染色体分离错误是卵母细胞中的常见现象。因此，研究纺锤体组装检查点可为产生健康卵子所需的机制提供重要线索。本方案描述了三种互补的检测方法，用于评估小鼠卵母细胞中纺锤体组装检查点的完整性。
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摘要
摘要
非整倍体是导致人类早期流产和妊娠失败的主要遗传异常。大多数导致非整倍体的染色体分离错误发生在卵母细胞的减数分裂过程中，但目前尚不完全清楚为何卵母细胞的减数分裂容易出错。在细胞分裂过程中，细胞通过激活纺锤体组装检查点（SAC）来防止染色体分离错误。这一调控机制依赖于对动粒（KT）-微管（MT）连接的检测以及对纺锤体纤维所产生的张力的感知。当动粒未与微管连接时，SAC被激活，从而阻止细胞周期的进程。SAC首先由MPS1激酶激活，进而触发有丝分裂检查点复合物（MCC）的招募和形成，该复合物由MAD1、MAD2、BUB3和BUBR1组成。随后，MCC扩散至细胞质中并结合CDC20，即后期促进复合物/环体（APC/C）的激活因子。一旦动粒与微管连接且染色体排列在中期板上，SAC即被沉默，CDC20被释放，APC/C被激活，从而引发Cyclin B和Securin的降解，促使细胞进入后期。与体细胞相比，卵母细胞中的SAC功能较弱，因为即使存在未连接的动粒，细胞仍可进入后期。目前仍需进一步研究以明确SAC为何更具宽容性，以及这种宽容性是否是导致卵母细胞染色体分离错误的原因之一。本实验方案描述了三种用于全面评估小鼠卵母细胞SAC完整性的技术。这些技术包括使用诺考达唑（nocodazole）解聚微管以评估SAC反应，通过监测Securin降解的动力学来追踪SAC的沉默过程，以及通过免疫荧光检测MAD2在动粒上的招募情况。这些技术共同提供了对SAC完整性的全面评估，有助于深入理解产生健康卵子所需的关键机制。
引言
非整倍体由染色体分离错误引起，是早期流产的主要原因，并与减数分裂过程中的错误高度相关1。减数分裂不同于有丝分裂，因其包含两次细胞分裂，而其间无DNA复制步骤。在减数分裂I中，同源染色体分离，而姐妹染色单体仍保持在一起。在卵母细胞中，该步骤容易出错，导致产生非整倍体卵子2。
为防止染色体分离错误，大多数细胞类型会激活一种称为纺锤体组装检查点（spindle assembly checkpoint, SAC）的监控机制，以暂停细胞周期。该机制可感知动粒（kinetochore, KT）与微管（microtubule, MT）之间的连接状态，并在染色体以双极方式排列时感知由此产生的张力3。未连接微管的动粒会触发SAC反应，该反应始于SAC的主要调控因子MPS1被招募至动粒3,4。MPS1启动其他SAC组分的招募，作为平台形成有丝分裂检查点复合物（mitotic checkpoint complex, MCC）。MCC由MAD1、MAD2、BUB3和BUBR1组成，可扩散至细胞质中，通过结合并隔离APC/C的激活因子CDC20来抑制APC/C的活化。当所有动粒均稳定连接微管且染色体排列于中期板时，SAC被沉默，MCC解离并释放....
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方案
本研究中使用的所有小鼠均按照罗格斯大学机构动物使用与护理委员会（方案编号 201702497）以及美国国立卫生研究院的指导原则进行饲养和管理。所有涉及动物实验的操作程序均已获得上述监管机构的批准。本研究中使用的小鼠均为 6 至 8 周龄的 CF-1 雌性小鼠。
1. 实验准备
- 在开始SAC评估之前，按照先前发表的文献报道收集小鼠卵母细胞12将收集的卵母细胞均分为三组，置于含有2.5 µM milrinone的Chatot、Ziomek和Bavister（CZB）培养基中培养（参见 材料表以避免减数分裂恢复13.
注意：CZB 成分：81.6 mM NaCl；4.8 mM KCl；1.2 mM KH2PO4；1.2 mM MgSO₄4-7H2O；0.27 mM 丙酮酸钠；1.7 mM CaCl₂2；30.8 mM DL-乳酸；7 mM 牛磺酸；0.1 mM EDTA；25 mM NaHCO₃3；庆大霉素；以及0.3% BSA。 - 按照先前所述方法制备用于显微注射的cRNA12....
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结果
通过诺考达唑处理评估纺锤体组装检查点（SAC）的响应性
本实验的目的是评估SAC的激活状态及其强度。使用诺考达唑使纺锤体微管解聚，导致所有动粒均未与微管连接，从而引发由SAC介导的细胞周期阻滞。在当前的成像系统中，经DMSO处理的对照组卵母细胞在从米力农释放后约14小时排出第一极体（图1，上图）。与SAC激活一致，经诺考达唑处理的卵母细胞阻滞在第一次减数分裂中期，且未排出极体（图1，中图）。为了证明该检测方法是SAC活性的可靠指标，我们使用MPS1抑制剂雷维斯尼（reversine）来阻止SAC的激活21。当SAC无法被激活时，卵母细胞即使缺乏动粒-微管（KT-MT）连接，仍会排出极体（图1，下图）。SAC功能减弱的卵母细胞则表现出混合表型——部分卵母细胞发生阻滞，而另一些则排出极体17。该通过诺考达唑处理与否来成熟小鼠卵母.......
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讨论
纺锤体组装检查点是细胞分裂过程中一种关键的调控机制，旨在防止染色体分离错误。该机制使细胞有足够时间纠正动粒-微管（KT-MT）的异常连接。卵母细胞的减数分裂是一个易出错的过程，大多数染色体错误分离发生在减数分裂I期，导致非整倍体卵子的产生，而这是人类早期流产和不孕的主要原因1,24。目前有多种假说正在被验证，以阐明为何雌性减数分裂容易出错。其中一个可能的原因是，与体细胞相比，纺锤体组装检查点（SAC）效率较低，允许在一个或多个动粒错误连接的情况下启动后期9,10,25。因此，全面研究卵母细胞中SAC的作用机制并鉴定其关键调控因子，对于理解整倍体卵子形成过程至关重要。
本方案描述了三种用于评估纺锤体组装检查点（SAC）完整性的不同方面的技术：激活与沉默。由于每种检测方法在结果解读上均.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本项目由美国国立卫生研究院提供资助（R35GM136340，授予 KS）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | A4503 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma | D5879 | |
| 驴抗兔-Alexa-568 | Life Technologies | A10042 | |
| EVOS FL Auto 成像系统 | Life Technologies | 荧光显微镜 | |
| EVOS 载物台培养箱 | Life Technologies | 培养箱腔室 | |
| 未包被玻璃底 96 孔板 N 1.5 | MatTek Corporation | P96G-1.5-5-F | |
| 羊抗人-Alexa-633 | Life Technologies | A21091 | |
| HEPES | Sigma | H3537 | |
| 人源抗 ACA 抗体 | Antibodies Incorporated | 15-234 | 稀释比例 1/30 |
| ImageJ | NIH | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| 配备 63×, 1.40 NA 油浸物镜的 Leica SP8 显微镜 | Leica | ||
| MgSO4·7H20 | Sigma | M7774 | |
| 米力农 | Sigma | M4659 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S2429 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| 诺考达唑 | Sigma | M1404 | |
| 多聚甲醛（PFA） | Sigma | P6148 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| 兔抗 MAD2 抗体 | Biolegend | 924601 | 稀释比例 1/1000；先前为 Covance #PRB-452C |
| Reversine | Cayman Chemical | 10004412 | |
| Triton-X | Sigma | 274348 | |
| Tween-20 | Sigma | X100 | |
| Vectashield | Vector laboratories | H-1000 |
参考文献
- Gruhn, J. R., et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span. Science. 365 (6460), 1466-1469 (2019).
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-....
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重印与许可
