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方法文章

模拟人类小脑发育 体外 在二维结构中

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DOI：

10.3791/64462

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2022年9月16日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Psychiatry, University of Iowa, 2Department of Radiology, University of Iowa, 3Carver College of Medicine, University of Iowa, 4Iowa Neuroscience Institute, University of Iowa, 5Pappajohn Biomedical Institute, University of Iowa

本文内容

摘要

本方案介绍了从诱导性多能干细胞生成小脑细胞二维单层培养物的方法，用于研究小脑发育的早期阶段。

摘要

小脑的精确且适时的发育不仅对准确的运动协调和平衡至关重要，而且对认知功能也具有重要作用。此外，小脑发育的异常已被认为与多种神经发育障碍相关，包括自闭症、注意力缺陷多动障碍（ADHD）和精神分裂症。以往对人类小脑发育的研究仅能通过尸检研究或神经影像学手段进行，然而这些方法在揭示发育过程中发生的分子与细胞水平变化方面存在局限性 体内 在早期发育阶段，许多神经发育障碍开始形成。人类诱导性多能干细胞（iPSCs）由体细胞生成技术的出现，以及将iPSCs进一步再分化为神经元的能力，为研究这些疾病奠定了基础 体外 早期脑发育的建模。本研究提供了生成适用于二维（2D）单层结构应用的小脑细胞的简化步骤。这些代表早期发育阶段的小脑细胞来源于人诱导多能干细胞（iPSCs） 通过 以下步骤：首先，在三维（3D）培养条件下形成类胚体，随后用 FGF2 和胰岛素处理以促进小脑命运的特化，最后在多聚-L-鸟氨酸（PLO）/层粘连蛋白包被的基质上以单层形式进行终末分化。在分化第35天，由iPSC衍生的小脑细胞培养物表达小脑标志物，包括 ATOH1、PTF1α、PAX6 和 KIRREL2，表明该方案可生成谷氨酸能和GABA能小脑神经元前体细胞以及浦肯野细胞前体细胞。此外，分化所得细胞呈现明显的神经元形态，并对神经元身份的免疫荧光标志物（如 TUBB3）呈阳性。这些细胞表达轴突导向分子，包括Sema4C、Plexin-B2 和 Neuropilin-1，可作为研究神经突起生长和突触连接分子机制的模型。该方法生成的人类小脑神经元适用于需要二维单层培养格式的下游应用，包括基因表达、生理学和形态学研究。

引言

理解人类小脑发育过程及其关键时间窗口，不仅对于揭示神经发育障碍的潜在病因至关重要，也有助于发现新的治疗干预靶点。人类小脑发育的建模 体外 一直具有挑战性，但随着时间推移，已涌现出多种将人类胚胎干细胞（hESCs）或诱导多能干细胞（iPSCs）分化为小脑谱系命运的实验方案1,2,3,4,5,6,7,8此外，建立能够产生可重复结果、相对简单（以减少误差）且不涉及高昂经济成本的实验方案非常重要。

最早的关于小脑分化的实验方案是通过将胚状体（EBs）接种于二维培养体系中，并利用多种生长因子诱导其向小脑命运分化而建立的，这些生长因子的作用方式类似于 体内 发育，包括 WNT、BMPs 和 FGFs1,9近期发表的方案主要在三维类器官培养中使用 FGF2 和胰岛素诱导分化，随后使用 FGF19 和 SDF1 生成菱脑唇样结构3,4，或使用了 FGF2、FGF4 和 FGF8 的组合5两种小脑类器官诱导方法均获得了相似的三维小脑类器官，因为两种方案在相同时间点均报告了相似的小脑标志物表达。Holmes 和 Heine 对其三维方案进行了扩展5 以证明可从最初形成3D聚集体的人胚胎干细胞（hESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）生成2D小脑细胞。此外，Silva等7 证明了采用与Holmes和Heine相似的方法，通过调整从3D转换至2D培养的时间点，并延长生长和成熟时间，可生成代表成熟小脑神经元的2D细胞。

本方案通过使用胰岛素和FGF2诱导无饲养层的诱导多能干细胞（iPSCs）形成悬浮培养的类胚体（EBs），并在第14天将EBs接种于PLO/层粘连蛋白包被的培养皿中进行二维生长与分化，从而诱导小脑命运。至第35天可获得具有小脑特征的细胞。该方法能够在二维环境中重现小脑发育的早期阶段，使研究人员能够针对需要单层结构进行实验的特定科学问题开展研究。此外，本方案易于进一步优化，例如结合微图案化表面、轴突发芽实验以及细胞分选技术，以富集目标细胞群体。

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方案

本研究已获得爱荷华大学机构审查委员会批准，批准编号为 201805995，以及爱荷华大学人类多能干细胞委员会批准，批准编号为 2017-02。在取得受试者书面知情同意后，采集其皮肤活检样本。成纤维细胞在 DMEM 培养基中培养，添加 15% 胎牛血清（FBS）和 1% MEM 非必需氨基酸溶液，培养条件为 37 °C、5% CO2。使用附加体质粒重编程试剂盒对成纤维细胞进行重编程，电穿孔转染采用核转染仪，操作步骤遵循制造商说明书（见材料表）。所有操作均在 II 级 A2 型生物安全柜（简称"hood"）中进行。所有细胞培养基均不含抗生素；因此，所有进入生物安全柜的物品均需用 70% 乙醇擦拭清洁。所有细胞培养基及组分均经过无菌过滤或在生物安全柜内开启，以维持无菌状态。

1. 实验准备

  1. 制备基底膜基质（BMM）包被的培养板。
    注意：BMM在较高温度下凝固更快。必须快速制备培养板，并立即置于4 °C保存。
    1. 将BMM（参见材料表）置于冰上或4 °C环境中解冻，至少2小时，或过夜。
    2. 将DMEM/F12与BMM混合，终浓度为80 µg/mL。将BMM溶液分装至组织培养皿中（35 mm培养皿加1 mL，60 mm培养皿加2 mL），在接种细胞前于37 °C孵育至少1小时或过夜。
      注意：未使用的培养皿可在4 °C保存2周。
  2. 制备多聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白（PLO/层粘连蛋白）包被的培养板。
    1. 用无菌DPBS+/+配制20 µg/mL的PLO（参见材料表），每孔加入1 mL至6孔板中。在培养箱中37 °C孵育过夜。
    2. 次日，用真空吸液器吸除PLO溶液，并用DPBS+/+洗涤两次。在生物安全柜中自然晾干。
      注意：晾干后的培养板可用铝箔包裹，在4 °C保存最多2周，以备后续使用。
    3. 用DPBS+/+配制10 µg/mL的层粘连蛋白（参见材料表），每孔加入1 mL至6孔板中。在培养箱中37 °C孵育至少3小时或过夜。
    4. 用真空吸液器吸除层粘连蛋白溶液，每孔加入1 mL培养基或无菌DPBS+/+。
      注意：层粘连蛋白包被表面不得干燥。应立即加入PBS或适当的培养基以防止干燥。包被后的培养板可在4 °C保存最多2周。
  3. 制备多能干细胞（PSC）传代溶液。
    注意：制备PSC传代溶液需要使用渗透压计（参见材料表）10。
    1. 将11.49 g氯化钾（KCl）和0.147 g二水合柠檬酸钠（HOC(COONa)(CH2COONa)2*2H2O）溶解于400 mL无菌细胞培养级水中（参见材料表）。
    2. 测量溶液总体积，并记录为初始体积（Vi）。
    3. 测定渗透压，并根据公式 Vi × Oi = Vf × 570 mOsm，通过添加无菌细胞培养级水将渗透压调整至570 mOsm。
    4. 使用0.20 µm滤器过滤除菌，分装为10 mL等份。室温（RT）保存，最长可达6个月。
  4. 制备多能干细胞（PSC）培养基。
    注意：iPSC在含有耐热型FGF2的培养基中维持培养（参见材料表），可实现无需周末换液的培养方案。本实验方案未尝试其他市售PSC培养基。
    1. 将PSC培养基添加剂在4 °C过夜解冻。
    2. 将10 mL PSC培养基添加剂加入500 mL基础PSC培养基中。分装为25 mL等份，于−20 °C保存。
      注意：冷冻等份可在−20 °C保存6个月。解冻后的等份应保存于4 °C，并在2周内使用完毕。细胞可使用含10%（v/v）二甲基亚砜（DMSO）的PSC培养基进行冷冻，用于长期保存。
  5. 制备PSC复苏培养基。
    1. 在PSC培养基中添加50 nM chroman、1.5 µM emricasan、1x 多胺添加剂和0.7 µM trans-ISRIB（CEPT鸡尾酒11）（参见材料表）。
    2. 使用0.20 µm滤器过滤除菌，4 °C保存，最长可保存4周。
  6. 制备拉制玻璃移液管。
    1. 在本生灯上方将22.9 cm（9英寸）长的玻璃巴斯德移液管拉成两段，断裂位置约在颈部下方2 cm处，形成两根移液管，其中较细的一段比另一段短约4 cm。
    2. 借助火焰将拉细端的尖端弯曲，形成平滑的"r"形。
    3. 将拉制好的移液管放入高压灭菌袋中，进行高压灭菌以实现灭菌。
  7. 制备小脑分化培养基（CDM）。
    1. 将IMDM与Ham's F12营养混合物按1:1比例混合。向混合液中添加1x L-丙氨酰-L-谷氨酰胺添加剂、1%（v/v）化学成分明确的脂质浓缩液、0.45 mM 巯基甘油、15 µL/mL 去铁转铁蛋白、5 mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）和7 µg/mL 胰岛素（参见材料表）。
    2. 使用0.20 µm滤器过滤除菌，4 °C保存，并在1个月内使用完毕。
  8. 制备小脑成熟培养基（CMM）。
    1. 在Neurobasal培养基中添加1x L-丙氨酰-L-谷氨酰胺添加剂和1x N-2添加剂（参见材料表）。
    2. 使用0.20 µm滤器过滤除菌，4 °C保存，并在2周内使用完毕。

2. 无饲养层iPSC培养

  1. 按照以下步骤解冻细胞。
    1. 将BMM培养板（步骤1.1）放入37 °C培养箱中，使其凝固至少1小时或过夜，然后再解冻细胞。
    2. 在37 °C下预热10 mL PSC解冻培养基（步骤1.5）。
    3. 将装有细胞的冻存管从液氮中转移至37 °C水浴中。
      注意：为避免在细胞培养环境中产生污染源，不建议使用标准水浴锅。可将新鲜水在小烧杯中加热至37 °C，制成一次性使用的水浴。
    4. 当冻存管中仅剩一小块冰时，将其从水浴中取出，擦干管体，并喷洒70%乙醇。将冻存管转移至超净台，使用2 mL或5 mL血清移液管（见材料表），轻柔地将细胞转移至15 mL锥形离心管中。
    5. 在轻轻旋转锥形管的同时，逐滴加入8 mL PSC解冻培养基。在室温下以200 × g离心5分钟。
    6. 使用真空抽吸装置小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。将细胞重悬于2 mL PSC解冻培养基中。
    7. 吸除培养板中的BMM，将重悬的细胞逐滴均匀地加入培养板中。
    8. 将培养板置于37 °C、5% CO2的培养箱中。次日更换为PSC培养基，之后每日更换培养基。
  2. 按照以下步骤维持细胞培养。
    1. 在37 °C下预热所需体积的PSC培养基（例如，每35 mm培养板使用1 mL培养基）。
    2. 观察培养板中是否存在分化细胞或克隆，并使用拉制玻璃移液管（步骤1.6）去除分化细胞。
      注意：iPSC克隆具有光滑的边缘，细胞形态一致。
    3. 每日更换耗尽的培养基，每3-4天传代一次，或在细胞融合度达到70%时进行传代。
  3. 传代细胞。
    1. 在传代前至少1小时或过夜，将所需数量的BMM培养板放入培养箱中。在37 °C下预热所需量的PSC培养基（步骤1.3）。
    2. 使用拉制玻璃移液管清除任何分化细胞或克隆。
    3. 使用真空抽吸装置吸除耗尽的培养基，每35 mm培养皿加入1 mL PSC解离培养基。在37 °C孵育1-3分钟。
      注意：如果在加入PSC培养基前，克隆已在PSC传代溶液中脱落，可缩短孵育时间。
    4. 吸除PSC传代溶液，加入预热的PSC培养基。
    5. 使用无菌200 µL移液器吸头，在一个方向上平行划线，然后将培养板旋转90°，再划一组与之前垂直的划线（在培养板上形成交叉网格图案）。
    6. 从设定好的培养板中吸除BMM溶液。使用血清移液管收集克隆，并将其分配至新的BMM培养板中。
    7. 在37 °C、5% CO2条件下孵育。每日更换培养基。
  4. 冻存细胞。
    1. 通过标记内容准备冻存管，并在超净台中用紫外光（UV）灭菌30分钟（见材料表）。
    2. 通过向PSC培养基中添加10%（v/v）DMSO制备PSC冻存培养基。参照步骤2.3.2-2.3.5操作。
    3. 使用5 mL血清移液管将细胞转移至15 mL锥形离心管中，在室温下以200 × g离心5分钟。
    4. 小心吸除培养基，将细胞沉淀重悬于PSC冻存培养基中。
    5. 分装至冻存管中。将冻存管放入冻存盒，并置于−80 °C冰箱中。
    6. 次日，将冻存管转移至液氮中进行长期保存。

3. 小脑分化

注意：开始分化前，将诱导多能干细胞传代至六个35 mm培养皿中，当细胞融合度达到70%时即可进行分化。每个35 mm培养皿将转移至6孔板中的一个孔。

  1. 第0天，将健康的iPSC集落转移至悬浮培养以形成拟胚体（EB）。
    1. 向6孔超低吸附（ULA）培养板的每孔中加入1 mL CDM（见步骤1.7），并添加10 µM Y-27632和10 µM SB431542（参见材料表），放入培养箱中预温，待转移的集落准备好后立即加入各孔。
    2. 使用拉制的玻璃移液管清除已分化的细胞。吸除培养基后，每35 mm培养皿加入1 mL PSC传代溶液。在37 °C孵育3分钟，随后吸除溶液，并加入2 mL添加了10 µM Y-27632和10 µM SB431542的CDM。
      注意：若在加入CDM前集落已在PSC传代溶液中脱落，可适当缩短孵育时间。
    3. 在透射光倒置显微镜下，使用4倍物镜，以拉制玻璃移液管的弯曲边缘轻柔地将集落剥离。待所有集落均被剥离后，使用10 mL血清移液管将其全部轻柔转移至6孔ULA板的一个孔中。对每个iPSC培养皿重复此操作。将细胞置于37 °C、5% CO2条件下培养。
      注意：若集落过大或相互融合，可用拉制玻璃移液管的尖端将其切分为更小的片段，以形成较小的拟胚体（EB）。
  2. 第2天，向每孔中加入FGF2，使其终浓度为50 ng/mL。
    注意：用于小脑分化的FGF2不耐热。本方案未使用耐热型FGF2进行验证。
  3. 第7天，更换1/3体积的培养基。每孔总培养体积为3 mL时，使用1,000 µL移液器轻柔吸除1 mL用过的培养基，并补充1 mL新鲜CDM。继续将拟胚体（EB）培养7天。
  4. 第14天，使用1,000 µL移液器轻柔吸除绝大部分用过的培养基。为尽量减少对拟胚体的损伤，轻轻晃动培养板使所有拟胚体聚集于板中央，然后倾斜培养板，从边缘缓慢吸除液体。
    1. 随着液体量减少，缓慢将培养板放平并继续吸除，保留足够液体以避免拟胚体干燥。随后，加入3 mL添加了10 µM Y-27632的新鲜CDM。使用10 mL血清移液管将拟胚体转移至PLO/层粘连蛋白包被的培养皿中（见步骤1.2）。
      注意：根据后续实验需求，可将拟胚体转移至6孔PLO/层粘连蛋白包被板，或单个拟胚体转移至PLO/层粘连蛋白包被的24孔板的单个孔或盖玻片上。
  5. 第15天，吸除培养基并更换为新鲜CDM。
    注意：必须向各孔中加入足量培养基，以确保两次换液之间有足够的液体量，因为培养过程中会发生蒸发（例如，6孔板每孔应加入3 mL培养基）。若培养基已开始酸化（变为透明发黄），即使未到预定换液时间，也应立即更换，直至实验结束。
  6. 第21天，吸除用过的培养基并更换为CMM。第28天，更换为新鲜CMM。第35天，收获细胞用于后续实验。

4. RNA 提取的样品制备

  1. 吸去培养基，向6孔板的每个孔中加入500 µL细胞解离试剂（见材料表）。静置数秒后吸去。
  2. 将培养板盖上盖子，在室温下孵育2分钟。轻敲培养板边缘以使细胞脱落。
  3. 加入1 mL CMM（步骤1.8），并将细胞收集至1.5 mL离心管中。
  4. 使用台式小型离心机（见材料表）在室温下以最高速度（最大2000 × g）离心30秒，沉淀细胞，弃去上清液，并加入1 mL 1× PBS（pH 7.4）洗涤细胞沉淀。
  5. 再次使用台式小型离心机在室温下离心30秒，沉淀细胞，并用PBS再洗涤一次。
  6. 沉淀细胞后弃去PBS，用含苯酚和异硫氰酸胍的裂解试剂（见材料表）裂解细胞。
    ​注意：在含苯酚和异硫氰酸胍 的试剂中裂解的细胞 可在−80 °C下保存长达1年。根据所用RNA提取方法和试剂的不同，细胞也可直接在培养皿中裂解。由于培养皿中细胞数量较少，使用硅胶膜离心柱（见材料表）进行RNA提取可获得更高的RNA得率。

5. 免疫荧光染色前的细胞准备

注意：对于24孔板，每孔一个EB即可。

  1. 第35天，吸除废弃培养基，并向每孔加入1 mL含钙镁的DPBS（DPBS+/+）洗涤细胞（适用于24孔板的一个孔）。
  2. 吸除DPBS+/+，每孔加入500 µL用DPBS+/+配制的预冷4%多聚甲醛（PFA，参见材料表），室温孵育20分钟。
  3. 去除4% PFA，按照步骤5.1的方法用DPBS+/+洗涤细胞两次。每孔加入1 mL DPBS+/+，将细胞置于4 °C保存，直至进行染色。
    注意：建议在固定后1周内完成免疫荧光染色，以避免细胞脱落和抗原丢失。然而，根据抗体种类及靶标蛋白的细胞定位，固定后最长可在4周内进行染色。

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结果

三维至二维小脑分化概述
小脑细胞从诱导性多能干细胞（iPSCs）开始生成。图1A展示了整体实验流程以及分化过程中主要成分的添加。在第0天，使用拉制的玻璃移液管在含有SB431542和Y-27632的CDM培养基中轻轻提起iPSC集落（图1B），形成拟胚体（EBs），并将其转移至超低吸附培养板中。在第2天加入FGF2。第7天更换三分之一培养基，并观察到拟胚体的形成（图1C）。第14天，将增大的拟胚体（图1D）接种到经PLO/层粘连蛋白包被的培养皿中，培养基为添加Y-27632的CDM。第15天，更换为不含Y-27632的CDM培养基。细胞开始从拟胚体向外迁移（图1E），沿包被表面扩展。第21天进行完全换液，并将培养基更换为CMM。此后每周更换一次培养基（若培养基酸化较快，可更频繁更换）。至第35天，可观...

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讨论

模拟人类小脑发育的能力 体外 对于疾病建模以及深入理解正常脑发育具有重要意义。更简单且成本较低的实验方案有助于在多个科研实验室中生成可重复的数据，并促进广泛实施。本文描述了一种小脑分化方案，采用经改良的拟胚体（EBs）生成方法，无需使用酶或解离试剂，并结合Muguruma等报道的生长因子.4 以及一种改良的二维单层细胞培养方案，该方案类似于Holmes等人的方法.5.

整个实验方案首先从诱导多能干细胞（iPSCs）生成拟胚体（EBs），随后诱导小脑分化，最后进行二维单层培养的铺板。在此过程中，第7至14天之间可观察到大量细胞死亡。由于存在细胞损失，建议起始时使用较大量的拟胚体；对于一孔6孔板的二维培养细胞，建议至少从六块培养板（直径35 mm或60 mm）的iPSCs开始。此外，在将拟胚体接种至PLO/层粘连蛋白包被的培养皿时加入Y-27632，可显著提高拟胚体在基质上的贴附率。需定期肉眼检查培养体系中的培养基状态。若发现培养基变黄（...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢Jenny Gringer Richards在验证对照受试者方面所做的细致工作，对照诱导多能干细胞（iPSCs）即来源于这些受试者。本研究得到以下资助：NIH T32 MH019113（资助D.A.M.和K.A.K.）、Nellie Ball信托基金（资助T.H.W.和A.J.W.）、NIH R01 MH111578（资助V.A.M.和J.A.W.）、NIH KL2 TR002536（资助A.J.W.），以及Roy J. Carver慈善信托基金（资助V.A.M.、J.A.W.和A.J.W.）。 插图使用BioRender.com制作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 mL 血清移液管Fisher Scientific13-678-26D
1-硫代甘油SigmaM6145
2 mL 血清移液管Fisher Scientific13-678-26B
250 mL 滤器单元，0.2 µm aPES，50 mm 直径Fisher ScientificFB12566502
35 mm 易握式组织培养皿Falcon353001
4D 核转染核心单元Lonza276885Nucleofector
5 mL 血清移液管Fisher Scientific13-678-25D
60 mm 易握式组织培养皿Falcon353004
6 孔超低吸附培养板Corning3471
9" 一次性巴斯德吸管Fisher Scientific13-678-20D
脱铁转铁蛋白SigmaT1147
牛血清白蛋白（BSA）SigmaA9418
细胞培养级水CytivaSH30529.02
化学成分明确的脂质浓缩液Gibco11905031
Chroman 1Cayman34681
II 级 A2 型生物安全柜NuAire, Inc.NU-540-600生物安全柜，带紫外灯
Costar 24 孔板，TC 处理Corning3526
Costar 6 孔板，TC 处理Corning3516
DAPI 溶液Thermo Scientific62248
DMEMGibco11965092
DMEM/F12Gibco11320033
DMSO（二甲基亚砜）SigmaD2438
DPBS+/+Gibco14040133
EmricasanCayman22204
Epi5 附加体质粒 iPSC 重编程试剂盒Life TechnologiesA15960
Essential 8-FlexGibcoA2858501含热稳定 FGF2 的 PSC 培养基
EVOS XL Core 成像系统Life TechnologiesAMEX1000
胎牛血清 - 优选级Atlanta BiologicalsS11150
FGF2Peprotech100-18B
GlutaMAX 添加剂Gibco35050061L-丙氨酰-L-谷氨酰胺添加剂
Ham's F12 营养混合物Gibco11765054
HERAcell VIOS 160i CO2 培养箱Thermo Scientific50144906
人抗 EN2 抗体，小鼠来源Santa Cruz Biotechnologysc-293311
人抗 Ki67/MKI67 抗体，兔来源R&D SystemsMAB7617
人抗 PTF1a 抗体，兔来源Novus BiologicalsNBP2-98726
人抗 TUBB3 抗体，小鼠来源Biolegend801213
IMDMGibco12440053
胰岛素Gibco12585
小鼠层粘连蛋白Gibco23017015
Matrigel 基质Corning354234基底膜基质
MEM-NEAAGibco11140050
迷你离心机Labnet InternationalC1310台式迷你离心机
Monarch RNA 纯化试剂盒（50 µg）New England BioLabsT2040硅胶柱离心纯化柱
Monarch 总 RNA 小量提取试剂盒New England BioLabsT2010硅胶柱离心纯化柱
N-2 添加剂Gibco17502-048
Neurobasal 培养基Gibco21103049
PBS，pH 7.4Gibco10010023
16% PFAElectron Microscopy Sciences15710
多胺添加剂SigmaP8483
聚-L-鸟氨酸（PLO）Sigma3655
氯化钾Sigma746436
SB431542Sigma54317
透明自封袋SterikingSS-T2 (90x250)高压灭菌袋
柠檬酸二钠二水合物 Fisher ScientificS279-500
注射器滤器，无菌，PES 0.22 µm，30 mm 直径Research Products International256131
Trans-ISRIBCayman16258
TRIzol 试剂Invitrogen15596018苯酚和异硫氰酸胍
TrypLE Express 酶（1x）Gibco12604039细胞解离试剂 
蒸气压渗透压计Wescor, Inc.Model 5520渗透压计
Y-27632Biogems1293823

参考文献

  1. Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1H.5 (2012).
  2. Erceg, S., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells. Stem Cells and Development. 19 (11), 1745-1756 (2010).
  3. Muguruma, K. 3D culture for self-formation of the cerebellum from human pluripotent stem cells through induction of the isthmic organizer. Methods in Molecular Biology. 1597, 31-41 (2017).
  4. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
  5. Holmes, D. B., Heine, V. M. Streamlined 3D cerebellar differentiation protocol with optional 2D modification. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56888(2017).
  6. Holmes, D. B., Heine, V. M. Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium. Biology Open. 6 (3), 402-406 (2017).
  7. Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 70(2020).
  8. Nayler, S., Agarwal, D., Curion, F., Bowden, R., Becker, E. B. E. High-resolution transcriptional landscape of xeno-free human induced pluripotent stem cell-derived cerebellar organoids. Scientific Reports. 11, 12959(2021).
  9. Salero, E., Hatten, M. E. Differentiation of ES cells into cerebellar neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2997-3002 (2007).
  10. Nie, Y., Walsh, P., Clarke, D. L., Rowley, J. A., Fellner, T. Scalable passaging of adherent human pluripotent stem cells. PLoS One. 9 (1), 88012(2014).
  11. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48 (1), 17-24 (2005).
  13. Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48 (1), 31-43 (2005).
  14. Hoshino, M., et al. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47 (2), 201-213 (2005).
  15. Mizuhara, E., et al. Purkinje cells originate from cerebellar ventricular zone progenitors positive for Neph3 and E-cadherin. Developmental Biology. 338 (2), 202-214 (2010).
  16. Ferreira, A., Caceres, A. Expression of the Class III β-tubulin isotype in developing neurons in culture. Journal of Neuroscience Research. 32 (4), 516-529 (1992).
  17. Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. Identification of conserved isotype-defining variable region sequences for four vertebrate beta tubulin polypeptide classes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (12), 4327-4331 (1986).
  18. Joyner, A. L. Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain-hindbrain development. Trends in Genetics. 12 (1), 15-20 (1996).
  19. Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer. Current Opinion in Cell Biology. 12 (6), 736-741 (2000).
  20. Minaki, Y., Nakatani, T., Mizuhara, E., Inoue, T., Ono, Y. Identification of a novel transcriptional corepressor, Corl2, as a cerebellar Purkinje cell-selective marker. Gene Expression Patterns. 8 (6), 418-423 (2008).
  21. Aldinger, K. A., et al. Spatial and cell type transcriptional landscape of human cerebellar development. Nature Neuroscience. 24 (8), 1163-1175 (2021).
  22. Fossat, N., Courtois, V., Chatelain, G., Brun, G., Lamonerie, T. Alternative usage of Otx2 promoters during mouse development. Developmental Dynamics. 233 (1), 154-160 (2005).
  23. Akbarian, S., et al. The PsychENCODE project. Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).
  24. Aijaz, S., et al. Expression analysis of SIX3 and SIX6 in human tissues reveals differences in expression and a novel correlation between the expression of SIX3 and the genes encoding isocitrate dehyhrogenase and cadherin 18. Genomics. 86 (1), 86-99 (2005).
  25. Conte, I., Morcillo, J., Bovolenta, P. Comparative analysis of Six3 and Six6 distribution in the developing and adult mouse brain. Developmental Dynamics. 234 (3), 718-725 (2005).
  26. Andreasen, N. C., Pierson, R. The role of the cerebellum in schizophrenia. Biological Psychiatry. 64 (2), 81-88 (2008).
  27. Nopoulos, P. C., Ceilley, J. W., Gailis, E. A., Andreasen, N. C. An MRI study of cerebellar vermis morphology in patients with schizophrenia: Evidence in support of the cognitive dysmetria concept. Biological Psychiatry. 46 (5), 703-711 (1999).
  28. Jacobsen, L. K., et al. Quantitative morphology of the cerebellum and fourth ventricle in childhood-onset schizophrenia. American Journal of Psychiatry. 154 (12), 1663-1669 (1997).
  29. Saywell, V., Cioni, J. -M., Ango, F. Developmental gene expression profile of axon guidance cues in Purkinje cells during cerebellar circuit formation. The Cerebellum. 13 (3), 307-317 (2014).
  30. Kim, D., Ackerman, S. L. The UNC5C netrin receptor regulates dorsal guidance of mouse hindbrain axons. Journal of Neuroscience. 31 (6), 2167-2179 (2011).
  31. Maier, V., et al. Semaphorin 4C and 4G are ligands of Plexin-B2 required in cerebellar development. Molecular and Cellular Neuroscience. 46 (2), 419-431 (2011).
  32. Telley, L., et al. Dual function of NRP1 in axon guidance and subcellular target recognition in cerebellum. Neuron. 91 (6), 1276-1291 (2016).
  33. Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Scientific Reports. 5, 9232(2015).
  34. Shabanipour, S., et al. Primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (152), e60168(2019).

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