本研究旨在评估和综述Artemia salina的致死性生物测定方法，也称为卤虫致死性试验。该方法简单且成本低廉，可用于获取样品（特别是天然产物）的一般毒性信息（被视为初步的毒性评价）。
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方法文章
利用Artemia salina L. 进行致死率生物测定
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
天然产物自古以来就被用于药物的制备。如今，已有大量来源于天然物质的化疗药物被用于治疗多种疾病。然而，这些化合物中的大多数往往表现出系统性毒性和不良反应。为了更好地评估选定的潜在生物活性样品的耐受性，可采用卤虫（Artemia）Artemia salina通常被用作致死性研究的模型。 A. salina 该检测基于所研究的生物活性化合物对甲壳类动物幼虫期（无节幼体）的杀灭能力。与许多其他检测方法相比，该方法可作为细胞毒性研究以及合成、半合成和天然产物的一般毒性筛选的简便、快速且低成本的初步手段。体外 细胞或酵母菌株、斑马鱼、啮齿类动物）通常适用于上述目的；此外，该方法即使未经任何专门培训也易于操作。总体而言， A. salina 该检测方法可作为选定化合物初步毒性评价及天然产物提取物生物导向分离的有力工具。
引言
多年来，由于植物、动物或微生物来源的天然产物具有多种生物学和药理学活性，其在新型生物活性分子开发中日益受到关注1。然而，这些物质在用作抗癌药物时，常伴随副作用、耐药性或靶向特异性不足等问题，这些是导致治疗效果不佳的主要因素1,2。
近几十年来，已发现多种源自植物的细胞毒性物质，其中一些已被用作抗癌药物1,2,3。在此背景下，紫杉醇被认为是已知最著名且活性最强的天然来源化疗药物之一3,4。目前估计，市售所有药物中超过35%来源于天然产物或受其启发而开发5。由于这些化合物可能具有较高毒性，在研究的各个阶段均需予以充分考虑，因为不同类型的污染物甚至植物自身的代谢成分都可能引起毒性作用。因此，应在初步阶段开展药理学和毒理学评价，以评估新型植物源治疗剂的生物活性与安全性。为评估新型生物活性样品的毒性，无脊椎动物可作为理想的研究模型，其伦理要求最低，并可进行初步的in ....
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方案
1. 仪器准备
- 购置市售的孵化设备。选择合适的位置安装孵化设备（图2A）。将漏斗形容器放入配套的黑色支架中，并将漏斗朝向合适的方向，以便观察液位刻度和活塞。
- 制作手工迁移装置时，将两个0.5 L（直径5.8 cm）的塑料瓶顶部切除，使最终高度为12 cm。在每个瓶子距底部7 cm处的一侧开一个直径为1.5 cm的孔，然后在两个孔之间插入一段13 cm长的橡胶管（外径1.3 cm，内径0.9 cm）。用热熔胶密封接口（图2B），静置干燥15分钟；将瓶子置于水平面上，加水检查是否漏水。
2. 人工盐溶液的制备
- 在玻璃烧杯中，配制浓度为 35 g/L 的人工盐溶液（卤虫盐）。根据生产商说明，向 800 mL 自来水中加入 28 g 盐，用玻璃棒搅拌，直至盐完全溶解。
注意：根据可用容器的大小调整所配制盐水溶液的体积。
3. 样品制备
- 在微量离心管中制备所有样品，将适量的提取物（Plectranthus 提取物，Pa- P. ambigerus；P....
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结果
本研究通过卤虫致死生物测定法评估了本课题组近期研究的某些天然产物的一般毒性。测试了已知具有抗氧化活性（未发表结果）的Plectranthus属的四种提取物（Pa- P. ambigerus；Pb- P. barbatus；Pc- P. cylindraceus；和 Pe- P. ecklonii）。此外，还研究了从Plectranthus spp.中获得的两种天然化合物（1和2），以及三种半合成衍生物（3、4、5；图3），这些化合物均在另一项研究中已有描述3。本文报道了它们在潜在细胞毒活性方面的初步评价结果。
所有测试提取物均表现出非常令人鼓舞的结果，死亡率极低，与空白组（盐溶液）和阴性对照组（DMSO）记录的结果相当（图4）。相反，在纯化合物1-5中，只有化合物5在100 ppm浓度下表现出较低的死亡率（2........
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讨论
近年来，科学界对毒性筛选的替代模型给予了越来越多的关注21。旁边 A. salina 致死性生物测定，其他通常用于评估样品耐受性的方法还包括脊椎动物生物测定（如啮齿类动物）、无脊椎动物（如斑马鱼） 体外 使用酵母菌株或细胞的方法，以及 计算机模拟 方法22,23,24,25所有这些方法在考虑所花费的资金和时间、结果的可重复性以及待分析样本的类型时，均具有明确的优缺点。例如， 计算机模拟 这些方法代表了一种标准化且低成本的技术路线，所需设备极少。然而，当此类研究仅针对单一目标时，所获得的结果质量较差，因此在初步筛查中不适用，正如本研究中所展示的那样25,26
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披露
作者声明不存在任何经济或其他方面的利益冲突。
致谢
纪念 Amilcar Roberto 教授
本工作由葡萄牙科学技术基金会（FCT）资助，项目编号为 UIDB/04567/2020 和 UIDP/04567/2020（授予 CBIOS），以及博士奖学金 SFRH/BD/137671/2018（Vera Isca）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24孔板 | 赛默飞世尔科技，丹麦 | 174899 | 赛默飞世尔科技 Nunc Up Cell 24 孔培养皿 |
| 铝箔 | 阿尔巴尔 | - | 可在超市购买 |
| Artemio Set | JBL GmbH and Co. KG，德国诺伊霍芬，邮编 D-67141 | 61066000 | 可在宠物店购买 |
| 双目显微镜 | 比利时凯蒂 | 1700.0000 | Flexum-24AED，220-240 V，50 Hz |
| 瓶子 | - | - | 0.5 L 直径：5.8 cm；高度：12 cm |
| 卤虫卵囊 | JBL GmbH 和 Co. KG，德国诺伊霍芬，邮编 D-67141 | 3090700 | 可在宠物店购买 |
| 卤虫盐 | JBL GmbH 和 Co. KG，德国诺伊霍芬，邮编 67141 | 3090600 | 可在宠物店购买 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | VWR 化学品 | CAS：67-68-5 | 99% 纯度 |
| 一次性吸头 | 钻石 | F171500 | 体积范围：100 - 1000 µL |
| Eppendorf 微量离心管 | BRAND | 7,80,546 | 微量离心管，聚丙烯材质，2 mL，BIO-CERT认证 PCR 质量 |
| 锥形瓶 | VWR 化学品 | 4,47,109 | 体积：100 mL |
| 玻璃烧杯 | 诺马克斯 | 3.2111654N | 体积：1000 mL |
| 手套 | 卢娜手套 | GLSP3 | - |
| GraphPad Prism | GraphPad 软件公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥 | - | GraphPad Prism 版本 5.00 for Windows，www.graphpad.com，于 2021 年 2 月 5 日访问；商业统计分析软件 |
| 自制卤虫（A. salina）培养装置 | - | - | 自制装置：两个塑料瓶通过一根软管连接 |
| 热熔胶 | 帕克斯赛德 | PHP500E3 | 230 V，50 Hz，25 W |
| 培养箱 | Heidolph Instruments，丹麦 | - | 一台 Heidolph Unimax 1010 设备和一台 Heidolph Inkubator 1006 |
| 光 | Roblan | SKYC3008FE14 | LED灯泡 |
| 微量移液器 | VWR 化学品 | 613-5265 | 体积范围：100 - 1000 µL |
| 重铬酸钾（K2Cr2O7) | VWR 化学品 | CAS：7778-50-9 | 99% 纯度 |
| Pump ProAir a50 | JBL GmbH and Co. KG，德国诺伊霍芬，邮编 D-67141 | - | 包含在 Artemio Set+1 试剂盒中 |
| 橡胶管 | - | - | 1.3 cm 外径和 0.9 cm 内径 |
| 玻璃棒 | VWR 化学品 | 441-0147 | <图像 替代文本="公式 1" src="/files/ftp_upload/64472/64472eq02.jpg" 样式="margin: auto;"/> 6 mm，250 mm |
| 温度计 | VWR 化学品 | 620-0821 | 0 - 100 °C |
参考文献
- Ntungwe, N. E., et al. Artemia species: An important tool to screen general toxicity samples. Current Pharmaceutical Design. 26 (24), 2892-2908 (2020).
- Cragg, G. M., Newman, D. J. Natural products: A continuing sour....
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