小鼠卵母细胞中纺锤体组装检查点完整性的评估

摘要

染色体分离错误是卵母细胞中的常见现象。因此，研究纺锤体组装检查点可为产生健康卵子所需的机制提供重要线索。本方案描述了三种互补的检测方法，用于评估小鼠卵母细胞中纺锤体组装检查点的完整性。

摘要

非整倍体是导致人类早期流产和妊娠失败的主要遗传异常。大多数导致非整倍体的染色体分离错误发生在卵母细胞的减数分裂过程中，但目前尚不完全清楚为何卵母细胞的减数分裂容易出错。在细胞分裂过程中，细胞通过激活纺锤体组装检查点（SAC）来防止染色体分离错误。这一调控机制依赖于对动粒（KT）-微管（MT）连接的检测以及对纺锤体纤维所产生的张力的感知。当动粒未与微管连接时，SAC被激活，从而阻止细胞周期的进程。SAC首先由MPS1激酶激活，进而触发有丝分裂检查点复合物（MCC）的招募和形成，该复合物由MAD1、MAD2、BUB3和BUBR1组成。随后，MCC扩散至细胞质中并结合CDC20，即后期促进复合物/环体（APC/C）的激活因子。一旦动粒与微管连接且染色体排列在中期板上，SAC即被沉默，CDC20被释放，APC/C被激活，从而引发Cyclin B和Securin的降解，促使细胞进入后期。与体细胞相比，卵母细胞中的SAC功能较弱，因为即使存在未连接的动粒，细胞仍可进入后期。目前仍需进一步研究以明确SAC为何更具宽容性，以及这种宽容性是否是导致卵母细胞染色体分离错误的原因之一。本实验方案描述了三种用于全面评估小鼠卵母细胞SAC完整性的技术。这些技术包括使用诺考达唑（nocodazole）解聚微管以评估SAC反应，通过监测Securin降解的动力学来追踪SAC的沉默过程，以及通过免疫荧光检测MAD2在动粒上的招募情况。这些技术共同提供了对SAC完整性的全面评估，有助于深入理解产生健康卵子所需的关键机制。

引言

非整倍体由染色体分离错误引起，是早期流产的主要原因，并与减数分裂过程中的错误高度相关¹。减数分裂不同于有丝分裂，因其包含两次细胞分裂，而其间无DNA复制步骤。在减数分裂I中，同源染色体分离，而姐妹染色单体仍保持在一起。在卵母细胞中，该步骤容易出错，导致产生非整倍体卵子²。

为防止染色体分离错误，大多数细胞类型会激活一种称为纺锤体组装检查点（spindle assembly checkpoint, SAC）的监控机制，以暂停细胞周期。该机制可感知动粒（kinetochore, KT）与微管（microtubule, MT）之间的连接状态，并在染色体以双极方式排列时感知由此产生的张力³。未连接微管的动粒会触发SAC反应，该反应始于SAC的主要调控因子MPS1被招募至动粒^3,4。MPS1启动其他SAC组分的招募，作为平台形成有丝分裂检查点复合物（mitotic checkpoint complex, MCC）。MCC由MAD1、MAD2、BUB3和BUBR1组成，可扩散至细胞质中，通过结合并隔离APC/C的激活因子CDC20来抑制APC/C的活化。当所有动粒均稳定连接微管且染色体排列于中期板时，SAC被沉默，MCC解离并释放CDC20，从而允许APC/C被激活。活化的APC/C降解Securin和Cyclin B，这是启动后期（anaphase）的两个关键步骤^5,6。在体细胞中，SAC非常严格，单个未连接的动粒即可激活该检查点，并足以诱导细胞周期停滞⁶。然而，在卵母细胞减数分裂过程中，SAC更为宽松，卵母细胞即使存在一个或多个未连接的动粒，仍可进入减数第一次分裂后期（anaphase I）^6,7,8,9,10。理解为何卵母细胞中SAC更为宽松，是当前研究领域持续关注的重点。导致SAC激活或SAC沉默缺陷的机制，可能引发染色体分离错误，或导致细胞周期长期停滞及细胞死亡。因此，评估维持卵母细胞SAC完整性的机制，对于理解形成健康、整倍体卵子的过程至关重要。

本方案通过检测纺锤体组装检查点（SAC）的不同关键步骤，全面评估小鼠卵母细胞减数分裂过程中SAC的完整性。首先，描述了在诱导SAC激活后评估SAC反应的方法。该激活通过使用诺考达唑（nocodazole）产生未附着的动粒来实现，诺考达唑是一种可使微管（MTs）去聚合的药物¹¹。其次，通过追踪卵母细胞成熟过程中Securin的降解动态，描述了一种监测SAC沉默的方法。最后，采用基于免疫荧光的检测方法，测量MAD2（MCC组分之一）在动粒上的招募情况。上述这些检测方法共同对卵母细胞减数分裂成熟过程中的SAC完整性进行了全面评估。

方案

本研究中使用的所有小鼠均按照罗格斯大学机构动物使用与护理委员会（方案编号 201702497）以及美国国立卫生研究院的指导原则进行饲养和管理。所有涉及动物实验的操作程序均已获得上述监管机构的批准。本研究中使用的小鼠均为 6 至 8 周龄的 CF-1 雌性小鼠。

1. 实验准备

1. 在开始SAC评估之前，按照先前发表的文献报道收集小鼠卵母细胞¹²将收集的卵母细胞均分为三组，置于含有2.5 µM milrinone的Chatot、Ziomek和Bavister（CZB）培养基中培养（参见 材料表以避免减数分裂恢复¹³.
   注意：CZB 成分：81.6 mM NaCl；4.8 mM KCl；1.2 mM KH₂PO₄；1.2 mM MgSO₄₄-7H₂O；0.27 mM 丙酮酸钠；1.7 mM CaCl₂₂；30.8 mM DL-乳酸；7 mM 牛磺酸；0.1 mM EDTA；25 mM NaHCO₃₃；庆大霉素；以及0.3% BSA。
2. 按照先前所述方法制备用于显微注射的cRNA^12,14. 从小鼠生发泡卵母细胞cDNA中扩增小鼠Securin基因，随后亚克隆至含有Gfp序列的pMDL2载体中^15,16.
   1. 为了制备Securin-Gfp cRNA，用Nde I酶切线性化质粒。进行 体外 使用T3 RNA聚合酶进行转录并纯化cRNA¹⁶.
      ​注意：将cRNA以2-3 µL分装，于-80 °C保存至使用。

2. 诺考达唑处理与活细胞成像

1. 准备含有 5 µM 诺考达唑（NOC）的 1 mL 培养基（CZB），另准备 1 mL 含 5 µM NOC 和 0.5 µM 反向素（NOC + REV）的培养基，以及 1 mL 含二甲基亚砜（DMSO）（1:2000）的培养基作为对照（参见材料表）。
2. 用于卵母细胞成熟和活体成像时，使用已在 37 °C、5% CO₂、 80% 湿度的培养箱中预热的 96 孔板。在第一孔中加入 150 µL 的对照 DMSO 处理液；在第二孔中加入 150 µL 的 NOC 处理液；在第三孔中加入 150 µL 的 NOC + REV 处理液。将该 96 孔板置于与上述相同条件的培养箱中，直至使用。
   注意：在 96 孔板中，应避免使用第一行和第一列，因为边缘的阴影会影响图像质量。
3. 为启动减数分裂成熟，需去除米力农。在体视显微镜下以 30x–64x 放大倍数观察卵母细胞，通过将卵母细胞依次转移至六滴含 DMSO 的无米力农培养基（每滴 100 µL）中，洗去原有培养基中的米力农，并使用手动或口控移液器将卵母细胞转移至 96 孔板的相应孔中。
   1. 使用手动或口控移液器逐个吸取卵母细胞并转移至下一液滴，以计数卵母细胞，避免丢失。卵母细胞为单个、较大（直径约 80 µm）、圆形的细胞。细胞核呈中心位置的“按钮”状结构，细胞膜和透明带包裹着卵母细胞。
      注意：在液滴间转移卵母细胞时，应尽量减少液体的携带量，以实现米力农从培养基中的最佳去除。若卵母细胞未能恢复减数分裂，可能是米力农未被有效清除所致。
4. 对 NOC 和 NOC + REV 处理组重复相同操作（步骤 2.3）。
5. 使用配备有环境可控培养室的明场显微镜对卵母细胞进行成像，成像条件为：37 °C、5% CO₂、80% 湿度。在 24 小时内，每隔 20 分钟采集一次卵母细胞中层平面的图像。
6. 通过识别经历不对称胞质分裂的细胞，统计排出第一极体（PB）的卵母细胞数量。结果表现为一个小型细胞（PB）位于卵细胞旁，并处于共同的透明带内。使用图像分析软件（ImageJ，参见材料表）查看图像。
7. 将图像序列导入图像分析软件，逐帧推进，直至观察到一个或多个细胞完成不对称胞质分裂。计算排出极体的卵母细胞占总卵母细胞数的百分比¹⁷。

3. 监测减数成熟过程中Securin-gfp降解的模式

1. 离心3 µL的 Securin-Gfp cRNA（步骤 1.2）在 19,283 × g 条件下 4 °C 下孵育 30 分钟¹⁸.
   注意：使用上清液，以避免加载可能在显微注射过程中导致针头堵塞的杂质。
2. 参照文献中详细描述的步骤，逐步进行卵母细胞显微注射¹²将第1.2步制备的Securin-gfp cRNA以100 ng/µL的浓度显微注射入处于前期I停滞的卵母细胞中。
3. 显微注射后，将卵母细胞置于CO₂培养箱中孵育，使其恢复并进行RNA翻译₂ 孵育至少3小时。使用自动多通道荧光成像系统观察卵母细胞以检测表达情况（参见 材料表）以观察 GFP 信号。
4. 如步骤2.2所述，在96孔板的三个不同孔中，分别加入150 µL培养基（含或不含5 µM诺考达唑）以及150 µL含0.5 µM逆转素的培养基。
5. 将显微注射后的卵母细胞依次通过六滴不含米力农的培养液洗涤，并将1/3的卵母细胞转移至每种处理组中。
6. 将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中₂ 并在约洗去米力农后3小时，卵母细胞恢复减数分裂时，保持80%的湿度。
   注意：使用放大倍数为30x–64x的体视显微镜观察核膜破裂，作为减数分裂恢复的标志。
7. 使用配备培养箱室的荧光显微镜，按照步骤2.6所述方法记录卵母细胞成熟过程的图像。采用明场设置在孔中定位卵母细胞，使用488滤光片检测Securin-gfp信号，并调整荧光强度以避免细胞过曝。
   1. 如果成像系统是自动化的，请保存每个卵母细胞在孔板中的位置。由于Securin-gfp均匀分布于细胞质中，需在24小时内每隔20分钟拍摄一次卵母细胞的中位平面图像。若需在一张图像中捕获多个卵母细胞，可使用较低倍率的物镜（如10倍）。
8. 使用图像分析软件定量分析Securin-gfp的降解。打开GFP通道的图像，从时间点1开始。在首选的分析软件中，使用选择工具或形状工具标记每个卵母细胞，并为每个细胞生成一个感兴趣区域（ROI）。
   1. 使用相同的 ROI 选择一个背景区域，以供后续减除。测量每个 ROI 中 GFP 的像素强度。
9. 使用第3.8步中生成的每个卵母细胞的感兴趣区域（ROI），测量所有时间点的GFP荧光强度。
   注意：在某些软件程序中，一个 "分析" 选项卡用于选择测量功能。
   1. 然后，进入下一个时间点，重复此过程以测量每个时间点的GFP强度。最后，从每个GFP数值中减去在步骤3.8中选定的背景区域的ROI测量值。该分析将得到每个卵母细胞在每个时间点的Securin-gfp强度值。
10. 从Securin降解模式中提取不同参数：（a）Securin-GFP降解开始的时间，该时间点反映SAC沉默的起始时刻；（b）Securin-GFP信号达到最低值的时间，该时间点表明SAC沉默已降至阈值以下，足以激活APC/C并实现Securin-GFP的完全降解；（c）Securin-GFP降解的速率¹⁹这表明了SAC活性降至APC/C激活及Securin-GFP降解所需阈值水平以下的速度。

4. 减数分裂成熟过程中通过免疫荧光检测动粒对 MAD2 的招募

注意：卵母细胞的采集与成熟操作请参考先前发表的报告¹²。

1. 将卵母细胞分为三组。将每组卵母细胞转移至100 µL不含米力农的培养液滴中。用矿物油覆盖液滴，并将其置于培养箱中（37 °C、5% CO₂ 和80%湿度）分别培养3小时、5小时和7小时，以获得处于早前期I、晚前期I和中期I阶段的卵母细胞。
   注意：将每个时间点的样本分别置于不同的培养皿中，以避免多次从培养箱中取出同一培养皿，从而影响减数分裂成熟的正常进程。
2. 在指定的时间点，将卵母细胞转移至9孔玻璃培养皿中含500 µL 2%多聚甲醛（PFA）的1×PHEM缓冲液液滴中，在室温下固定20分钟，操作方法如前所述²⁰。随后，将细胞转移至一个洁净孔中，加入500 µL封闭液（PBS + 0.3% BSA + 0.01% Tween-20 + 0.02% NaN₃）中。
   注意：PHEM缓冲液成分：60 mM PIPES；25 mM HEPES；10 mM EGTA；2 mM MgCl₂。
   注意：可在此步骤暂停，将卵母细胞保存在9孔板的封闭液中，于4 °C下存放，直至合适时间再继续完成免疫荧光染色。
3. 为继续进行MAD2检测，将卵母细胞转移至含500 µL透化液（PBS + 0.3% BSA + 0.1% TritonX-100 + 0.02% NaN₃）的洁净孔中，在室温下孵育20分钟，然后将细胞转移至新的封闭液孔中，孵育10分钟。
4. 后续免疫荧光步骤使用带凹槽的96孔板盖，操作方法如前所述²⁰。使用加湿避光暗盒以避免光照和液体蒸发。将卵母细胞转移至含30 µL封闭液的液滴中，加入抗MAD2抗体（1:1000，兔源）和抗着丝粒抗体（ACA）（1:30，人源）（见材料表），在室温下孵育2小时。
   注意：96孔板盖可同时处理多种蛋白和多个样本组。
5. 为洗去未结合的一抗，将细胞转移至含30 µL补充0.5% Triton的1×PHEM缓冲液液滴中，在加湿暗盒中孵育10分钟。重复此步骤两次。
6. 进行第四次洗涤，将细胞转移至含30 µL不含0.5% Triton的1×PHEM缓冲液液滴中，孵育10分钟。
7. 将细胞转移至含30 µL封闭液的液滴中，加入二抗，如抗人IgG-633（1:200）和抗兔IgG-568（1:200）（见材料表），在室温下孵育1小时。
   注意：根据显微镜的激光器或滤光片选择合适的荧光染料组合。
8. 为洗去未结合的二抗，重复步骤4.5–4.6。
9. 为将细胞封片于显微镜载玻片上，将细胞转移至含10 µL含DAPI（0.1 mg/mL）的封片剂液滴中（见材料表）。在盖玻片四角各加少量凡士林小点，小心地将其覆盖在封片剂液滴上，缓慢按压使液体均匀分布。用透明指甲油将盖玻片密封固定于载玻片上。有关封片过程的更详细描述，请参见参考文献²⁰。
10. 使用配备40x或63x物镜的共聚焦显微镜对动粒成像（见材料表）。利用ACA信号确定可覆盖整个染色体区域的z轴扫描范围。
    注意：某些成像系统可采用4.0倍光学放大和0.5 µm的z轴步长。不同系统参数可能有所差异，需进行优化。
11. 使用图像分析软件分析动粒处MAD2的荧光强度。生成z轴最大投影图，然后拆分各通道。
12. 首先，使用ACA通道创建掩膜：选择ACA通道，设定阈值以识别所有动粒信号。进入编辑选项卡并创建选区，然后基于该选区生成ROI（感兴趣区域）。
13. 选择MAD2通道，并导入步骤4.12中创建的选区。选择最适合MAD2信号的阈值方法，并测量荧光强度。
    注意：应在对照处理组中确定阈值方法，并在分析不同处理组时保持一致。
14. 为计算相对像素强度，将每个细胞的强度值除以实验中野生型（WT）卵母细胞的平均强度值。

结果

通过诺考达唑处理评估纺锤体组装检查点（SAC）的响应性
本实验的目的是评估SAC的激活状态及其强度。通过使用诺考达唑破坏纺锤体微管，所有动粒将处于未附着状态，从而引发由SAC介导的细胞周期阻滞。在当前的成像系统中，经DMSO处理的对照组卵母细胞在从米力农释放后约14小时排出第一极体（图1，上图）。与SAC激活一致，经诺考达唑处理的卵母细胞阻滞在第一次减数分裂中期，且未排出极体（图1，中图）。为了证明该检测方法是SAC活性的可靠指标，我们使用MPS1抑制剂雷维斯尼（reversine）来阻止SAC的激活²¹。当SAC无法被激活时，卵母细胞即使缺乏动粒-微管（KT-MT）连接，仍会排出极体（图1，下图）。SAC功能减弱的卵母细胞则表现出混合表型——部分卵母细胞发生阻滞，而另一些则排出极体¹⁷。这种在有或无诺考达唑条件下培养小鼠卵...

讨论

纺锤体组装检查点是细胞分裂过程中一种关键的调控机制，旨在防止染色体分离错误。该机制使细胞有足够时间纠正动粒-微管（KT-MT）的异常连接。卵母细胞的减数分裂是一个易出错的过程，大多数染色体错误分离发生在减数分裂I期，导致非整倍体卵子的产生，而这是人类早期流产和不孕的主要原因^1,24。目前有多种假说正在被验证，以阐明为何雌性减数分裂容易出错。其中一个可能的原因是，与体细胞相比，纺锤体组装检查点（SAC）效率较低，允许在一个或多个动粒错误连接的情况下启动后期^9,10,25。因此，全面研究卵母细胞中SAC的作用机制并鉴定其关键调控因子，对于理解整倍体卵子形成过程至关重要。

本方案描述了三种用于评估纺锤体组装检查点（SAC）完整性的不同方面的技术：激活与沉默。由于每种检测方法在结果解读上均...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A4503
DAPI	Life Technologies	D1306
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma	D5879
驴抗兔-Alexa-568	Life Technologies	A10042
EVOS FL Auto 成像系统	Life Technologies		荧光显微镜
EVOS 载物台培养箱	Life Technologies		培养箱腔室
未包被玻璃底 96 孔板 N 1.5	MatTek Corporation	P96G-1.5-5-F
羊抗人-Alexa-633	Life Technologies	A21091
HEPES	Sigma	H3537
人源抗 ACA 抗体	Antibodies Incorporated	15-234	稀释比例 1/30
ImageJ	NIH
KCl	Sigma	P5405
KH2PO4	Sigma	P5655
配备 63×, 1.40 NA 油浸物镜的 Leica SP8 显微镜	Leica
MgSO4·7H20	Sigma	M7774
米力农	Sigma	M4659
Na2HPO4	Sigma	S2429
NaCl	Sigma	S5886
NaN3	Sigma	S2002
诺考达唑	Sigma	M1404
多聚甲醛（PFA）	Sigma	P6148
PIPES	Sigma	P6757
兔抗 MAD2 抗体	Biolegend	924601	稀释比例 1/1000；先前为 Covance #PRB-452C
Reversine	Cayman Chemical	10004412
Triton-X	Sigma	274348
Tween-20	Sigma	X100
Vectashield	Vector laboratories	H-1000