红外热成像技术用于检测棕色脂肪组织活性变化

摘要

本文介绍了一种用于测量人类和实验动物餐后棕色脂肪组织活性的实验方案。

摘要

通过正电子发射断层扫描计算机断层成像（PET-CT）测量棕色脂肪组织（BAT）活性 通过 积累的 ¹⁸餐后或在肥胖及糖尿病患者中，氟脱氧葡萄糖（FDG）显像作为首选方法常会失败。其主要原因是 ¹⁸F-FDG 与餐后升高的血糖浓度竞争 BAT 细胞膜上的同一葡萄糖转运体。此外，BAT 也利用脂肪酸作为能量来源，而这一点在 PET-CT 中无法显示，并且可能随着肥胖和糖尿病患者体内葡萄糖浓度的变化而改变。因此，为评估 BAT 在动物和人类中的生理重要性，近期研究文献中采用了一种新的红外热成像方法。

在过夜禁食后，通过红外热成像技术测量人类志愿者和 雌性野生型小鼠进食前后棕色脂肪组织（BAT）的活性。相机软件利用与物体的距离、皮肤发射率、环境反射温度、空气温度和相对湿度来计算物体温度。在小鼠中，将棕色脂肪组织上方剃毛区域作为感兴趣区域，测量其平均温度和最高温度。雌性小鼠动情周期的阶段通过实验后采集阴道涂片并用焦油紫（0.1%）染色液染色确定。在健康志愿者中，选择颈部两个皮肤区域：锁骨上区（锁骨上方，存在BAT细胞）和锁骨间区（双侧锁骨之间，无BAT组织分布）。BAT活性通过这两个区域温度值的差值确定。此外，可在动物和人类受试者中测定皮肤区域的平均温度和最高温度。

通过红外热成像技术（一种非侵入性且更敏感的方法）测量餐后棕色脂肪组织（BAT）活性的变化，已在实验动物中显示出与性别、年龄及动情周期阶段的依赖性。作为饮食诱导性产热的一部分，人类BAT的激活也被证实与性别、年龄及体重指数相关。进一步明确餐后BAT活性的病理生理变化，对于血糖浓度较高的受试者（如肥胖和2型糖尿病患者）以及不同类型的实验动物（如基因敲除小鼠）具有重要意义。该方法还可作为评估潜在激活药物能否恢复BAT活性的有效工具。

引言

棕色脂肪组织（BAT）与白色脂肪组织（WAT）不同，其并不储存能量，而是消耗能量。在交感神经刺激下，BAT利用脂肪酸和葡萄糖，通过激活解偶联蛋白1（UCP1）产生热量。UCP1的功能是利用线粒体内膜两侧的H⁺梯度产生热量，而非生成ATP。BAT的功能是在寒冷条件下增加产热，从而提高能量消耗¹。寒冷刺激后，皮肤的感觉传入信号会抑制下丘脑视前区（POA）中正中视前核（MnPO）的温敏神经元，从而减弱POA神经元对头端缝际苍白核（rRPa）的抑制作用。rRPa神经元的激活会增强交感神经活动，进而导致BAT活性升高^2,3。寒冷诱导的BAT激活可改善人体的胰岛素敏感性⁴，而该活性在体重指数（BMI）较高及年龄较大的人群中有所降低^1,5,6,7。

除了在冷诱导产热中的作用外，在偏瘦的男性人群中，餐后棕色脂肪组织（BAT）的葡萄糖摄取量也会增加，从而促进饮食诱导的产热（DIT），且在BAT阳性男性受试者中该效应更为显著^8,9。目前用于测量BAT活性的先进技术是正电子发射断层扫描-计算机断层扫描（PET-CT）。该方法通过检测放射性示踪剂氟脱氧葡萄糖（¹⁸F-FDG）的积聚来评估BAT活性。然而，PET-CT并不适合作为检测餐后BAT激活状态的首选方法。其中一个原因是，餐后¹⁸F-FDG会与餐后高血糖竞争相同的葡萄糖转运体，导致其无法准确反映餐后BAT的激活情况，尤其是在比较健康个体与糖尿病患者（可能存在血糖浓度差异）的BAT活性时。此外，BAT在产热过程中主要利用脂肪酸作为能量来源，而这一过程无法通过PET-CT观察到。¹⁸F-FDG在餐后BAT中的积聚几乎不可见¹⁰，因此大多数情况下被解读为阴性结果。毫不奇怪的是，最近有研究提出，BAT在人群中的激活程度可能远超我们此前的认知；因此，亟需一种新方法来检测BAT活性及其在代谢紊乱中的作用⁷。为解决这一问题，已有尝试通过磁共振成像（MRI）测量糖尿病前期患者及2型糖尿病（T2DM）伴胰岛素抵抗患者的BAT体积¹¹。然而，MRI测得的BAT体积并不能充分反映BAT在日常状态下对葡萄糖和脂肪酸的实际功能与利用情况。因此，为了准确评估健康个体与T2DM患者之间BAT活性的真实差异，需要一种新的研究方法，以揭示T2DM患者中BAT功能障碍的病理机制。

为确定棕色脂肪组织（BAT）的激活状态，我们采用红外热成像技术（IR）在餐前和餐后测量BAT的产热情况。图1)^12,13将红外热成像确立为测量健康个体、肥胖个体或糖尿病患者餐后棕色脂肪组织（BAT）活性的首选方法，将对该领域产生重大影响。迄今为止，红外热成像主要用于检测寒冷刺激诱导的BAT激活^13,14,15在最近的人类历史中，由于居住环境的充分供暖和适当的衣物保暖，寒冷诱导的棕色脂肪组织（BAT）活性已不再明显，而餐后BAT的激活则每天都会发生。此外，这两种BAT功能的生理调节机制 通过 下丘脑则完全不同。餐后，下丘脑弓状核（Arc）中表达前阿黑皮素原（POMC）的神经元被激活，导致交感神经活动增强 通过 rRPa¹⁶冷诱导的BAT活性检测若采用红外热成像或PET-CT方法，不适合作为日常BAT活性的评估指标。餐后BAT活性升高伴随葡萄糖利用增加，这对于维持葡萄糖稳态、胰岛素敏感性以及每日血糖浓度的调节具有重要意义。餐后BAT激活可促进餐后葡萄糖消耗，继而引起产热增加和体温升高（DIT）。该过程被证实与性别、年龄及BMI相关。¹²在雄性和雌性实验小鼠进食后，BAT 激活的性别差异相似。¹⁷这些发现与Burke等人最近发现的BAT调控中的性别差异相符，他们表明下丘脑对BAT褐变的调控存在性别差异 通过 下丘脑POMC神经元的一个亚群在雄性和雌性小鼠中存在差异¹⁸餐后BAT的激活在女性、老年人群和肥胖人群中较弱。餐后缺乏BAT激活（葡萄糖利用减少）可能导致女性葡萄糖耐量受损的发生率更高^19,20,21,22遗憾的是，目前关于棕色脂肪组织（BAT）激活的大多数研究仅针对男性开展。餐后激活BAT可增加瘦体型男性群体的葡萄糖摄取。在BAT阳性男性受试者中，BAT激活后饮食诱导产热（DIT）升高，这一现象并不意外^8,9此外，将棕色脂肪组织移植到雄性小鼠体内可改善葡萄糖耐量，提高胰岛素敏感性，并降低体重和脂肪量²³.

PET-CT 作为测量棕色脂肪组织（BAT）活性的方法，尤其在餐后效果不佳。因此，研究人员开发了一种非侵入性且更敏感的方法。红外热成像技术能够评估不同实验动物（如基因敲除小鼠）以及人类受试者中 BAT 的活性，且不受性别、年龄或不同病理状况对 BAT 活性影响的限制。该方法的另一优势在于对受试者和实验动物均操作简便，使我们能够评估 BAT 激活疗法的潜在益处。近期 Brasil 等人发表的研究综述了利用红外热成像技术研究冷暴露或进食后 BAT 生理行为的相关进展²⁴。

方案

所有涉及实验动物的实验程序均经国家伦理委员会和农业部批准（EP 185/2018）。实验实施过程遵循克罗地亚实验动物科学学会伦理守则以及ARRIVE指南。所有涉及人类受试者的研究操作均遵循《赫尔辛基宣言》，并经萨格勒布大学医学院伦理委员会批准（UP/I-322-01/18-01/56）。本研究展示了三名女性受试者的研究结果（BMI：29 kg/m² ± 5 kg/m²）。所有人类志愿者均已知情同意参与本研究，并同意其数据被用于展示。

1. 测量餐后人类棕色脂肪组织的激活

注意：实验应在夏季进行，此时每日温度不低于 22 °C，以尽可能保持基础棕色脂肪组织（BAT）活性处于较低水平。

1. 在估计病理性条件下的棕色脂肪组织（BAT）活性时，应谨慎选择对照健康参与者，因为BAT活性受性别、年龄、体重指数（BMI）以及动情周期阶段的影响。
   1. 为了估算女性参与者的月经周期阶段，请询问她们平均月经周期的长度以及上次月经第一天的日期。切记记录实验日期。
      注意：在临床研究中，正确选择匹配的对照受试者是最困难的部分，因为健康对照者与患有病理状况的受试者应尽可能相似，仅在所研究的疾病方面存在差异。
2. 要求参与者充分休息，禁食（禁食期间不摄入任何热量），于上午时段前来参加实验，并至少休息30分钟，以避免肌肉活动期间可能引起的棕色脂肪组织激活 通过 交感神经激活
3. 在测量前15分钟，要求受试者脱去上身衣物，以避免衣物对皮肤表面的加热作用（衣物的热效应）影响基础棕色脂肪组织（BAT）活性的测定。测量应在适宜的室温（22–27 °C）下进行。
4. 进行红外测量。
   1. 在受试者休息期间，将热成像相机（探测器类型：非制冷微测辐射热计；探测器间距：17 µm；相机光谱范围：7.5–14.0 µm；热灵敏度：30 °C时为20 mK；镜头：36 mm；分辨率：1024像素 × 768像素；瞬时视场角[IFOV]：0.47 mRad）安装在三脚架上，并将其置于受试者就座位置前方1 m处。
      注意：如果在较冷的天气条件下进行测量（在50%湿度下，室外空气温度低于15 °C），请先将相机置于室温环境中，并在测量前至少开机预热1小时。由于自动校准功能，低温下的仪器在升温至室温后可能会产生不同的测量结果。
   2. 将热成像仪按照制造商说明连接至计算机及配套软件。在1 m焦距下记录铝箔（揉皱后展平的铝箔）的图像，以确定环境反射温度，该值将显示为测量温度。在热成像仪软件中输入距离为0 m、发射率为1。
      注意：反射表观温度是在将相机的发射率设为1.0、距离设为0 m的条件下，通过对揉皱后展平的铝箔进行测量所获得的参数。反射表观温度代表了环境中入射到探测器上的总红外辐射的近似值。
   3. 开始测量前，立即测定室温与空气湿度（用于后续分析）。不要仅拍摄一张热成像图片，而应录制一段视频。从视频中择取最合适的图像帧用于分析，以降低有价值数据丢失的可能性。
   4. 开始录制前，设置以下参数：视频录制时长为 10–15 秒（或其他所需时长），帧率设为 5 fps（每秒帧数）或其它数值（在本实验条件下，5 fps 已满足最大需求），并按照下文所述设置视频文件的保存路径。
      1. 在主相机窗口上方的软件中，选择从左数第三个图标。在弹出菜单中选择 编辑记录设置，之后将打开一个新窗口。
      2. 在录制模式下，选择 记录到磁盘，其下方设置 此持续时间的记录 在所需时间进行记录。在同一窗口的记录选项中，将记录速率限制为 5 (Hz)，并选择保存记录文件的位置。
      3. 要设置帧率，请关闭现有窗口，然后打开 编辑 在主菜单中，选择 偏好设置在打开窗口的右侧，输入 5 目标帧率在同一窗口下方，选择 热键/远程启动可停止录制，然后从下拉菜单中选择 在启动/停止模式下.
         注意：由于视频会占用大量内存，应尽量制作最短时长、最低帧率的视频。在此设置下，单个视频文件大小约为 100 Mb。
5. 将受试者摆放至颈上锁骨区域（即锁骨上方棕色脂肪组织所在部位）暴露的位置图1)，焦距为1米，按下按钮以5 fps的帧率录制一段短影片（10-15秒） F5 关键。录制将在指定时间停止。
6. 测量时，房间内仅允许受试者和执行测量的人员在场。避免空气流动或气流（如空调引起的气流）。确保受试者远离冷风、阳光（直接或间接照射）以及灯泡等任何热源。
7. 若条件允许，使用标准血糖仪检测指尖毛细血管血的血糖浓度，并使用腋下体温计测量体温。
8. 确保所有受试者食用相同的餐食。注意受试对象的饮食限制和要求（例如，糖尿病患者的餐食）。所有受试者，包括对照组（健康）人群和患有代谢性疾病的人群，均应食用相同的餐食。
   注意：有关糖尿病患者可食用的餐食的更多详细信息，请咨询当地内分泌科医生，或与患有糖尿病的参与者进行讨论。
9. 在餐后预定时间，通过按压开始新的记录 F5 使用相同的设置参数。无需重复记录的设定方案。在餐后30分钟、1小时、2小时和3小时重复测量¹²对于您的具体研究设计，餐后时间可能更短或更长，但我们建议至少包括前三个时间点。
   ​注意：尽管测量过程较快，但参与者人数应限制在四至六人。若参与者人数过多，部分人员的等待时间将过长。

2. 在实验动物进食后测量棕色脂肪组织的激活

注意：由于动物饲养在具有恒定室温和12小时光照/12小时黑暗循环的动物房中，实验可在任何季节进行。实验期间的室温应保持在22 °C至27 °C之间。本研究共检测了六只处于动情间期的雌性动物和六只雄性野生型（WT）C57Bl/6NCrl动物。

1. 根据机构的伦理指南对动物进行麻醉。本研究中，通过腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪（剂量分别为80–100 mg/kg和6–8 mg/kg）实施麻醉。在动物双眼涂抹眼用凝胶，以防止麻醉期间角膜干燥。实验前一日，使用小型动物毛发修剪器剃除实验动物肩胛间区域（肩胛骨之间的皮肤区域）的毛发。
2. 在实验前一天，还需确定雌性动物的动情周期阶段。
   注意：动情周期的阶段通过阴道涂片确定。
   1. 将棉签浸入室温的无菌生理盐水（0.9% NaCl）中，然后插入阴道。用棉签轻轻刮取阴道壁，将附着的细胞涂抹在玻璃载片上，并使其自然风干。
   2. 将动物放回笼中。加入500 µL 0.1%乙酸克里西蓝染色1分钟，随后用清水冲洗3次。
   3. 在100倍放大倍数和明场照明下用光学显微镜观察细胞。根据涂片中观察到的白细胞、有核上皮细胞和角化上皮细胞的数量，确定动情周期的阶段。²⁵.
3. 实验前一晚移除动物的食物（过夜禁食），仅提供水 随意摄取最佳方法是将动物转移到新的清洁笼具中，以避免笼内可能残留的食物。
4. 实验当天早晨，按照测试人类受试者时的方法，设置热成像相机及录像参数。
5. 在进行红外测量前，不要打扰或使动物受到应激。将动物小心地放入一个干净的笼子中（确保其他动物的气味不会影响该动物的交感神经系统）。将笼子置于热成像相机下方，焦距为1 m。通过按下录制按钮记录视频 F5.
6. 在将食物颗粒给予每只动物之前称重，以便计算食物摄入量。让动物在其笼子中进食30分钟，餐后再次称量食物颗粒。本研究中，雌性动物的食物摄入量为0.038 ± 0.004 g/体重。
   注意：如果决定测量血糖浓度，应在餐前进行测量，但需在红外成像（IR）测量之后进行，以确保不会因交感神经系统激活而导致棕色脂肪组织（BAT）活化。
7. 在进餐开始后的指定时间（通常为餐后30分钟、1小时和2小时）重复进行红外测量^17,26.
8. 所有实验完成后，按照上述方法再次检测雌性动物的动情周期阶段（雌性动物可能比预期更早地离开所需的动情周期阶段）。

3. 分析热成像记录

注意：热成像相机软件使用五个变量来计算物体的温度。

1. 分析前在软件中设置以下变量：皮肤发射率 e = 0.98^15,27，反射的室温（根据铝箔图像计算得出），空气温度，相对湿度，物体距离 = 1 m。使用这些参数值通过软件进行分析。
   注意：推荐使用彩虹色谱，因其包含更多色相，便于检测锁骨上方的棕色脂肪组织（BAT）。
2. 对于每段视频，在主窗口右侧的相机软件中输入所列变量。通过移动屏幕底部的播放头或按下 暂停 按钮，从视频中选择合适的帧（图像）。
3. 在主窗口左侧选择所需区域形状，以确定感兴趣区域（ROI）。选择最能对应锁骨上方或锁骨之间的皮肤区域的形状。
4. 选定ROI后，其最小、最大和平均温度将显示在右侧。图像中，红色三角形表示记录到的最高温度点，蓝色三角形表示最低温度点。重复此步骤，对多个帧进行测量，以确保在数秒的记录时间内测得的温度稳定。
5. 通过将餐后BAT上方皮肤区域的最大温度减去餐前的最大温度，确定实验动物餐后BAT活性的增加程度。

结果

确定棕色脂肪组织（BAT）活性最简单的方法是测量人体在餐前和餐后锁骨上区域皮肤表面的最高温度，并计算其差值。更准确的BAT活性计算方法是选择两个感兴趣区域：一个是位于锁骨上区域、覆盖BAT的皮肤区域，另一个是在人体中无BAT分布的锁骨间皮肤区域，作为参考区域（依据PET-CT结果；图1）。BAT活性可通过这两个区域温度的差值直接得出。如图1所示，BAT活性被确定为1.8 °C。为了评估进食后BAT的激活情况，需在餐后指定的时间点重复测量¹²。本研究中，我们对三名女性参与者进行了实验。参与者1和参与者2的体重指数（BMI）分别为23 kg/m²和34 kg/m²，其结果相似。参与者3的BMI最低（18 kg/m²），但餐后BAT活性升高最为显著（图1B，左图）。仅测量锁骨上区域皮肤最高温度并不能准确反映BAT活性，因为即使在餐后3小时，该区域皮肤温度...

讨论

近期研究越来越多地揭示了棕色脂肪组织（BAT）活性在成人及动物肥胖症和糖尿病发生发展中的生理调节作用及其重要性。此外，通过外源性激活剂激活BAT的可能性正成为制药公司的研究靶点。为了准确评估BAT在这些严重疾病中的生理调节作用和病理生理学意义，并探索潜在的治疗策略，红外热成像技术正逐渐成为首选方法。尽管红外（IR）技术正作为一种新兴手段被广泛用于测量BAT活性^{12,13,14,15,17}，但研究中更应关注的并非检测方法本身，而是BAT激活的生理学特性。在人类受试者和实验动物中，需特别注意性别、年龄、动情周期阶段、摄食状态以及可能存在的应激因素。

在人类和实验动物中，餐后棕色脂肪组织（BAT）活性增加的测量结果非常相似¹²

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.1% 醋酸焦油紫	常用化学试剂
测量空气温度和湿度的装置	Kesterl	Kestrel 4200	符合性证书
外部数据存储	至少 1 TB 的硬盘驱动器
玻璃显微镜载玻片	常用
小型棉签	尿道拭子
用于分析的软件	FLIR Systems，美国俄勒冈州威尔逊维尔	FLIR Tools
用于测量的软件	FLIR Systems，美国俄勒冈州威尔逊维尔	ResearchIR 软件	FLIR ResearchIR Max，版本 4.40.12.38（64 位）
Thermac 相机	FLIR Systems，美国俄勒冈州威尔逊维尔	FLIR T-1020