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利用数字滴定PCR定量环状RNA

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DOI:

10.3791/64464

2022年9月16日

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本文内容

摘要

本方案详细描述了使用反向引物通过数字液滴PCR(dd-PCR)精确定量细胞中环状RNA(circRNA)水平的方法。

摘要

数字滴定聚合酶链式反应(dd-PCR)是最为灵敏的定量方法之一;该方法将反应体系分割成近20,000个油包水微滴,每个微滴独立进行PCR扩增。与传统的实时定量PCR(qPCR)相比,dd-PCR具有多项优势,包括对低丰度靶标的检测准确性更高、无需参考基因进行定量、无需对样本设置技术重复,以及对样本中的抑制物具有较强的耐受性。近年来,dd-PCR已成为基因表达分析和疾病诊断中准确量化目标DNA或RNA的主流方法之一。环状RNA(circRNA)是一类新近发现的、具有共价闭合环状结构的大分子RNA家族,缺乏5'和3'末端。研究表明,circRNA可通过作为RNA结合蛋白和微小RNA的“海绵”来调控基因表达。此外,circRNA可被分泌至体液中,且由于其对核酸外切酶的抗性,使其有望成为疾病诊断的生物标志物。本文旨在介绍如何进行发散引物设计、RNA提取、cDNA合成以及dd-PCR分析,以准确量化细胞中特定环状RNA(circRNA)的表达水平。综上,我们展示了利用dd-PCR对circRNA进行精确定量的方法。

引言

RNA测序技术的最新进展以及新型计算算法的开发,发现了一类不断扩大的非编码RNA家族的新成员,即环状RNA(circular RNA, circRNA)1。顾名思义,circRNA是一类无游离末端的单链RNA分子。它们通过一种非经典的首尾相连剪接方式——反向剪接(back-splicing)形成,其中上游的剪接受体位点与下游的剪接供体位点共价连接,从而形成稳定的RNA环状结构1,2。该过程可由多种因素介导,包括存在于环化外显子上下游的反向Alu重复元件,或某些剪接因子及RNA结合蛋白(RBPs)2,3。仅由外显子或内含子序列生成的环状RNA分别被归类为外显子型circRNA和环状内含子RNA(ci-RNAs);而部分外显子型circRNA保留了内含子序列,被称为外显子-内含子circRNA(EIcircRNAs)3,4。circRNA的功能多样,包括作为miRNA和/或RBP的分子海绵、调控转录过程,以及通过翻译成肽段来调节细胞功能3,5,6,7。多项研究已强调了circRNA在多种疾病及生理过程中的重要作用8。此外,其组织特异性表达模式以及对核酸外切酶降解的抵抗能力,使其成为疾病诊断中具有功能性的生物标志物,并可作为潜在的治疗靶点8。鉴于其在调控健康与疾病状态中的重要意义,准确量化circRNA的表达水平已成为当前亟需解决的关键问题。

已开发出多种生物化学方法用于定量生物样本中的环状RNA(circRNA)9。其中最便捷且被广泛接受的circRNA定量方法之一是采用发散引物对进行逆转录后定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)10。然而,与线性mRNA相比,大多数circRNA的丰度较低,这使得其定量具有挑战性11。为解决这一问题,我们采用数字液滴PCR(dd-PCR)以准确测定特定样本中circRNA的数量。dd-PCR是一种基于微流控原理的先进PCR技术,可在油相中生成多个水相液滴,每个液滴独立进行PCR反应12。反应在各个液滴中进行,并通过液滴读取仪分析,获得目标基因阳性或阴性液滴的数量12。该技术是目前最灵敏的方法,即使样本中仅存在单个拷贝的目标基因,也能实现精确量化。由于其对抑制剂的敏感性较低、精确度更高,并且无需依赖内参基因进行定量,因此相较于传统qPCR具有明显优势13,14,15。dd-PCR已被广泛用作研究和诊断工具,用于目标基因的绝对定量16,17。本文中,我们详细描述了利用发散引物对小鼠C2C12成肌细胞分化过程中的肌管细胞以及增殖期小鼠C2C12成肌细胞中的circRNA进行dd-PCR定量的实验方案。

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方案

RNA 对 RNase 敏感,因此所有试剂、仪器和工作区域均应保持无 RNase,并小心操作。

1. circRNA 的发散引物设计(见 图1

  1. 通过使用 BEDTools 或 UCSC 基因组浏览器,将反向剪接连接位点坐标之间的外显子/内含子序列连接起来,从 circRNA 注释数据中获取成熟序列18,19
  2. 通过将 circRNA 总序列长度的最后 100 个核苷酸与 circRNA 序列的前 100 个核苷酸连接,制备长度为 200 个核苷酸的 PCR 模板序列10
    注意:如果 circRNA 长度小于 200 个核苷酸,则将其分为两个相等的部分,并将后半部分的核苷酸连接到前半部分的起始处。
  3. 使用 Primer3 在线工具,以上述模板序列为基础设计引物,并设置 PCR 产物长度范围为 120–180 个核苷酸20
  4. 对于 Tm 值和引物长度等其他参数,采用 Primer3 的默认设置。circBnc2 的引物序列列于 表 1 中。
  5. 向任意寡核苷酸合成公司订购反向引物序列进行合成。

2. RNA 提取

注意:使用任何市售试剂盒或实验室自建方法从小鼠C2C12细胞中分离总RNA。本实验所用的实验室自建RNA分离方法此前已有描述21。磁性硅胶珠按照先前发表的方案在实验室中制备22。这些磁性珠也可从多家供应商处购买获得。

  1. 取一个含有约 5 × 106 个增殖期 C2C12 成肌细胞的 10 cm 培养皿,以及一个已分化 4 天的 C2C12 肌管细胞样本用于 RNA 提取。
  2. 用 10 mL 1× PBS 洗涤细胞三次,每次使用移液器弃去 PBS。
  3. 用细胞刮棒在 1 mL 1× PBS 中刮取细胞,于 4 ˚C 下以 750 × g 离心 5 分钟,然后用移液器弃去 PBS。
  4. 加入 1 mL RNA 提取试剂(RIR),通过剧烈吹打使细胞裂解21
  5. 加入 200 µL 氯仿(RIR 体积的 1/5),涡旋振荡 15 秒。于 4 ˚C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟。
  6. 吸取 400 µL 上层水相,加载至硅胶柱上,室温下以 12,000 × g 离心 1 分钟。将穿流液转移至新离心管中,加入 600 µL 100% 乙醇。
  7. 加入 20 µL 磁性硅胶珠,将离心管置于设定为 25 ˚C、1,200 rpm 的恒温混匀仪中孵育 5 分钟。
    注:磁珠体积可根据裂解所用的初始细胞数量适当增减。磁性硅胶珠可从商业供应商处购买。
  8. 将离心管置于磁力架上 30 秒或直至溶液变澄清。小心使用移液器弃去上清液。
  9. 用 500 µL 含 90% 乙醇的洗涤缓冲液重悬磁性硅胶珠。将离心管置于磁力架上 30 秒。在磁力架上旋转离心管两次以充分洗涤磁珠。待磁珠被磁铁吸附后,用移液器弃去洗涤液。
  10. 重复步骤 2.9 两次。洗涤完成后,短暂离心,再将离心管放回磁力架上静置 30 秒。弃去残留的洗涤缓冲液。将离心管在恒温混匀仪上 50 ˚C、开盖条件下干燥 3 分钟。
  11. 加入 20 µL 无核酸酶水,重悬磁珠。
    注:RNA 洗脱体积可减少至 10 µL,以提高 RNA 浓度。
  12. 将离心管在室温下放置 2–3 分钟。再次置于磁力架上静置 30 秒。将溶解的 RNA 收集至新的离心管中,使用分光光度计进行定量和质量评估。
    注:RNA 可在 −20 ˚C 或 −80 ˚C 长期保存。为获得最佳结果,建议次日进行 cDNA 合成步骤。

3. cDNA 合成

  1. 使用分光光度计测定RNA浓度,并取1 µg RNA用于cDNA合成。
  2. 将1 µg总RNA与1 µL dNTP混合液(dATP、dTTP、dGTP和dCTP各10 mM)、4 µL 5x逆转录酶(RT)缓冲液、2 µL 10x RT随机引物、0.25 µL逆转录酶(200 U/µL)和0.5 µL RNase抑制剂(40 U/µL)混合,用无核酸酶水定容至20 µL。
    注意:逆转录酶的用量可根据用于cDNA合成的初始RNA浓度进行调整。
  3. 轻弹管壁混匀反应液,短暂离心后置于25 ˚C孵育10分钟,随后在50 ˚C孵育1小时。
  4. 为灭活酶活性,将反应管置于85 ˚C加热5分钟。
  5. 将反应管在冰上冷却2分钟,然后加入480 µL无核酸酶水,使cDNA终浓度为2 ng/µL。
    注意:cDNA可于-20 ˚C保存,或直接用于dd-PCR分析。

4. 数字化液滴PCR(dd-PCR)工作流程

注意:数字滴定聚合酶链式反应(dd-PCR)的工作流程包含多个步骤,从样本制备开始,随后进行液滴生成、PCR扩增、液滴计数以及数据分析。由于dd-PCR涉及对产物的绝对定量,无需标准曲线,因此每个步骤对于准确的数据生成都至关重要。下文将详细描述dd-PCR的各个不同步骤。

  1. dd-PCR 反应的准备。
    1. 在 0.2 mL 的 PCR 管或排管中配制 22 µL 的 PCR 反应体系,并设置阴性对照管和 NTC(无模板对照)管。
      注意:每一对用于检测不同 circRNA 的发散引物都必须配备相应的 NTC 反应,同时包括测试样本。
    2. 向阴性对照反应管中加入 11 µL dd-PCR 预混液(例如 EvaGreen Supermix)和 11 µL 无核酸酶水。
      注意:将 dd-PCR 预混液在室温下解冻,随后短暂涡旋以形成均一混合物。使用与稀释 cDNA 时相同的无核酸酶水来配制阴性对照反应管和 NTC 管。
    3. 向 NTC 反应管中加入 11 µL dd-PCR 预混液、5.5 µL 浓度为 1 µM 的 circRNA 特异性正向与反向引物混合液,以及 5.5 µL 无核酸酶水。
      注意:将浓度为 100 µM 的 circRNA 特异性发散引物(正向与反向)稀释并混合,配制成 1 µM 的工作浓度引物混合液;因此,在 22 µL 反应体系中引物的最终浓度为 250 nM。
    4. 向测试反应管中加入 11 µL dd-PCR 预混液、5.5 µL 浓度为 1 µM 的 circRNA 特异性正向与反向引物混合液,以及 5.5 µL cDNA(2 ng/µL)。
    5. 充分涡旋混匀后,短暂离心所有反应管,使均一的反应混合物沉至管底。
  2. 液滴生成。
    1. 使用多通道移液器将 20 µL PCR 混合物从 0.2 mL PCR 管转移至液滴生成仪卡盒的样品孔中。
    2. 使用多通道移液器小心地向液滴生成仪卡盒的油孔中加入 70 µL 液滴生成油。
      ​注意:使用前将液滴生成油在室温下孵育 15 分钟。
    3. 将橡胶垫圈盖在液滴生成仪卡盒上,然后将其放入液滴生成仪中,使样品与油在卡盒的液滴孔中形成液滴混合物。
  3. PCR 扩增。
    1. 使用多通道移液器将 40 µL 液滴混合物从液滴生成仪卡盒的液滴孔中转移至 96 孔 PCR 板。
      注意:转移时应将多通道移液器吸头倾斜对准孔位,小心操作以避免在转移至 dd-PCR 96 孔板过程中破坏液滴。
    2. 用铝箔封膜密封 96 孔 PCR 板,将其置于预热至 80 ˚C 的封膜机加热块中,点击 seal 以完成封膜。
    3. 随后将 PCR 板放入 dd-PCR 梯度 PCR 仪中,按照 表 2 所示程序设置反应条件,其中盖子温度设为 105 ˚C,升降温速率为 2 ˚C/s。
  4. 液滴计数。
    1. PCR 结束后,将 PCR 板正确放置于 dd-PCR 液滴计数仪的板架上,准备进行液滴计数。
    2. 打开液滴分析软件,输入样品信息以设置运行参数。
    3. 点击 setup option,然后点击 template option 以创建新模板。
    4. 通过填写实验详细信息定义每个孔,包括样品名称(所用 cDNA、阴性对照或 NTC)、靶标名称(circRNA 引物名称)、类型(未知)以及实验类型为 ABS(绝对定量),所用 Supermix(dd-PCR EvaGreen Supermix)等。
    5. 最后保存模板,并点击 run 选项开始运行,选择按行或按列进行 counting by row or column-wise。让仪器完成液滴计数,每孔约需 1 分钟。
    6. 液滴读取完成后,点击 Analyze 按钮进行数据分析。
    7. 点击 1D Amplitude 按钮以查看阳性与阴性液滴。
    8. 为区分阳性液滴与阴性液滴,应对所有具有相同靶标的样品设置统一的阈值线。
      注意:每个样品中的总液滴数应超过 10,000 才可用于绝对定量。NTC 样品不应出现阳性液滴计数。 若 NTC 中出现阳性液滴,表明试剂存在污染或引物二聚体扩增。通常难以判断 NTC 中的阳性液滴是由引物二聚体还是非特异性产物引起。建议常规检查引物设计,并避免试剂污染,这是包括 dd-PCR 在内的所有 PCR 实验的通用实践。
    9. 点击 Export 按钮,将 circRNA 计数数据导出为 .csv 文件。导出的数据将显示每个样品中 circRNA 的数量。
    10. 根据每个反应中所用 cDNA 的总量,手动计算每纳克 RNA 中各样品所含 circRNA 的数量。

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结果

每个样本中circRNA的绝对数量可从导出的数字滴定PCR(dd-PCR)数据中获得。实时定量PCR分析表明,circBnc2在分化后的C2C12成肌细胞中存在差异表达(数据未显示)。在此,我们旨在检测circBnc2在增殖期C2C12成肌细胞和肌管细胞中的绝对拷贝数。由于需要在两种条件下比较circBnc2的表达水平,因此使用相同的试剂和操作流程,同时对所有样本进行RNA提取、cDNA合成和PCR处理至关重要。为了利用dd-PCR反应对circRNA进行绝对定量,应使用等量的初始总RNA进行cDNA合成,以计算每纳克总RNA中目标RNA分子的确切数量。例如,在进行dd-PCR检测前,取1 µg总RNA用于cDNA合成,并用无核酸酶水稀释至500 µL,以获得2 ng/µL的终浓度(图1)。

图2A所示,采用增殖状态的C2C12成肌细胞(MB)和分化4天的肌管细胞(MT)中10 ng RNA反转录得到的cDN...

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讨论

环状RNA(circRNA)研究在过去十年中随着高通量测序技术的发现而迅速发展。因此,它被认为是未来RNA治疗中具有潜力的分子。此外,已知circRNA在多种疾病(包括癌症和心血管疾病)中可作为生物标志物4,8。然而,由于circRNA丰度较低,且仅有一个特异性的反向剪接连接序列可将其与亲本mRNA区分开来,因此其鉴定较为困难9。自发现以来,使用反向引物的逆转录PCR(RT-PCR)一直是验证circRNA的金标准技术9,10。尽管已开发出多种用于circRNA定量的分子方法,但由于其丰度极低,准确测量circRNA表达仍具挑战性。数字滴定PCR(dd-PCR)能够从给定样本中扩增出丰度极低的 RNA/DNA分子14,因此是准确量化circRNA的最佳方法之一。

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作得到了生命科学研究所的所内资助、DBT研究基金(BT/PR27622/MED/30/1961/2018)以及授予Amaresh C. Panda的惠康信托/DBT印度联盟研究员项目[IA/I/18/2/504017]的支持。我们感谢实验室其他成员对本文的校对。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 ml 微量离心管Tarson500010
0.2 ml 带盖管条Tarson610020, 510073
滤芯吸头Tarson528104
无 DNase/RNase 蒸馏水Thermo Fisher Scientific10977023
磷酸盐缓冲液(PBS)SigmaP4417
细胞刮刀HiMediaTCP223
氯仿SRL96764
DNA 稀释液HiMediaMB228
随机引物Thermo Fisher Scientific48190011
dNTP 混合物Thermo Fisher ScientificR0181
鼠源 RNase 抑制剂NEBM0314S
Maxima 逆转录酶Thermo Fisher ScientificEP0743
QX200 dd-PCR EvaGreen 超混合液Bio-Rad1864033
EvaGreen 用液滴生成油Bio-Rad1864006
PCR 板热封膜,铝箔,可穿刺Bio-Rad1814040
DG8 微滴发生卡盒及垫圈Bio-Rad1864007
DG8 卡盒架Bio-Rad1863051
QX200 微滴发生仪Bio-Rad1864002
ddPCR 96 孔板Bio-Rad12001925
PX1 PCR 板封膜仪Bio-Rad1814000
C1000 Touch 梯度 PCR 仪,配备 96–深孔反应模块Bio-Rad1851197
QX200 微滴读取仪Bio-Rad1864003
QuantaSoft 软件Bio-Rad1864011
硅胶柱Umbrella Life Science38220090
UCSC 基因组浏览器https://genome.ucsc.edu/
Primer3https://primer3.ut.ee/

参考文献

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标签

RNA PCR RNA cDNA

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