在2D结构中模拟人类小脑体 外 发育

摘要

本协议解释了从诱导多能干细胞生成2D单层小脑细胞，用于研究小脑发育的早期阶段。

摘要

小脑的精确和及时发育不仅对准确的运动协调和平衡至关重要，而且对认知也至关重要。此外，小脑发育的中断与许多神经发育障碍有关，包括自闭症、注意力缺陷多动障碍 （ADHD） 和精神分裂症。人类小脑发育的研究以前只能通过尸检或神经成像进行，但这些方法不足以了解早期 发育过程中体内 发生的分子和细胞变化，这是许多神经发育障碍的起源。从体细胞产生人类诱导多能干细胞（iPSC）的技术的出现以及进一步将iPSC重新分化为神经元的能力为早期大脑发育的 体外 建模铺平了道路。本研究为需要二维（2D）单层结构的应用提供了生成小脑细胞的简化步骤。代表早期发育阶段的小脑细胞通过以下步骤 来源 于人iPSC:首先，在三维（3D）培养中制造胚状体，然后用FGF2和胰岛素处理以促进小脑命运规范，最后，在聚l-鸟氨酸（PLO）/层粘连蛋白包被的底物上最终分化为单层。在分化 35 天时，iPSC 来源的小脑细胞培养物表达小脑标志物，包括 ATOH1、PTF1α、PAX6 和 KIRREL2，表明该方案产生谷氨酸能和 GABA 能小脑神经元前体，以及浦肯野细胞祖细胞。此外，分化的细胞显示出独特的神经元形态，并且对神经元身份的免疫荧光标志物（如TUBB3）呈阳性。这些细胞表达轴突引导分子，包括信号蛋白-4C、丛蛋白-B2和神经皮林-1，可以作为研究神经突生长和突触连接的分子机制的模型。该方法生成可用于下游应用的人类小脑神经元，包括需要 2D 单层格式的基因表达、生理和形态学研究。

引言

了解人类小脑发育和这一过程的关键时间窗口不仅对于解码神经发育障碍的可能原因很重要，而且对于确定治疗干预的新靶点也很重要。在体外模拟人类小脑发育一直具有挑战性，但随着时间的推移，^{已经出现了许多}区分人类胚胎干细胞（hESC）或具有小脑谱系命运的iPSCs的方案1，²，³，⁴，⁵，⁶，^7，8.此外，重要的是开发产生可重复结果的协议，相对简单（以减少错误），并且不承担沉重的货币成本。

小脑分化的第一个方案是从板状胚体（EB）的2D培养物中产生的，用类似于体内发育的各种生长因子诱导小脑命运，包括WNT，BMP和FGFs^1，9。最近发表的方案主要在用FGF2和胰岛素诱导3D类器官培养中诱导分化，然后是FGF19和SDF1用于菱形唇样结构³，^{4，或使用}FGF2^，FGF4和FGF8^{的组合5。}两种小脑类器官诱导方法都产生了相似的3D小脑类器官，因为两种方案都报告了在相同时间点相似的小脑标志物表达。Holmes和Heine扩展了他们的3D协议⁵，以表明2D小脑细胞可以从hESC和iPSCs产生，它们以3D聚集体的形式开始。此外，Silva等人⁷证明，代表2D成熟小脑神经元的细胞可以用与Holmes和Heine类似的方法生成，使用不同的时间点从3D切换到2D并延长生长和成熟时间。

目前的协议通过使用胰岛素和FGF2产生自由漂浮的拟胚体（EB），然后在第14天将EB接种在PLO /层粘连蛋白包被的培养皿上以进行2D生长和分化，从而诱导无饲养层iPSC中的小脑命运。到第35天，获得具有小脑身份的细胞。概括小脑发育早期阶段的能力，特别是在2D环境中，使研究人员能够回答需要单层结构实验的特定问题。该协议也适用于进一步的修改，例如微图案表面，轴突生长测定和细胞分选，以富集所需的细胞群。

方案

人类受试者研究获得了爱荷华大学机构审查委员会批准号201805995和爱荷华大学人类多能干细胞委员会批准号2017-02的批准。在获得书面知情同意后，从受试者那里获得皮肤活检。成纤维细胞在DMEM中用15%胎牛血清（FBS）和1%MEM-非必需氨基酸溶液在37 °C和5%CO₂下培养。按照制造商的方案（参见 材料表）使用用于电穿孔的核苷载体，使用游离体重编程试剂盒对成纤维细胞进行重编程。所有程序均在II类A2型生物安全柜（简称"罩"）中进行。所有细胞培养基均不含抗生素;因此，进入引擎盖的每个组件都用 70% 的乙醇清洁。所有细胞培养基和组分均经过无菌过滤或在罩中打开以保持其无菌性。

1. 实验准备

1. 准备基底膜基质（BMM）涂层板。
   注意:BMM在较高温度下凝固得更快。板必须快速制备并立即置于4°C下储存。
   1. 将BMM（见 材料表）在冰上解冻，在4°C下至少2小时，或过夜。
   2. 将 DMEM/F12 和 BMM 混合至终浓度为 80 μg/mL。将BMM溶液分布在组织培养皿中（1mL用于35mm，2mL用于60mm培养皿），并在37°C下孵育至少1小时或过夜，然后再铺板细胞。
      注意:未使用的培养皿可以在4°C下储存2周。
2. 制备聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白（PLO/层粘连蛋白）包被的板。
   1. 在无菌DPBS + / +中制备20μg/ mL PLO（参见 材料表），并向6孔板的每个孔中加入1 mL。在培养箱中于37°C孵育过夜。
   2. 第二天，用真空吸气器吸出PLO，并用DPBS + / +洗涤两次。在引擎盖中风干。
      注意:风干板可以在4°C下储存长达2周，用铝箔包裹，以备将来使用。
   3. 在DPBS + / +中制备10μg/ mL层粘连蛋白（参见 材料表），并向6孔板的每个孔中加入1 mL。在培养箱中孵育至少3小时或在37°C下过夜。
   4. 用真空吸引器吸出层粘连蛋白，并加入 1 mL 培养基或无菌 DPBS+/+。
      注意:层粘连蛋白涂层不得变干。应立即添加PBS或适当的培养基以防止这种情况发生。涂层板可在4°C下储存长达2周。
3. 准备 PSC 传代溶液。
   注意:需要渗透压计（见 材料表）来制备PSC传代溶液¹⁰。
   1. 将 11.49 g 氯化钾 （KCl） 和 0.147 g 柠檬酸钠二水合物 （HOC（COONa）（CH 2 COONa）₂*2H₂O） 溶解在 400 mL 无菌细胞培养级水中（参见材料表）。
   2. 测量溶液的体积并将其记录为初始体积（Vi）。
   3. 测量渗透压，并使用公式 Vi × Oi = Vf × 570 mOsm 加入无菌细胞培养级水，将其调节至 570 mOsm。
   4. 用 0.20 μm 过滤器对溶液进行过滤灭菌，制成 10 mL 等分试样。将等分试样在室温 （RT） 下储存长达 6 个月。
4. 准备多能干细胞（PSC）培养基。
   注意:iPSCs保存在含有热稳定FGF2的培养基中（参见 材料表），提供无周末的喂养时间表。尚未尝试用于此协议的其他市售 PSC 培养基。
   1. 将PSC培养基补充剂在4°C下解冻过夜。
   2. 将 10 mL PSC 培养基补充剂加入 500 mL 基础 PSC 培养基中。制作25 mL等分试样并储存在-20°C。
      注意:冷冻等分试样可以在-20°C下储存6个月。解冻的等分试样必须储存在4°C并在2周内使用。细胞可以冷冻，以便在含有10%（v / v）二甲基亚砜（DMSO）的PSC培养基中长期储存。
5. 准备PSC解冻培养基。
   1. 用 50 nM 色聚糖、1.5 μM Emricasan、1x 多胺补充剂和 0.7 μM 反式 ISRIB（CEPT 鸡尾酒¹¹）补充 PSC 培养基（参见 材料表）。
   2. 用0.20μm过滤器过滤灭菌，并在4°C下储存长达4周。
6. 准备拉动式玻璃移液器。
   1. 将 22.9 厘米（9 英寸）玻璃巴斯德移液器拉成两块，在本生燃烧器上方，颈部下方 ~2 厘米处，形成两个移液器，较薄的一面比另一侧短 ~4 厘米。
   2. 在火焰的帮助下，弯曲拉侧的尖端以形成光滑的"r"。
   3. 将拉动的移液器放入高压灭菌器套筒和高压灭菌器中进行灭菌。
7. 准备小脑分化培养基（CDM）。
   1. 以 1:1 的比例混合 IMDM 和 Ham's F12 营养混合物。用 1x L-丙氨酸-L-谷氨酰胺补充剂、1% （v/v） 化学确定的脂质浓缩物、0.45 mM 1-硫代甘油、15 μL/mL 载脂转铁蛋白、5 mg/mL 牛血清白蛋白 （BSA） 和 7 μg/mL 胰岛素补充混合物（参见 材料表）。
   2. 用0.20μm过滤器过滤灭菌，储存在4°C，并在1个月内使用。
8. 准备小脑成熟培养基（CMM）。
   1. 用1x L-丙氨酸-L-谷氨酰胺补充剂和1x N-2补充剂补充神经基础培养基（见 材料表）。
   2. 用0.20μm过滤器过滤灭菌，储存在4°C，并在2周内使用。

2. 无饲养层 iPSC 培养

1. 按照以下步骤解冻细胞。
   1. 将BMM板（步骤1.1）放入37°C培养箱中凝胶至少1小时或过夜，然后解冻细胞。
   2. 在37°C下预热10mL的PSC解冻培养基（步骤1.5）。
   3. 将带有细胞的冷冻管从液氮转移到37°C的水浴中。
      注意:为避免在细胞培养空间中产生污染源，不建议使用标准水浴。相反，淡水可以在一个小烧杯中加热到37°C，以产生一次性水浴。
   4. 当管中剩下一小块冰时，将其从水浴中取出，干燥管子，然后喷洒70%乙醇。将试管转移到罩上，并使用 2 mL 或 5 mL 血清移液管（参见 材料表）将细胞轻轻转移到 15 mL 锥形管中。
   5. 在旋转锥形管的同时，将 8 mL PSC 解冻培养基滴加到细胞中。在室温下以200× g 离心5分钟。
   6. 用真空吸液器小心地吸出上清液，而不会干扰细胞沉淀。将细胞重悬于 2 mL PSC 解冻培养基中。
   7. 从平板中吸出BMM，并将重悬的细胞滴加到整个平板上以均匀分布。
   8. 将板置于37°C，5%CO₂的培养箱中。第二天用 PSC 培养基刷新培养基。之后，每天更换培养基。
2. 按照以下步骤维护单元格。
   1. 在 37 °C 下预热必要体积的 PSC 培养基（例如，每 35 mm 板 1 mL 培养基）。
   2. 检查板中分化的细胞或集落，并用拉动的玻璃移液管去除分化的细胞（步骤1.6）。
      注意:iPSC菌落具有光滑的边缘，具有形态相同的细胞。
   3. 每天更换用过的培养基，每3-4天或达到70%汇合度时通过。
3. 传代细胞。
   1. 在传代前将必要量的BMM板放入培养箱中至少1小时或过夜。在37°C预热必要量的PSC培养基（步骤1.3）。
   2. 使用拉动的玻璃移液器，清除任何分化的细胞或菌落。
   3. 用真空吸液器吸出用过的培养基，并加入 PSC 解离培养基，每 35 mm 培养皿 1 mL。在37°C孵育1-3分钟。
      注意:如果在添加 PSC 培养基之前菌落在 PSC 传代溶液中脱落，则可以缩短孵育时间。
   4. 吸出 PSC 传代溶液并加入预热的 PSC 培养基。
   5. 使用无菌 200 μL 移液器吸头，在一个方向上相互平行的划痕线，将板旋转 90°，然后使第二组划痕线垂直于前一组划痕线（在板上形成交叉阴影图案）。
   6. 从固定板中吸出BMM溶液。使用血清移液管收集菌落并将其分配到新的BMM板中。
   7. 在37°C，5%CO₂下孵育。每天更换培养基。
4. 冷冻细胞。
   1. 通过标记内容物来制备冷冻管，并在罩内的紫外线 （UV）下灭菌30分钟。
   2. 通过补充 10% （v/v） DMSO 的 PSC 培养基来制备 PSC 冷冻培养基。按照步骤 2.3.2-2.3.5 操作。
   3. 用 5 mL 血清移液管将细胞转移到 15 mL 锥形管中，并在室温下以 200 x g 离心 5 分钟。
   4. 小心吸出培养基并将细胞沉淀重悬于PSC冷冻培养基中。
   5. 分布到冷冻管中。将小瓶放入冷冻容器中，并将容器放入-80°C冰箱中。
   6. 第二天，将冷冻管转移到液氮中长期储存。

3.小脑分化

注意:在开始分化之前，将iPSC传代到六个35 mm培养皿中，并在它们达到70%汇合时准备好进行分化。每个 35 mm 板将转移到 6 孔板的一个孔中。

1. 在第 0 天，提升健康的 iPSC 菌落以形成 EB。
   1. 向6孔超低附着（ULA）板的每个孔中加入1mL CDM（步骤1.7），补充有10μM Y-27632和10μM SB431542（参见 材料表），并置于培养箱中，直到提升的菌落准备好加入孔中。
   2. 使用拉动玻璃移液管清洁分化的细胞。吸出培养基，并为每个 35 mm 培养皿添加 1 mL PSC 传代溶液。在37°C下孵育3分钟，吸出，并加入2mL补充有10μM Y-27632和10μM SB431542的CDM。
      注意:如果在添加CDM之前菌落在PSC传代溶液中脱落，则可以缩短孵育时间。
   3. 在透射光倒置显微镜下，使用拉动玻璃移液管的弯曲边缘使用4倍放大镜轻轻提起菌落。提起每个菌落后，使用 10 mL 血清移液器轻轻地将所有菌落转移到 6 孔 ULA 板的一个孔中。对每个iPSC板重复此过程。将细胞在37°C与5%CO₂孵育。
      注意:如果菌落太大或合并，可以用拉动的玻璃移液管的尖端对其进行切片以创建较小的EB。
2. 在第 2 天，向每个孔中加入 FGF2，最终浓度为 50 ng/mL。
   注意:用于小脑分化的FGF2不是热稳定的。该协议尚未使用热稳定的FGF2进行测试。
3. 在第 7 天，进行 1/3 中等更换。对于孔中的 3 mL 总培养基，使用 1，000 μL 移液器轻轻吸出 1 mL 用过的培养基，并用 1 mL 新鲜 CDM 替换。孵育EB7天。
4. 在第 14 天，使用 1，000 μL 移液器轻轻吸出几乎所有用过的培养基。为确保对EB的损坏最小，请旋转板以将所有EB聚集在板的中心，然后倾斜板并从边缘缓慢吸出。
   1. 随着培养基量的减少，慢慢将板平放并继续吸出。留出足够的培养基以避免EB变干。然后，加入 3 mL 补充有 10 μM Y-27632 的新鲜 CDM。使用 10 mL 血清移液管将 EB 转移到 PLO/层粘连蛋白包被的培养皿中（步骤 1.2）。
      注意:根据下游应用，EB可以转移到6孔PLO/层粘连蛋白板上，或者单个EB可以转移到PLO/层粘连蛋白包被的24孔板或盖玻片的单孔中。
5. 在第15天，吸出培养基并用新鲜的CDM代替。
   注意:重要的是向孔中添加足够的培养基，以确保在进料之间有足够的培养基，因为随着时间的推移，会有蒸发（例如，对于 6 孔板中的孔，添加 3 mL 培养基）。如果培养基开始酸化（变成透明和黄色），即使培养基不在补料计划中，也要刷新培养基，直到方案结束。
6. 在第21天，吸出用过的培养基并用CMM代替。在第28天，用新鲜的CMM更换培养基。在第35天，收获细胞以进一步施用。

4. RNA分离的样品制备

1. 吸出培养基并向6孔板的每个孔中加入500μL细胞解离试剂（参见 材料表）。保持几秒钟并吸出。
2. 将板盖上，在室温下孵育2分钟。点击板的侧面以分离单元格。
3. 加入 1 mL CMM（步骤 1.8），并将细胞收集到 1.5 mL 管中。
4. 使用台式微型离心机（参见 材料表）在室温（最大速度2000 x g ）下离心30秒，沉淀细胞，弃去培养基，加入1 mL 1x PBS pH 7.4洗涤细胞沉淀。
5. 使用台式迷你离心机在室温下再次沉淀细胞30秒，然后再次用PBS洗涤。
6. 沉淀细胞并丢弃PBS。在含有苯酚和异硫氰酸胍试剂中裂解细胞（参见 材料表）。
   注意:在含有苯酚和异硫氰酸胍试剂中的裂解细胞可以在-80°C下储存长达1年。细胞可以直接在培养皿中裂解，具体取决于所使用的RNA分离方法和试剂。由于培养皿中的细胞数量较少，使用二氧化硅自旋柱分离RNA（参见 材料表）将产生更高的RNA产量。

5. 制备用于免疫荧光染色的细胞

注意:对于 24 孔板，每孔一个 EB 就足够了。

1. 在第 35 天，吸出用过的培养基并通过每孔添加 1 mL DPBS+/+ 来洗涤细胞（对于 24 孔板的一个孔）。
2. 吸出DPBS+/+，每孔加入500μL在DPBS+/+中制备的冷的4%多聚甲醛（PFA，参见 材料表）。在室温下孵育20分钟。
3. 去除4%PFA并用DPBS + / +洗涤细胞两次，如步骤5.1所示。加入1mL的DPBS + / +并将细胞储存在4°C直至染色完成。
   注意:建议在固定后1周内进行免疫荧光染色，以避免细胞脱离和抗原丢失。然而，根据抗体和靶标的细胞位置，染色可以在固定后 4 周内进行。

结果

3D 至 2D 小脑分化概述
小脑细胞从iPSC开始产生。 图 1A 显示了整个工作流程以及为差异化添加的主要组件。在第0天，使用含有SB431542和Y-27632的CDM中的拉式玻璃移液管轻轻提起iPSC菌落（图1B）并放入超低附着板中，从而制备EB。在第 2 天添加 FGF2。在第7天，改变三分之一的培养基，并观察到EB形成（图1C）。在第14天，将扩大的EB（图1D）接种在补充有Y-27632的CDM中的PLO /层粘连蛋白包被的培养皿上。在第15天，用不含Y-27632的CDM替换培养基。细胞开始沿着涂层表面从EB向外迁移（图1E）。在第21天，进行完整的培养基更换，并将培养基切换到CMM。之后，每周更换一次培养基（如果培养基快速酸化，则更频繁）。到第35天，有一层具有神经元样形态和复杂性的细...

讨论

在 体外模拟 人类小脑发育的能力对于疾病建模以及进一步了解正常大脑发育非常重要。不太复杂且具有成本效益的协议为可复制的数据生成和跨多个科学实验室的广泛实施创造了更多机会。这里使用Muguruma等人报告的生长因子使用不需要酶或解离剂的改进方法来描述小脑分化方案，该方法不需要酶或解离剂。^图4 和改进的2D单层细胞生长方案类似于Holmes等人的方法。⁵.

整个方案首先从iPSC产生EB，然后诱导小脑分化，最后进行2D单层培养的铺板。在此过程中，在第7-14天之间观察到大量的细胞死亡。由于这种细胞损失，建议从大量EB开始;对于 2D 细胞的 6 孔板，建议从至少 6 个板（35 mm 或 60 mm 板）的 iPSC 开始。此外，在将EB电镀到PLO/层粘连蛋白上时添加Y-27632显着增加了EB与基材的附着。间歇性地目视检查培养物中的培养基很重要。如果培养基变黄（酸化），即使不在进料方案中，也建议更换培养基。附着的细胞总数因实验而异，需...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 mL 血清移液	Fisher Scientific	13-678-26D
1-硫代甘油	Sigma	M6145
2 mL 血清移液	Fisher Scientific	13-678-26B
250 mL 过滤单元，0.2 &微量;m aPES，直径 50 mm，Fisher	Scientific	FB12566502
35 mm 易握组织培养皿	Falcon	353001
4D Nucleofector 核心单元	Lonza	276885	Nucleofector
5 mL 血清移液管	Fisher Scientific	13-678-25D
60 mm 易握组织培养皿	Falcon	353004
6 孔超低吸附板	康宁	3471
9 英寸一次性巴斯德移液器	Fisher Scientific	13-678-20D
载脂转铁蛋白	Sigma	T1147
牛血清白蛋白 （BSA）	Sigma	A9418
细胞培养级水	Cytiva	SH30529.02
化学成分明确的脂质浓缩物	Gibco	11905031
Chroman 1	Cayman	34681
II 类，A2 型，生物安全柜	NuAire， Inc.	NU-540-600	通风橱，紫外光
Costar 24 孔板，经 TC 处理	Corning	3526
Costar 6 孔板，经 TC 处理	Corning	3516
DAPI 溶液	Scientific	62248
DMEM	Gibco	11965092
DMEM/F12	Gibco	11320033
DMSO（二甲基亚砜）	Sigma	D2438
DPBS+/+	Gibco	14040133
Emricasan	Cayman	22204
Epi5 游离型 iPSC 重编程试剂盒	Life Technologies	A15960
Essential 8-Flex	Gibco	A2858501	PSC 培养基，含热稳定 FGF2
EVOS XL Core 成像系统Life	Technologies	AMEX1000
胎牛血清 - Premium Select	Atlanta Biologicals	S11150
FGF2	Peprotech	100-18B
GlutaMAX 添加剂	Gibco	35050061	L-丙氨酸-L-谷氨酰胺添加剂
Ham's F12 营养混合物	Gibco	11765054
HERAcell VIOS 160i CO2 培养箱	Thermo Scientific	50144906
人抗 EN2，小鼠	Santa Cruz Biotechnology	sc-293311
人抗 Ki67/MKI67，兔	R&D Systems	MAB7617
人抗 PTF1a、兔	Novus Biologicals	NBP2-98726
人抗 TUBB3、小鼠	Biolegend	801213
IMDM	Gibco	12440053
胰岛素	Gibco	12585
层粘连蛋白小鼠蛋白	Gibco	23017015
胶基质	康宁	354234	基底膜基质
MEM-NEAA	Gibco	11140050
微型离心机	Labnet International	C1310	台式微型离心
Monarch RNA 纯化试剂盒（50 &微量;g）	New England BioLabs	T2040	硅胶离心柱
Monarch 总 RNA 小量制备试剂盒	New England BioLabs	T2010	硅胶离心柱
N-2 补充剂	Gibco	17502-048
Neurobasal 培养基	Gibco	21103049
PBS，pH 7.4	Gibco	10010023
PFA 16%	电子显微镜科学	15710
多胺补充剂	Sigma	P8483
聚-L-鸟氨酸 （PLO）	Sigma	3655
氯化钾		Sigma 746436
SB431542	Sigma	54317
透视自密封袋	Steriking	SS-T2 （90x250）	高压灭菌袋
钠柠檬酸盐二水合物	Fisher Scientific	S279-500
针头式过滤器，无菌，PES 0.22 和微量;m，30 mm 直径 Research	Products International	256131
Trans-ISRIB	Cayman	16258
TRIzol 试剂	Invitrogen	15596018	苯酚和异硫氰酸胍
TrypLE Express 酶 （1x）	Gibco	12604039	细胞解离试剂
蒸气压渗透压计	Wescor， Inc.	型号 5520	渗透压计
Y-27632	Biogems	1293823