞的平均强度。

Results

诺考达唑治疗对SAC反应性的评估
该实验的目的是评估SAC的活化和强度。通过使用诺考达唑解聚纺锤体微管，所有动粒都将不连接，这将导致SAC介导的细胞周期停滞。在目前的成像系统中，DMSO处理的对照卵母细胞在从米力农释放后约14小时挤出极性体（图1，上图）。与SAC活化一致，诺考达唑处理的卵母细胞在中期I期被捕，并且没有挤出极性体（图1，中间图）。为了证明该测定是SAC活性的可靠指标，使用MPS1抑制剂逆转来防止SAC活化²¹。当SAC无法激活时，尽管没有KT-MT附着，卵母细胞仍挤出极性体（图1，底板）。具有弱化SAC的卵母细胞将具有混合结果 - 一些卵母细胞停滞和一些挤出极性体¹⁷。这种使用和不使用诺考达唑的成熟小鼠卵母细胞的方法可用作挑战SAC活化的第一步和简单步骤。

Discussion

纺锤体组件检查点是细胞分裂过程中的关键控制机制，旨在防止染色体分离错误。它允许细胞有足够的时间来纠正不正确的 KT-MT 附着。卵母细胞减数分裂是一个容易出错的过程，其中大部分染色体错误分离发生在减数分裂I期间，导致非整倍体卵子的产生，^{这是人类早期}流产和不育的主要原因1^，24。正在测试几个假设，以解开为什么女性减数分裂有错误。一个潜在的原因是SAC的效率低于体细胞，并且允许一个或多个错误连接的KTs9，^10，25的后期发作。因此，需要对卵母细胞中的SAC机制进行全面研究并确定关键调节因子，以了解产生整倍体卵的过程。

本协议描述了三种技术来评估SAC完整性的不同方面:激活和沉默。由于这些测定中的每一种在解释上都有一定的局限性，因此仅进行一种不足以表征卵母细胞中的SAC功能。因此，建议...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
牛血清白蛋白 （BSA）	Sigma	A4503
DAPI	Life Technologies	D1306
二甲基亚砜 （DMSO）	Sigma	D5879
驴抗兔 Alexa-568	Life Technologies	A10042
EVOS FL 自动成像系统	Life Technologies		荧光显微镜
EVOS 台式培养箱	Life Technologies		培养箱
玻璃底 96 孔板 N 1.5 未涂层	MatTek Corporation	P96G-1.5-5-F
山羊抗人 Alexa-633	Life Technologies	A21091
HEPES	Sigma	H3537
人抗 ACA	抗体 掺入	15-234	稀释度 1/30
ImageJ	NIH
KCl	Sigma	P5405
KH2PO4	Sigma	P5655
徕卡 SP8 配备 63×、1.40 NA 油浸物镜	徕卡
MgSO4·7H20	Sigma	M7774
米力农	Sigma	M4659
Na2HPO><4	Sigma	S2429
氯化钠	Sigma	S5886
NaN3	Sigma	S2002
诺考达唑	Sigma	M1404
多聚甲醛 （PFA）	Sigma	P6148
PIPES	Sigma	P6757
兔抗 MAD2	Biolegend	924601	稀释 1/1000;以前为 Covance #PRB-452C
Reversine	Cayman Chemical	10004412
Triton-X	Sigma	274348
Tween-20	Sigma	X100
Vectashield	Vector 实验室	H-1000