方法文章

利用数字滴定PCR定量环状RNA

4.1K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/64464

⸱

2022年9月16日

 ,  , 
1Institute of Life Sciences, 2School of Biotechnology, KIIT University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案详细描述了使用反向引物通过数字液滴PCR（dd-PCR）精确定量细胞中环状RNA（circRNA）水平的方法。

摘要

数字滴定聚合酶链式反应（dd-PCR）是最为灵敏的定量方法之一；该方法将反应体系分割成近20,000个油包水微滴，每个微滴独立进行PCR扩增。与传统的实时定量PCR（qPCR）相比，dd-PCR具有多项优势，包括对低丰度靶标的检测准确性更高、无需参考基因进行定量、无需对样本设置技术重复，以及对样本中的抑制物具有较强的耐受性。近年来，dd-PCR已成为基因表达分析和疾病诊断中准确量化目标DNA或RNA的主流方法之一。环状RNA（circRNA）是一类新近发现的、具有共价闭合环状结构的大分子RNA家族，缺乏5'和3'末端。研究表明，circRNA可通过作为RNA结合蛋白和微小RNA的“海绵”来调控基因表达。此外，circRNA可被分泌至体液中，且由于其对核酸外切酶的抗性，使其有望成为疾病诊断的生物标志物。本文旨在介绍如何进行发散引物设计、RNA提取、cDNA合成以及dd-PCR分析，以准确量化细胞中特定环状RNA（circRNA）的表达水平。综上，我们展示了利用dd-PCR对circRNA进行精确定量的方法。

引言

RNA测序技术的最新进展以及新型计算算法的开发，发现了一类不断扩大的非编码RNA家族的新成员，即环状RNA（circular RNA, circRNA）1。顾名思义，circRNA是一类无游离末端的单链RNA分子。它们通过一种非经典的首尾相连剪接方式——反向剪接（back-splicing）形成，其中上游的剪接受体位点与下游的剪接供体位点共价连接，从而形成稳定的RNA环状结构1,2。该过程可由多种因素介导，包括存在于环化外显子上下游的反向Alu重复元件，或某些剪接因子及RNA结合蛋白（RBPs）2,3。仅由外显子或内含子序列生成的环状RNA分别被归类为外显子型circRNA和环状内含子RNA（ci-RNAs）；而部分外显子型circRNA保留了内含子序列，被称为外显子-内含子circRNA（EIcircRNAs）3,4。circRNA的功能多样，包括作为miRNA和/或RBP的分子海绵、调控转录过程，以及通过翻译成肽段来调节细胞功能3,5,6,7。多项研究已强调了circRNA在多种疾病及生理过程中的重要作用8。此外，其组织特异性表达模式以及对核酸外切酶降解的抵抗能力，使其成为疾病诊断中具有功能性的生物标志物，并可作为潜在的治疗靶点8。鉴于其在调控健康与疾病状态中的重要意义，准确量化circRNA的表达水平已成为当前亟需解决的关键问题。

已开发出多种生物化学方法用于定量生物样本中的环状RNA（circRNA）9。其中最便捷且被广泛接受的circRNA定量方法之一是采用发散引物对进行逆转录后定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）10。然而，与线性mRNA相比，大多数circRNA的丰度较低，这使得其定量具有挑战性11。为解决这一问题，我们采用数字液滴PCR（dd-PCR）以准确测定特定样本中circRNA的数量。dd-PCR是一种基于微流控原理的先进PCR技术，可在油相中生成多个水相液滴，每个液滴独立进行PCR反应12。反应在各个液滴中进行，并通过液滴读取仪分析，获得目标基因阳性或阴性液滴的数量12。该技术是目前最灵敏的方法，即使样本中仅存在单个拷贝的目标基因，也能实现精确量化。由于其对抑制剂的敏感性较低、精确度更高，并且无需依赖内参基因进行定量，因此相较于传统qPCR具有明显优势13,14,15。dd-PCR已被广泛用作研究和诊断工具，用于目标基因的绝对定量16,17。本文中，我们详细描述了利用发散引物对小鼠C2C12成肌细胞分化过程中的肌管细胞以及增殖期小鼠C2C12成肌细胞中的circRNA进行dd-PCR定量的实验方案。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

RNA 对 RNase 敏感，因此所有试剂、仪器和工作区域均应保持无 RNase，并小心操作。

1. circRNA 的发散引物设计（见 图1）

  1. 通过使用 BEDTools 或 UCSC 基因组浏览器，将反向剪接连接位点坐标之间的外显子/内含子序列连接起来，从 circRNA 注释数据中获取成熟序列18,19。
  2. 通过将 circRNA 总序列长度的最后 100 个核苷酸与 circRNA 序列的前 100 个核苷酸连接，制备长度为 200 个核苷酸的 PCR 模板序列10。
    注意：如果 circRNA 长度小于 200 个核苷酸，则将其分为两个相等的部分，并将后半部分的核苷酸连接到前半部分的起始处。
  3. 使用 Primer3 在线工具，以上述模板序列为基础设计引物，并设置 PCR 产物长度范围为 120–180 个核苷酸20。
  4. 对于 Tm 值和引物长度等其他参数，采用 Primer3 的默认设置。circBnc2 的引物序列列于 表 1 中。
  5. 向任意寡核苷酸合成公司订购反向引物序列进行合成。

2. RNA 提取

注意：使用任何市售试剂盒或实验室自建方法从小鼠C2C12细胞中分离总RNA。本实验所用的实验室自建RNA分离方法此前已有描述21。磁性硅胶珠按照先前发表的方案在实验室中制备22。这些磁性珠也可从多家供应商处购买获得。

  1. 取一个含有约 5 × 106 个增殖期 C2C12 成肌细胞的 10 cm 培养皿，以及一个已分化 4 天的 C2C12 肌管细胞样本用于 RNA 提取。
  2. 用 10 mL 1× PBS 洗涤细胞三次，每次使用移液器弃去 PBS。
  3. 用细胞刮棒在 1 mL 1× PBS 中刮取细胞，于 4 ˚C 下以 750 × g 离心 5 分钟，然后用移液器弃去 PBS。
  4. 加入 1 mL RNA 提取试剂（RIR），通过剧烈吹打使细胞裂解21。
  5. 加入 200 µL 氯仿（RIR 体积的 1/5），涡旋振荡 15 秒。于 4 ˚C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟。
  6. 吸取 400 µL 上层水相，加载至硅胶柱上，室温下以 12,000 × g 离心 1 分钟。将穿流液转移至新离心管中，加入 600 µL 100% 乙醇。
  7. 加入 20 µL 磁性硅胶珠，将离心管置于设定为 25 ˚C、1,200 rpm 的恒温混匀仪中孵育 5 分钟。
    注：磁珠体积可根据裂解所用的初始细胞数量适当增减。磁性硅胶珠可从商业供应商处购买。
  8. 将离心管置于磁力架上 30 秒或直至溶液变澄清。小心使用移液器弃去上清液。
  9. 用 500 µL 含 90% 乙醇的洗涤缓冲液重悬磁性硅胶珠。将离心管置于磁力架上 30 秒。在磁力架上旋转离心管两次以充分洗涤磁珠。待磁珠被磁铁吸附后，用移液器弃去洗涤液。
  10. 重复步骤 2.9 两次。洗涤完成后，短暂离心，再将离心管放回磁力架上静置 30 秒。弃去残留的洗涤缓冲液。将离心管在恒温混匀仪上 50 ˚C、开盖条件下干燥 3 分钟。
  11. 加入 20 µL 无核酸酶水，重悬磁珠。
    注：RNA 洗脱体积可减少至 10 µL，以提高 RNA 浓度。
  12. 将离心管在室温下放置 2–3 分钟。再次置于磁力架上静置 30 秒。将溶解的 RNA 收集至新的离心管中，使用分光光度计进行定量和质量评估。
    注：RNA 可在 −20 ˚C 或 −80 ˚C 长期保存。为获得最佳结果，建议次日进行 cDNA 合成步骤。

3. cDNA 合成

  1. 使用分光光度计测定RNA浓度，并取1 µg RNA用于cDNA合成。
  2. 将1 µg总RNA与1 µL dNTP混合液（dATP、dTTP、dGTP和dCTP各10 mM）、4 µL 5x逆转录酶（RT）缓冲液、2 µL 10x RT随机引物、0.25 µL逆转录酶（200 U/µL）和0.5 µL RNase抑制剂（40 U/µL）混合，用无核酸酶水定容至20 µL。
    注意：逆转录酶的用量可根据用于cDNA合成的初始RNA浓度进行调整。
  3. 轻弹管壁混匀反应液，短暂离心后置于25 ˚C孵育10分钟，随后在50 ˚C孵育1小时。
  4. 为灭活酶活性，将反应管置于85 ˚C加热5分钟。
  5. 将反应管在冰上冷却2分钟，然后加入480 µL无核酸酶水，使cDNA终浓度为2 ng/µL。
    注意：cDNA可于-20 ˚C保存，或直接用于dd-PCR分析。

4. 数字化液滴PCR（dd-PCR）工作流程

注意：数字滴定聚合酶链式反应（dd-PCR）的工作流程包含多个步骤，从样本制备开始，随后进行液滴生成、PCR扩增、液滴计数以及数据分析。由于dd-PCR涉及对产物的绝对定量，无需标准曲线，因此每个步骤对于准确的数据生成都至关重要。下文将详细描述dd-PCR的各个不同步骤。

  1. dd-PCR 反应的准备。
    1. 在 0.2 mL 的 PCR 管或排管中配制 22 µL 的 PCR 反应体系，并设置阴性对照管和 NTC（无模板对照）管。
      注意：每一对用于检测不同 circRNA 的发散引物都必须配备相应的 NTC 反应，同时包括测试样本。
    2. 向阴性对照反应管中加入 11 µL dd-PCR 预混液（例如 EvaGreen Supermix）和 11 µL 无核酸酶水。
      注意：将 dd-PCR 预混液在室温下解冻，随后短暂涡旋以形成均一混合物。使用与稀释 cDNA 时相同的无核酸酶水来配制阴性对照反应管和 NTC 管。
    3. 向 NTC 反应管中加入 11 µL dd-PCR 预混液、5.5 µL 浓度为 1 µM 的 circRNA 特异性正向与反向引物混合液，以及 5.5 µL 无核酸酶水。
      注意：将浓度为 100 µM 的 circRNA 特异性发散引物（正向与反向）稀释并混合，配制成 1 µM 的工作浓度引物混合液；因此，在 22 µL 反应体系中引物的最终浓度为 250 nM。
    4. 向测试反应管中加入 11 µL dd-PCR 预混液、5.5 µL 浓度为 1 µM 的 circRNA 特异性正向与反向引物混合液，以及 5.5 µL cDNA（2 ng/µL）。
    5. 充分涡旋混匀后，短暂离心所有反应管，使均一的反应混合物沉至管底。
  2. 液滴生成。
    1. 使用多通道移液器将 20 µL PCR 混合物从 0.2 mL PCR 管转移至液滴生成仪卡盒的样品孔中。
    2. 使用多通道移液器小心地向液滴生成仪卡盒的油孔中加入 70 µL 液滴生成油。
      ​注意：使用前将液滴生成油在室温下孵育 15 分钟。
    3. 将橡胶垫圈盖在液滴生成仪卡盒上，然后将其放入液滴生成仪中，使样品与油在卡盒的液滴孔中形成液滴混合物。
  3. PCR 扩增。
    1. 使用多通道移液器将 40 µL 液滴混合物从液滴生成仪卡盒的液滴孔中转移至 96 孔 PCR 板。
      注意：转移时应将多通道移液器吸头倾斜对准孔位，小心操作以避免在转移至 dd-PCR 96 孔板过程中破坏液滴。
    2. 用铝箔封膜密封 96 孔 PCR 板，将其置于预热至 80 ˚C 的封膜机加热块中，点击 seal 以完成封膜。
    3. 随后将 PCR 板放入 dd-PCR 梯度 PCR 仪中，按照 表 2 所示程序设置反应条件，其中盖子温度设为 105 ˚C，升降温速率为 2 ˚C/s。
  4. 液滴计数。
    1. PCR 结束后，将 PCR 板正确放置于 dd-PCR 液滴计数仪的板架上，准备进行液滴计数。
    2. 打开液滴分析软件，输入样品信息以设置运行参数。
    3. 点击 setup option，然后点击 template option 以创建新模板。
    4. 通过填写实验详细信息定义每个孔，包括样品名称（所用 cDNA、阴性对照或 NTC）、靶标名称（circRNA 引物名称）、类型（未知）以及实验类型为 ABS（绝对定量），所用 Supermix（dd-PCR EvaGreen Supermix）等。
    5. 最后保存模板，并点击 run 选项开始运行，选择按行或按列进行 counting by row or column-wise。让仪器完成液滴计数，每孔约需 1 分钟。
    6. 液滴读取完成后，点击 Analyze 按钮进行数据分析。
    7. 点击 1D Amplitude 按钮以查看阳性与阴性液滴。
    8. 为区分阳性液滴与阴性液滴，应对所有具有相同靶标的样品设置统一的阈值线。
      注意：每个样品中的总液滴数应超过 10,000 才可用于绝对定量。NTC 样品不应出现阳性液滴计数。 若 NTC 中出现阳性液滴，表明试剂存在污染或引物二聚体扩增。通常难以判断 NTC 中的阳性液滴是由引物二聚体还是非特异性产物引起。建议常规检查引物设计，并避免试剂污染，这是包括 dd-PCR 在内的所有 PCR 实验的通用实践。
    9. 点击 Export 按钮，将 circRNA 计数数据导出为 .csv 文件。导出的数据将显示每个样品中 circRNA 的数量。
    10. 根据每个反应中所用 cDNA 的总量，手动计算每纳克 RNA 中各样品所含 circRNA 的数量。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

每个样本中circRNA的绝对数量可从导出的数字滴定PCR（dd-PCR）数据中获得。实时定量PCR分析表明，circBnc2在分化后的C2C12成肌细胞中存在差异表达（数据未显示）。在此，我们旨在检测circBnc2在增殖期C2C12成肌细胞和肌管细胞中的绝对拷贝数。由于需要在两种条件下比较circBnc2的表达水平，因此使用相同的试剂和操作流程，同时对所有样本进行RNA提取、cDNA合成和PCR处理至关重要。为了利用dd-PCR反应对circRNA进行绝对定量，应使用等量的初始总RNA进行cDNA合成，以计算每纳克总RNA中目标RNA分子的确切数量。例如，在进行dd-PCR检测前，取1 µg总RNA用于cDNA合成，并用无核酸酶水稀释至500 µL，以获得2 ng/µL的终浓度（图1）。

如图2A所示，采用增殖状态的C2C12成肌细胞（MB）和分化4天的肌管细胞（MT）中10 ng RNA反转录得到的cDN...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

环状RNA（circRNA）研究在过去十年中随着高通量测序技术的发现而迅速发展。因此，它被认为是未来RNA治疗中具有潜力的分子。此外，已知circRNA在多种疾病（包括癌症和心血管疾病）中可作为生物标志物4,8。然而，由于circRNA丰度较低，且仅有一个特异性的反向剪接连接序列可将其与亲本mRNA区分开来，因此其鉴定较为困难9。自发现以来，使用反向引物的逆转录PCR（RT-PCR）一直是验证circRNA的金标准技术9,10。尽管已开发出多种用于circRNA定量的分子方法，但由于其丰度极低，准确测量circRNA表达仍具挑战性。数字滴定PCR（dd-PCR）能够从给定样本中扩增出丰度极低的 RNA/DNA分子14，因此是准确量化circRNA的最佳方法之一。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作得到了生命科学研究所的所内资助、DBT研究基金（BT/PR27622/MED/30/1961/2018）以及授予Amaresh C. Panda的惠康信托/DBT印度联盟研究员项目[IA/I/18/2/504017]的支持。我们感谢实验室其他成员对本文的校对。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 ml 微量离心管Tarson500010
0.2 ml 带盖管条Tarson610020, 510073
滤芯吸头Tarson528104
无 DNase/RNase 蒸馏水Thermo Fisher Scientific10977023
磷酸盐缓冲液（PBS）SigmaP4417
细胞刮刀HiMediaTCP223
氯仿SRL96764
DNA 稀释液HiMediaMB228
随机引物Thermo Fisher Scientific48190011
dNTP 混合物Thermo Fisher ScientificR0181
鼠源 RNase 抑制剂NEBM0314S
Maxima 逆转录酶Thermo Fisher ScientificEP0743
QX200 dd-PCR EvaGreen 超混合液Bio-Rad1864033
EvaGreen 用液滴生成油Bio-Rad1864006
PCR 板热封膜，铝箔，可穿刺Bio-Rad1814040
DG8 微滴发生卡盒及垫圈Bio-Rad1864007
DG8 卡盒架Bio-Rad1863051
QX200 微滴发生仪Bio-Rad1864002
ddPCR 96 孔板Bio-Rad12001925
PX1 PCR 板封膜仪Bio-Rad1814000
C1000 Touch 梯度 PCR 仪，配备 96–深孔反应模块Bio-Rad1851197
QX200 微滴读取仪Bio-Rad1864003
QuantaSoft 软件Bio-Rad1864011
硅胶柱Umbrella Life Science38220090
UCSC 基因组浏览器https://genome.ucsc.edu/
Primer3https://primer3.ut.ee/

参考文献

  1. Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PLoS One. 7 (2), 30733(2012).
  2. Chen, L. L., Yang, L. Regulation of circRNA biogenesis. RNA Biology. 12 (4), 381-388 (2015).
  3. Kristensen, L. S., et al. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).
  4. Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).
  5. Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. Circular RNA translation, a path to hidden proteome. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685(2022).
  6. Panda, A. C. Circular RNAs Act as miRNA Sponges. Circular RNAs: Biogenesis and Functions. Xiao, J. , Springer. Singapore. 67-79 (2018).
  7. Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C. Emerging role of circular RNA-protein interactions. Non-Coding RNA. 7 (3), 48(2021).
  8. Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers. Cell Death & Disease. 12 (5), 468(2021).
  9. Pandey, P. R., et al. Methods for analysis of circular RNAs. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566(2020).
  10. Das, A., Das, D., Panda, A. C. Validation of circular RNAs by PCR. PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology. 2392, Humana. New York, NY. 103-114 (2022).
  11. Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
  12. Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
  13. Hayden, R. T., et al. Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).
  14. Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409(2017).
  15. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  16. Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review. Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712(2021).
  17. Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
  18. Lee, B. T., et al. The UCSC genome browser database: 2022 update. Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).
  19. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  20. Untergasser, A., et al. Primer3--new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), 115(2012).
  21. Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads. bioRxiv. , (2020).
  22. Oberacker, P., et al. Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation. Bio-protocol. 9 (20), 3394(2019).
  23. Rački, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples. Plant Methods. 10 (1), 42(2014).
  24. Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations. Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

RNA PCR RNA cDNA

相关文章