方法文章

利用Artemia salina L. 进行致死率生物测定

DOI：

10.3791/64472

⸱

2022年10月11日

 ,  ,  ,  ,  , 
1CBIOS - Lusófona University's Center for Research in Biosciences & Health Technologies, Universidade Lusófona de Humanidades e Tecnologias, 2Facultad de Farmacia, Departamento de Ciencias Biomédicas (Área de Farmacologia; Nuevos agentes antitumorales, Acción tóxica sobre células leucémicas), Universidad de Alcalá de Henares, 3Instituto de Investigação do Medicamento (iMed.ULisboa), Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究旨在评估和综述Artemia salina的致死性生物测定方法，也称为卤虫致死性试验。该方法简单且成本低廉，可用于获取样品（特别是天然产物）的一般毒性信息（被视为初步的毒性评价）。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

天然产物自古以来就被用于药物的制备。如今，已有大量来源于天然物质的化疗药物被用于治疗多种疾病。然而，这些化合物中的大多数往往表现出系统性毒性和不良反应。为了更好地评估选定的潜在生物活性样品的耐受性，可采用卤虫（Artemia）Artemia salina通常被用作致死性研究的模型。 A. salina 该检测基于所研究的生物活性化合物对甲壳类动物幼虫期（无节幼体）的杀灭能力。与许多其他检测方法相比，该方法可作为细胞毒性研究以及合成、半合成和天然产物的一般毒性筛选的简便、快速且低成本的初步手段。体外 细胞或酵母菌株、斑马鱼、啮齿类动物）通常适用于上述目的；此外，该方法即使未经任何专门培训也易于操作。总体而言， A. salina 该检测方法可作为选定化合物初步毒性评价及天然产物提取物生物导向分离的有力工具。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

多年来，由于植物、动物或微生物来源的天然产物具有多种多样的生物学和药理学活性，其在新型生物活性分子开发中日益受到关注1。然而，这些物质在用作抗癌药物时，常伴随副作用、耐药性或靶向特异性不足等问题，这些是导致治疗效果不佳的主要因素1,2。

近几十年来，已发现多种源自植物的细胞毒性物质，其中一些已被用作抗癌药物1,2,3。在此背景下，紫杉醇被认为是已知最著名且活性最强的天然来源化疗药物之一3,4。目前估计，市场上超过35%的药物来源于天然产物或受其启发而开发5。由于这些化合物可能具有较高的毒性，在研究的各个阶段均需予以充分考虑，因为不同类型的污染物甚至植物自身的代谢成分都可能引起毒性作用。因此，应在初步阶段开展药理学和毒理学评价，以评估新型植物源治疗剂的生物活性与安全性。为评估新型生物活性样品的毒性，无脊椎动物可作为理想的研究模型，其伦理要求最低，并可进行初步的in vitro实验，从而优先筛选出最有前景的候选物，用于后续在脊椎动物中的进一步测试1,6。

通常称为卤虫， A. salina 是一种属于嗜盐性小型无脊椎动物，隶属于盐生属 卤虫 （卤虫科，无甲目，甲壳亚门； 图1）。在海洋和水生盐渍生态系统中，卤虫作为重要的营养来源，以微藻为食，是构成浮游动物的重要组成部分，被用于鱼类的饵料。此外，其幼虫（称为无节幼体）在初步研究中被广泛用于评估一般毒性1,3,7.

Artemia spp. 广泛用于致死性研究，也是评估潜在生物活性化合物毒性的便捷起点，其原理是通过检测这些化合物对实验室培养的无节幼体的致死作用来评估毒性1,8。因此，A. salina 在一般毒性研究中受到关注，因为与其他动物模型实验相比，该方法非常高效且易于操作9。

由于无脊椎动物结构简单、体型微小且生命周期短，因此在单次实验中可研究大量个体。这使得它们兼具遗传操作的便利性以及适用于大规模筛选的低成本优势1。在此背景下，利用卤虫进行一般毒性检测具有多项优势，例如生长迅速（从孵化到获得初步结果仅需28–72小时）、成本低廉，以及商用卵可长期保存，实现全年使用3,10。然而，由于无脊椎动物器官系统较为原始，且缺乏适应性免疫系统，因此并不能完全可靠地模拟人体细胞的反应1。

然而，它为所选样品的总体毒性提供了一种初步评估方法。由于该方法被广泛用作致死率检测，因此可对潜在抗癌剂的毒性效应提供初步的指示。它还常用于获取有关具有其他任何生物活性化合物总体毒性的反馈信息，对于这些化合物而言，必须在卤虫（Artemia）虾中表现出尽可能低的死亡率。

在我们课题组的一项持续研究中，Plectranthus 属植物的不同提取物表现出抗氧化和抗菌活性（未发表结果）。同时，通过提取物的纯化获得单体化合物，并对其进行化学修饰。随后对提取物、纯化合物及半合成衍生物进行了一般毒性的测试。在此背景下，本文旨在概述利用Artemia致死率生物测定法评估来自Plectranthus属不同植物的生物活性提取物及单体化合物的一般毒性及潜在细胞毒活性的应用11。

显微镜下的介形虫、水生生物图像，突出显示生物样本观察。
图1：Artemia salina 的显微镜图像。 显微镜下观察到的 A. salina 刚孵化的无节幼体（放大倍数 12x）。请点击此处查看此图的放大版本。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 仪器设备准备

  1. 购置市售的孵化设备。选择合适的位置安装孵化设备（图2A）。将漏斗形容器放入配套的黑色支架中，并将漏斗朝向合适的方向，以便观察液位刻度和出水阀。
  2. 制作手动迁移装置时，取两个0.5 L（直径5.8 cm）的塑料瓶，剪去瓶口部分，使瓶体最终高度为12 cm。在每个瓶身距底部7 cm处的一侧开一个直径为1.5 cm的孔，将一根长13 cm的橡胶管（外径1.3 cm，内径0.9 cm）连接两个孔。用热熔胶密封接口处（图2B），静置干燥15分钟；将瓶子置于水平面上，加水检查是否漏水。

2. 人工盐溶液的制备

  1. 在玻璃烧杯中，按 35 g/L 的浓度配制人工盐溶液（卤虫盐）。根据生产商说明书，向 800 mL 自来水中加入 28 g 盐，用玻璃棒搅拌至盐完全溶解。
    注意：根据可用容器的大小调整所配制盐水溶液的体积。

3. 样品制备

  1. 在微量离心管中制备所有样品，将适量的提取物（Plectranthus 提取物，Pa- P. ambigerus；Pb- P. barbatus；Pc- P. cylindraceus；Pe- P. ecklonii）或化合物 1–5（两种从 Plectranthus spp. 获得的天然化合物 [1 和 2] 以及三种半合成衍生物 [3, 4, 5]；图3）溶解于二甲基亚砜（DMSO）12 中，使终浓度达到 10 mg/mL（若样品可溶于水，则无需使用 DMSO）。
  2. 在新的微量离心管中，用步骤 2.1 配制的人工生理盐水溶液 990 µL 稀释每种样品（以及阴性对照用的 DMSO）各 10 µL，使终浓度为 0.1 mg/mL。
  3. 在通风橱内的锥形瓶中，用蒸馏水配制浓度为 1 mg/mL 的重铬酸钾（K2Cr2O7）溶液13,14,15。

4. 卤虫致死率生物测定

注意：本实验方法基于多位作者的研究成果并加以改进1,16,17,18,19。

  1. 将步骤 2.1 中制备的培养液加入孵化容器中，直至液面达到刻度线（500 mL）（图 2C）。
  2. 取一勺盐水丰年虾卵（约 0.75 g）放入盐溶液中，然后盖上容器。将一盏灯（台灯，40 W，230 V，50 Hz，配备 8 W、4,000 K、830 lm 的 LED 灯泡）直接对准设备（图 2A），并打开电源。
  3. 将供气系统（输出功率 3 W，50 Hz，230 V）连接至设备顶部的接口，并启动气泵。
  4. 保持室温为 25 ± 3 °C。在人工盐溶液中，经充分通气、持续光照和恒定温度条件下，丰年虾卵在 24 至 48 小时内孵化。
    注：也可使用垂直式培养箱。
  5. 卵孵化后，关闭气泵，静置直至无节幼体（向漏斗底部移动）与空卵壳（漂浮于顶部）分离。
  6. 为分离未孵化卵与存活的无节幼体，打开底部出水阀，将漏斗内容物排入自制迁移装置的一个容器中（见步骤 1.2 的描述）。确保含有无节幼体及残留未孵化卵的溶液液面低于导管高度；在第二个容器中，加入步骤 2.1 剩余的盐溶液，使其液面高于导管高度。
  7. 用铝箔覆盖装有无节幼体及残留未孵化卵的容器。将灯置于仅含盐溶液的第二个容器上方。丰年虾会被光线吸引，从一个容器迁移到另一个容器（收集容器），从而实现卵（缓慢沉降至底部）与活体 Artemia 的有效分离。
  8. 随后，将装置置于培养箱中，在与步骤 4.4 相同的条件下孵育 4 小时（图 2E）。从收集容器中吸取 900 µL 含有 10 至 15 只无节幼体的盐溶液，转移至 24 孔板的各孔中（图 2F）；所有样品均设四个重复。
  9. 向各孔分别加入 100 µL 的阴性对照（DMSO）、阳性对照（K2Cr2O7，重铬酸钾）、人工盐溶液以及各待测样品（图 2F）13,14。
    注：每孔中样品的浓度为 0.01 mg/mL。阳性对照在盐溶液中的终浓度为 0.1 mg/mL，以确保孔内所有无节幼体均暴露于重铬酸钾的毒性作用并死亡。人工盐溶液作为空白对照。
  10. 在 25 ± 3 °C 条件下，对培养板进行光照孵育 24 小时（图 2G）。24 小时后，在体视显微镜（12×）下记录每孔中死亡幼虫的数量（静止不动超过 5 秒的无节幼体）20（图 2H）。也可使用手持放大镜进行观察。
  11. 加入 100 µL 重铬酸钾溶液，以杀死剩余的活体幼虫，静置 6 小时。在显微镜下统计每孔中死亡幼虫的总数。根据以下公式计算死亡率。
    死亡率计算公式，用于计算 A. salina 死亡百分比的算术方程。
  12. 所有实验均设三个独立重复。计算标准差（SD），结果以三次独立实验的平均值表示，每次实验内部设四个重复（n = 12），± SD。根据 Meyer 等人的建议，将 LC50< 1,000 µg/mL 的粗提物和纯化合物视为具有毒性；同时应注意，丰年虾的死亡率与所测试样品的浓度成正比21。

过滤实验装置；自制过滤系统、烧杯、移液管；分离过程示意图。
图2：Artemia salina 致死率生物测定方法。（A）用于卤虫卵孵化的市售设备；（B）自制迁移装置；（C）装有盐溶液的孵化容器；（D）未孵化卵与无节幼体的收集；（E）孵化箱中进行迁移步骤时的自制装置。远离光源的容器应覆盖铝箔；但为更清晰展示装置设置，此处已移除；（F）在进行测定前从孔中收集Artemia。化合物应按图示放置：- 表示阴性对照（DMSO），+ 表示阳性对照（K2Cr2O7），salt 表示人工盐溶液，1 至 3 表示待测样品（本例中为化合物1-3）；（G）含有Artemia和选定样品的24孔板的孵育过程；（H）在双目显微镜下计数Artemia。请点击此处查看该图的放大版本。

倍半萜衍生物的化学结构图，五个带有乙酰基的标记化合物。
图3：所选化合物的结构。 化合物1-2从Plectranthus属植物中提取，化合物3-5通过半合成方法获得。请点击此处查看该图的放大版本。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究通过卤虫致死生物测定法评估了本课题组近期研究的某些天然产物的一般毒性。测试了来自Plectranthus属的四种提取物（Pa- P. ambigerus；Pb- P. barbatus；Pc- P. cylindraceus；和 Pe- P. ecklonii），这些植物已知具有抗氧化活性（未发表结果）。此外，还研究了从Plectranthus spp.中获得的两种天然化合物（1和2），以及三种半合成衍生物（3、4、5；图3），这些化合物均在另一项研究中已有描述3。本文报道了它们在潜在细胞毒性活性方面的初步评价结果。

所有测试提取物均表现出非常令人鼓舞的结果，死亡率极低，与空白组（盐溶液）和阴性对照组（DMSO）记录的结果相当（图4）。相反，在纯化合物1-5中，只有化合物5在100 ppm浓度下表现出较低...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

近年来，科学界对毒性筛选的替代模型给予了越来越多的关注21。旁边 A. salina 致死性生物测定，其他通常用于评估样品耐受性的方法还包括脊椎动物生物测定（如啮齿类动物）、无脊椎动物（如斑马鱼） 体外 使用酵母菌株或细胞的方法，以及 计算机模拟 方法22,23,24,25所有这些方法在考虑所花费的资金和时间、结果的可重复性以及待分析样本的类型时，均具有明确的优缺点。例如， 计算机模拟 这些方法代表了一种标准化且低成本的技术路线，所需设备极少。然而，当此类研究仅针对单一目标时，所获得的结果质量较差，因此在初步筛查中不适用，正如本研究中所展示的那样25,26

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明不存在任何经济或其他方面的利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

纪念 Amilcar Roberto 教授

本工作由葡萄牙科学技术基金会（FCT）资助，项目编号为 UIDB/04567/2020 和 UIDP/04567/2020（授予 CBIOS），以及博士奖学金 SFRH/BD/137671/2018（Vera Isca）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
24孔板赛默飞世尔科技，丹麦174899赛默飞世尔科技 Nunc Up Cell 24 孔培养皿
铝箔阿尔巴尔-可在超市购买
Artemio SetJBL GmbH and Co. KG，德国诺伊霍芬，邮编 D-6714161066000可在宠物店购买
双目显微镜比利时凯蒂 1700.0000Flexum-24AED，220-240 V，50 Hz
瓶子--0.5 L 直径：5.8 cm；高度：12 cm
卤虫卵囊JBL GmbH 和 Co. KG，德国诺伊霍芬，邮编 D-671413090700可在宠物店购买
卤虫盐JBL GmbH 和 Co. KG，德国诺伊霍芬，邮编 671413090600可在宠物店购买
二甲基亚砜（DMSO）VWR 化学品CAS：67-68-5 99% 纯度
一次性吸头钻石F171500体积范围：100 - 1000 µL
Eppendorf 微量离心管BRAND7,80,546微量离心管，聚丙烯材质，2 mL，BIO-CERT认证 PCR 质量
锥形瓶VWR 化学品4,47,109体积：100 mL
玻璃烧杯诺马克斯3.2111654N体积：1000 mL
手套卢娜手套GLSP3-
GraphPad PrismGraphPad 软件公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥-GraphPad Prism 版本 5.00 for Windows，www.graphpad.com，于 2021 年 2 月 5 日访问；商业统计分析软件
自制卤虫（A. salina）培养装置 - -自制装置：两个塑料瓶通过一根软管连接
热熔胶帕克斯赛德PHP500E3230 V，50 Hz，25 W
培养箱Heidolph Instruments，丹麦  -一台 Heidolph Unimax 1010 设备和一台 Heidolph Inkubator 1006
光RoblanSKYC3008FE14LED灯泡
微量移液器VWR 化学品613-5265体积范围：100 - 1000 µL
重铬酸钾（K2Cr2O7)VWR 化学品CAS：7778-50-9 99% 纯度
Pump ProAir a50JBL GmbH and Co. KG，德国诺伊霍芬，邮编 D-67141 -包含在 Artemio Set+1 试剂盒中
橡胶管--1.3 cm 外径和 0.9 cm 内径
玻璃棒VWR 化学品441-0147<图像 替代文本="公式 1" src="/files/ftp_upload/64472/64472eq02.jpg" 样式="margin: auto;"/> 6 mm，250 mm
温度计VWR 化学品620-08210 - 100 °C

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ntungwe, N. E., et al. Artemia species: An important tool to screen general toxicity samples. Current Pharmaceutical Design. 26 (24), 2892-2908 (2020).
  2. Cragg, G. M., Newman, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1830 (6), 3670-3695 (2013).
  3. Ntungwe, E., et al. General toxicity screening of Royleanone derivatives using an artemia salina model. Journal Biomedical and Biopharmaceutical Research. 18 (1), 114(2021).
  4. Seca, A., Plant Pinto, D. secondary metabolites as anticancer agents: Successes in clinical trials and therapeutic application. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 263(2018).
  5. Calixto, J. B. The role of natural products in modern drug discovery. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 91 (3), 1-7 (2019).
  6. Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
  7. Zhang, Y., Mu, J., Han, J., Gu, X. An improved brine shrimp larvae lethality microwell test method. Toxicology Mechanisms and Methods. 22 (1), 23-30 (2012).
  8. Domínguez-Villegas, V., et al. antioxidant and cytotoxicity activities of methanolic extract and prenylated flavanones isolated from leaves of eysehardtia platycarpa. Natural Product Communications. 8 (2), 177-180 (2013).
  9. Hamidi, M. R., Jovanova, B., Panovska, T. K. Toxicological evaluation of the plant products using Brine Shrimp (Artemia salina L.) model. Macedonian Pharmaceutical Bulletin. 60 (01), 9-18 (2014).
  10. Libralato, G., Prato, E., Migliore, L., Cicero, A. M., Manfra, L. A review of toxicity testing protocols and endpoints with Artemia spp. Ecological Indicators. 69, 35-49 (2016).
  11. Mendes Hacke, A. C., et al. Cytotoxicity of cymbopogon citratus (DC) Stapf fractions, essential oil, citral, and geraniol in human leukocytes and erythrocytes. Journal of Ethnopharmacology. 291, 115147(2022).
  12. Thangapandi, V., Pushpanathan, T. Comparison of the Artemia salina and Artemia fransiscana bioassays for toxicity of Indian medicinal plants. Journal of Coastal Life Medicine. 2 (6), 453-457 (2014).
  13. Syahmi, A. R. M., et al. Acute oral toxicity and brine shrimp lethality of Elaeis guineensis Jacq., (Oil Palm Leaf) methanol extract. Molecules. 15 (11), 8111-8121 (2010).
  14. Sasidharan, S., et al. Acute toxicity impacts of Euphorbia hirta L extract on behavior, organs body weight index and histopathology of organs of the mice and Artemia salina. Pharmacognosy Research. 4 (3), 170(2012).
  15. Libralato, G. The case of Artemia spp. in nanoecotoxicology. Marine Environmental Research. 101, 38-43 (2014).
  16. Okumu, M. O., et al. Artemia salina as an animal model for the preliminary evaluation of snake venom-induced toxicity. Toxicon: X. 12, 100082(2021).
  17. Rajabi, S., Ramazani, A., Hamidi, M., Naji, T. Artemia salina as a model organism in toxicity assessment of nanoparticles. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences. 23 (1), 20(2015).
  18. Svensson, B. -M., Mathiasson, L., Mårtensson, L., Bergström, S. Artemia salina as test organism for assessment of acute toxicity of leachate water from landfills. Environmental Monitoring and Assessment. 102 (1), 309-321 (2005).
  19. Banti, C., Hadjikakou, S. Evaluation of toxicity with brine shrimp assay. Bio-Protocol. 11 (2), 3895(2021).
  20. Pecoraro, R., et al. Artemia salina: A microcrustacean to assess engineered nanoparticles toxicity. Microscopy Research and Technique. 84 (3), 531-536 (2021).
  21. Lillicrap, A., et al. Alternative approaches to vertebrate ecotoxicity tests in the 21st century: A review of developments over the last 2 decades and current status. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (11), 2637-2646 (2016).
  22. Ribeiro, I. C., et al. Yeasts as a model for assessing the toxicity of the fungicides Penconazol, Cymoxanil and Dichlofulanid. Chemosphere. (10), 1637-1642 (2000).
  23. Armour, C. D., Lum, P. Y. From drug to protein: using yeast genetics for high-throughput target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 9 (1), 20-24 (2005).
  24. Modarresi Chahardehi, A., Arsad, H., Lim, V. Zebrafish as a successful animal model for screening toxicity of medicinal plants. Plants. 9 (10), 1345(2020).
  25. Fischer, I., Milton, C., Wallace, H. Toxicity testing is evolving. Toxicology Research. 9 (2), 67-80 (2020).
  26. de Araújo, G. L., et al. Alternative methods in toxicity testing: the current approach. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (1), 55-62 (2014).
  27. Toussaint, M., et al. A high-throughput method to measure the sensitivity of yeast cells to genotoxic agents in liquid cultures. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 606 (1), 92-105 (2006).
  28. Horzmann, K. A., Freeman, J. L. Making waves: New developments in toxicology with the zebrafish. Toxicological Sciences. 163 (1), 5-12 (2018).
  29. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196(2012).
  30. Cunliffe, V. T. Zebrafish: A Practical Approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).
  31. Sitarek, P., et al. Insight the biological activities of selected Abietane Diterpenes isolated from Plectranthus spp. Biomolecules. 10 (2), 194(2020).
  32. Matias, D., et al. Cytotoxic activity of Royleanone Diterpenes from Plectranthus madagascariensis Benth. ACS Omega. 4 (5), 8094-8103 (2019).
  33. Garcia, C., et al. Royleanone derivatives from Plectranthus spp. as a novel class of P-glycoprotein inhibitors. Frontiers in Pharmacology. 11, (2020).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

Artemia salina

相关文章