本方案介绍了从诱导性多能干细胞生成小脑细胞二维单层培养物的方法，用于研究小脑发育的早期阶段。
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摘要
摘要
小脑的精确且适时的发育不仅对准确的运动协调和平衡至关重要，而且对认知功能也具有重要作用。此外，小脑发育的异常已被认为与多种神经发育障碍相关，包括自闭症、注意力缺陷多动障碍（ADHD）和精神分裂症。以往对人类小脑发育的研究仅能通过尸检研究或神经影像学手段进行，然而这些方法在揭示发育过程中发生的分子与细胞水平变化方面存在局限性 体内 在早期发育阶段，许多神经发育障碍开始形成。人类诱导性多能干细胞（iPSCs）由体细胞生成技术的出现，以及将iPSCs进一步再分化为神经元的能力，为研究这些疾病奠定了基础 体外 早期脑发育的建模。本研究提供了生成适用于二维（2D）单层结构应用的小脑细胞的简化步骤。这些代表早期发育阶段的小脑细胞来源于人诱导多能干细胞（iPSCs） 通过 以下步骤：首先，在三维（3D）培养条件下形成类胚体，随后用 FGF2 和胰岛素处理以促进小脑命运的特化，最后在多聚-L-鸟氨酸（PLO）/层粘连蛋白包被的基质上以单层形式进行终末分化。在分化第35天，由iPSC衍生的小脑细胞培养物表达小脑标志物，包括 ATOH1、PTF1α、PAX6 和 KIRREL2，表明该方案可生成谷氨酸能和GABA能小脑神经元前体细胞以及浦肯野细胞前体细胞。此外，分化所得细胞呈现明显的神经元形态，并对神经元身份的免疫荧光标志物（如 TUBB3）呈阳性。这些细胞表达轴突导向分子，包括Sema4C、Plexin-B2 和 Neuropilin-1，可作为研究神经突起生长和突触连接分子机制的模型。该方法生成的人类小脑神经元适用于需要二维单层培养格式的下游应用，包括基因表达、生理学和形态学研究。
引言
理解人类小脑发育过程及其关键时间窗口，不仅对于揭示神经发育障碍的潜在病因至关重要，也有助于发现新的治疗干预靶点。人类小脑发育的建模 体外 一直具有挑战性，但随着时间推移，已涌现出多种将人类胚胎干细胞（hESCs）或诱导多能干细胞（iPSCs）分化为小脑谱系命运的实验方案1,2,3,4,5,6,7,8此外，建立能够产生可重复结果、相对简单（以减少误差）且不涉及高昂经济成本的实验方案非常重要。
最早的关于小脑分化的实验方案是通过将胚状体（EBs）接种于二维培养体系中，并利用多种生长因子诱导其向小脑命运分化而建立的，这些生长因子的作用方式类似于 体内 发育，包括 WNT、BMPs 和 FGFs1,9近期....
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方案
本研究已获得爱荷华大学机构审查委员会批准，批准编号为 201805995，以及爱荷华大学人类多能干细胞委员会批准，批准编号为 2017-02。在取得受试者书面知情同意后，采集其皮肤活检样本。成纤维细胞在 DMEM 培养基中培养，添加 15% 胎牛血清（FBS）和 1% MEM 非必需氨基酸溶液，培养条件为 37 °C、5% CO2。使用附加体质粒重编程试剂盒对成纤维细胞进行重编程，电穿孔转染采用核转染仪，操作步骤遵循制造商说明书（见材料表）。所有操作均在 II 级 A2 型生物安全柜（简称"hood"）中进行。所有细胞培养基均不含抗生素；因此，所有进入生物安全柜的物品均需用 70% 乙醇擦拭清洁。所有细胞培养基及组分均经过无菌过滤或在生物安全柜内开启，以维持无菌状态。
1. 实验准备
- 制备基底膜基质（BMM）包被的培养板。
注意：BMM在较高温度下凝固更快。必须快速制备培养板，并立即置于4 °C保存。- 将BMM（参见材料表）置于冰上或4 °C环境中解冻，至少2小时，或过夜。
- 将DMEM/F12与BMM混合，终浓度为80 µg/mL。将BMM溶液分装至组织培养皿中（35 mm培养皿加1 mL，60 mm培养皿加2 mL），在接种细胞前于37 °C孵育至少1小....
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结果
三维至二维小脑分化概述
小脑细胞从诱导性多能干细胞（iPSCs）开始生成。图1A展示了整体实验流程以及分化过程中主要成分的添加。在第0天，使用拉制的玻璃移液管在含有SB431542和Y-27632的CDM培养基中轻轻提起iPSC集落（图1B），形成拟胚体（EBs），并将其转移至超低吸附培养板中。在第2天加入FGF2。第7天更换三分之一培养基，并观察到拟胚体的形成（图1C）。第14天，将增大的拟胚体（图1D）接种到经PLO/层粘连蛋白包被的培养皿中，培养基为添加Y-27632的CDM。第15天，更换为不含Y-27632的CDM培养基。细胞开始从拟胚体向外迁移（图1E），沿包被表面扩展。第21天进行完全换液，并将培养基更换为CMM。此后每周更换一次培养基（若培养基酸化较快，可更频繁更换）。至第35天，可观.......
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讨论
模拟人类小脑发育的能力 体外 对于疾病建模以及深入理解正常脑发育具有重要意义。更简单且成本较低的实验方案有助于在多个科研实验室中生成可重复的数据，并促进广泛实施。本文描述了一种小脑分化方案，采用经改良的拟胚体（EBs）生成方法，无需使用酶或解离试剂，并结合Muguruma等报道的生长因子.4 以及一种改良的二维单层细胞培养方案，该方案类似于Holmes等人的方法.5.
整个实验方案首先从诱导多能干细胞（iPSCs）生成拟胚体（EBs），随后诱导小脑分化，最后进行二维单层培养的铺板。在此过程中，第7至14天之间可观察到大量细胞死亡。由于存在细胞损失，建议起始时使用较大量的拟胚体；对于一孔6孔板的二维培养细胞，建议至少从六块培养板（直径35 mm或60 mm）的iPSCs开始。此外，在将拟胚体接种至PLO/层粘连蛋白包被的培养皿时加入Y-27632，可显著提高拟胚体在基质上的贴附率。需定期肉眼检查培养体系中的培养基状态。若发现培养基变黄（.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢Jenny Gringer Richards在验证对照受试者方面所做的细致工作，对照诱导多能干细胞（iPSCs）即来源于这些受试者。本研究得到以下资助：NIH T32 MH019113（资助D.A.M.和K.A.K.）、Nellie Ball信托基金（资助T.H.W.和A.J.W.）、NIH R01 MH111578（资助V.A.M.和J.A.W.）、NIH KL2 TR002536（资助A.J.W.），以及Roy J. Carver慈善信托基金（资助V.A.M.、J.A.W.和A.J.W.）。 插图使用BioRender.com制作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 mL 血清移液管 | Fisher Scientific | 13-678-26D | |
| 1-硫代甘油 | Sigma | M6145 | |
| 2 mL 血清移液管 | Fisher Scientific | 13-678-26B | |
| 250 mL 滤器单元，0.2 µm aPES，50 mm 直径 | Fisher Scientific | FB12566502 | |
| 35 mm 易握式组织培养皿 | Falcon | 353001 | |
| 4D 核转染核心单元 | Lonza | 276885 | Nucleofector |
| 5 mL 血清移液管 | Fisher Scientific | 13-678-25D | |
| 60 mm 易握式组织培养皿 | Falcon | 353004 | |
| 6 孔超低吸附培养板 | Corning | 3471 | |
| 9" 一次性巴斯德吸管 | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| 脱铁转铁蛋白 | Sigma | T1147 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | A9418 | |
| 细胞培养级水 | Cytiva | SH30529.02 | |
| 化学成分明确的脂质浓缩液 | Gibco | 11905031 | |
| Chroman 1 | Cayman | 34681 | |
| II 级 A2 型生物安全柜 | NuAire, Inc. | NU-540-600 | 生物安全柜，带紫外灯 |
| Costar 24 孔板，TC 处理 | Corning | 3526 | |
| Costar 6 孔板，TC 处理 | Corning | 3516 | |
| DAPI 溶液 | Thermo Scientific | 62248 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO（二甲基亚砜） | Sigma | D2438 | |
| DPBS+/+ | Gibco | 14040133 | |
| Emricasan | Cayman | 22204 | |
| Epi5 附加体质粒 iPSC 重编程试剂盒 | Life Technologies | A15960 | |
| Essential 8-Flex | Gibco | A2858501 | 含热稳定 FGF2 的 PSC 培养基 |
| EVOS XL Core 成像系统 | Life Technologies | AMEX1000 | |
| 胎牛血清 - 优选级 | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| GlutaMAX 添加剂 | Gibco | 35050061 | L-丙氨酰-L-谷氨酰胺添加剂 |
| Ham's F12 营养混合物 | Gibco | 11765054 | |
| HERAcell VIOS 160i CO2 培养箱 | Thermo Scientific | 50144906 | |
| 人抗 EN2 抗体，小鼠来源 | Santa Cruz Biotechnology | sc-293311 | |
| 人抗 Ki67/MKI67 抗体，兔来源 | R&D Systems | MAB7617 | |
| 人抗 PTF1a 抗体，兔来源 | Novus Biologicals | NBP2-98726 | |
| 人抗 TUBB3 抗体，小鼠来源 | Biolegend | 801213 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| 胰岛素 | Gibco | 12585 | |
| 小鼠层粘连蛋白 | Gibco | 23017015 | |
| Matrigel 基质 | Corning | 354234 | 基底膜基质 |
| MEM-NEAA | Gibco | 11140050 | |
| 迷你离心机 | Labnet International | C1310 | 台式迷你离心机 |
| Monarch RNA 纯化试剂盒（50 µg） | New England BioLabs | T2040 | 硅胶柱离心纯化柱 |
| Monarch 总 RNA 小量提取试剂盒 | New England BioLabs | T2010 | 硅胶柱离心纯化柱 |
| N-2 添加剂 | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal 培养基 | Gibco | 21103049 | |
| PBS，pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| 16% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 多胺添加剂 | Sigma | P8483 | |
| 聚-L-鸟氨酸（PLO） | Sigma | 3655 | |
| 氯化钾 | Sigma | 746436 | |
| SB431542 | Sigma | 54317 | |
| 透明自封袋 | Steriking | SS-T2 (90x250) | 高压灭菌袋 |
| 柠檬酸二钠二水合物 | Fisher Scientific | S279-500 | |
| 注射器滤器，无菌，PES 0.22 µm，30 mm 直径 | Research Products International | 256131 | |
| Trans-ISRIB | Cayman | 16258 | |
| TRIzol 试剂 | Invitrogen | 15596018 | 苯酚和异硫氰酸胍 |
| TrypLE Express 酶（1x） | Gibco | 12604039 | 细胞解离试剂 |
| 蒸气压渗透压计 | Wescor, Inc. | Model 5520 | 渗透压计 |
| Y-27632 | Biogems | 1293823 |
参考文献
- Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1H.5 (2012).
- Erceg, S., et al.
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