利用数字滴定PCR定量环状RNA

摘要

本方案详细描述了使用反向引物通过数字液滴PCR（dd-PCR）精确定量细胞中环状RNA（circRNA）水平的方法。

摘要

数字滴定聚合酶链式反应（dd-PCR）是最为灵敏的定量方法之一；该方法将反应体系分割成近20,000个油包水微滴，每个微滴独立进行PCR扩增。与传统的实时定量PCR（qPCR）相比，dd-PCR具有多项优势，包括对低丰度靶标的检测准确性更高、无需参考基因进行定量、无需对样本设置技术重复，以及对样本中的抑制物具有较强的耐受性。近年来，dd-PCR已成为基因表达分析和疾病诊断中准确量化目标DNA或RNA的主流方法之一。环状RNA（circRNA）是一类新近发现的、具有共价闭合环状结构的大分子RNA家族，缺乏5'和3'末端。研究表明，circRNA可通过作为RNA结合蛋白和微小RNA的“海绵”来调控基因表达。此外，circRNA可被分泌至体液中，且由于其对核酸外切酶的抗性，使其有望成为疾病诊断的生物标志物。本文旨在介绍如何进行发散引物设计、RNA提取、cDNA合成以及dd-PCR分析，以准确量化细胞中特定环状RNA（circRNA）的表达水平。综上，我们展示了利用dd-PCR对circRNA进行精确定量的方法。

引言

RNA测序技术的最新进展以及新型计算算法的开发，发现了一类不断扩大的非编码RNA家族的新成员，即环状RNA（circular RNA, circRNA）¹。顾名思义，circRNA是一类无游离末端的单链RNA分子。它们通过一种非经典的首尾相连剪接方式——反向剪接（back-splicing）形成，其中上游的剪接受体位点与下游的剪接供体位点共价连接，从而形成稳定的RNA环状结构^1,2。该过程可由多种因素介导，包括存在于环化外显子上下游的反向Alu重复元件，或某些剪接因子及RNA结合蛋白（RBPs）^2,3。仅由外显子或内含子序列生成的环状RNA分别被归类为外显子型circRNA和环状内含子RNA（ci-RNAs）；而部分外显子型circRNA保留了内含子序列，被称为外显子-内含子circRNA（EIcircRNAs）^3,4。circRNA的功能多样，包括作为miRNA和/或RBP的分子海绵、调控转录过程，以及通过翻译成肽段来调节细胞功能^3,

方案

RNA 对 RNase 敏感，因此所有试剂、仪器和工作区域均应保持无 RNase，并小心操作。

1. circRNA 的发散引物设计（见 图1）

1. 通过使用 BEDTools 或 UCSC 基因组浏览器，将反向剪接连接位点坐标之间的外显子/内含子序列连接起来，从 circRNA 注释数据中获取成熟序列^18,19。
2. 通过将 circRNA 总序列长度的最后 100 个核苷酸与 circRNA 序列的前 100 个核苷酸连接，制备长度为 200 个核苷酸的 PCR 模板序列¹⁰。
   注意：如果 circRNA 长度小于 200 个核苷酸，则将其分为两个相等的部分，并将后半部分的核苷酸连接到前半部分的起始处。
3. 使用 Primer3 在线工具，以上述模板序列为基础设计引物，并设置 PCR 产物长度范围为 120–180 个核苷酸²⁰。
4. 对于 Tm 值和引物长度等其他参数，采用 Primer3 的默认设置。circBnc2 的引物序列列于 表....

结果

每个样本中circRNA的绝对数量可从导出的数字滴定PCR（dd-PCR）数据中获得。实时定量PCR分析表明，circBnc2在分化后的C2C12成肌细胞中存在差异表达（数据未显示）。在此，我们旨在检测circBnc2在增殖期C2C12成肌细胞和肌管细胞中的绝对拷贝数。由于需要在两种条件下比较circBnc2的表达水平，因此使用相同的试剂和操作流程，同时对所有样本进行RNA提取、cDNA合成和PCR处理至关重要。为了利用dd-PCR反应对circRNA进行绝对定量，应使用等量的初始总RNA进行cDNA合成，以计算每纳克总RNA中目标RNA分子的确切数量。例如，在进行dd-PCR检测前，取1 µg总RNA用于cDNA合成，并用无核酸酶水稀释至500 µL，以获得2 ng/µL的终浓度（图1）。

如图2A所示，采用增殖状态的C2C12成肌细胞（MB）和分化4天的肌管细胞（MT）中10 ng RNA反转录得到的cDN.......

讨论

环状RNA（circRNA）研究在过去十年中随着高通量测序技术的发现而迅速发展。因此，它被认为是未来RNA治疗中具有潜力的分子。此外，已知circRNA在多种疾病（包括癌症和心血管疾病）中可作为生物标志物^4,8。然而，由于circRNA丰度较低，且仅有一个特异性的反向剪接连接序列可将其与亲本mRNA区分开来，因此其鉴定较为困难⁹。自发现以来，使用反向引物的逆转录PCR（RT-PCR）一直是验证circRNA的金标准技术^9,10。尽管已开发出多种用于circRNA定量的分子方法，但由于其丰度极低，准确测量circRNA表达仍具挑战性。数字滴定PCR（dd-PCR）能够从给定样本中扩增出丰度极低的 RNA/DNA分子¹⁴，因此是准确量化circRNA的最佳方法之一。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 ml 微量离心管	Tarson	500010
0.2 ml 带盖管条	Tarson	610020, 510073
滤芯吸头	Tarson	528104
无 DNase/RNase 蒸馏水	Thermo Fisher Scientific	10977023
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma	P4417
细胞刮刀	HiMedia	TCP223
氯仿	SRL	96764
DNA 稀释液	HiMedia	MB228
随机引物	Thermo Fisher Scientific	48190011
dNTP 混合物	Thermo Fisher Scientific	R0181
鼠源 RNase 抑制剂	NEB	M0314S
Maxima 逆转录酶	Thermo Fisher Scientific	EP0743
QX200 dd-PCR EvaGreen 超混合液	Bio-Rad	1864033
EvaGreen 用液滴生成油	Bio-Rad	1864006
PCR 板热封膜，铝箔，可穿刺	Bio-Rad	1814040
DG8 微滴发生卡盒及垫圈	Bio-Rad	1864007
DG8 卡盒架	Bio-Rad	1863051
QX200 微滴发生仪	Bio-Rad	1864002
ddPCR 96 孔板	Bio-Rad	12001925
PX1 PCR 板封膜仪	Bio-Rad	1814000
C1000 Touch 梯度 PCR 仪，配备 96–深孔反应模块	Bio-Rad	1851197
QX200 微滴读取仪	Bio-Rad	1864003
QuantaSoft 软件	Bio-Rad	1864011
硅胶柱	Umbrella Life Science	38220090
UCSC 基因组浏览器		https://genome.ucsc.edu/
Primer3		https://primer3.ut.ee/