全层软骨缺损大鼠模型的开发与评价

Summary

该协议通过在大鼠的股骨滑车沟中钻孔并测量随后的疼痛行为和组织病理学变化来建立全层软骨缺陷（FTCD）模型。

Abstract

创伤引起的膝关节软骨缺损是临床上常见的运动关节损伤，这些缺损会导致关节疼痛、运动障碍，最终导致膝关节骨关节炎（kOA）。然而，对软骨缺陷甚至kOA的有效治疗很少。动物模型对于开发治疗药物很重要，但现有的软骨缺陷模型并不令人满意。本工作通过在大鼠股骨滑车槽钻孔建立了全层软骨缺损（FTCD）模型，并将后续的疼痛行为和组织病理学变化作为读数实验。术后机械戒断阈值降低，损伤部位软骨细胞丢失，基质金属蛋白酶MMP13表达升高，II.型胶原表达降低，与人软骨缺损中观察到的病理变化一致。这种方法操作简单易行，可以在损伤后立即进行粗略观察。此外，该模型可以成功模拟临床软骨缺损，从而为研究软骨缺损的病理过程和开发相应的治疗药物提供平台。

Introduction

关节软骨是由软骨细胞和细胞外基质组成的高度分化和致密的组织¹。关节软骨的表层是透明软骨的一种形式，具有表面光滑，摩擦力低，强度和弹性好，机械^{应力耐受性}优异2。细胞外基质由胶原蛋白蛋白聚糖和水组成，II型胶原蛋白是胶原蛋白的主要结构成分，约占胶原蛋白总量的90^%3。由于软骨组织中不存在血管或神经，因此在受伤后缺乏自我修复的能力⁴。因此，创伤引起的软骨缺损一直是临床上顽固的关节疾病;此外，这种关节疾病往往会袭击年轻人，全球发病率正在上升^5,6。膝关节是软骨缺损最常见的部位，这里的缺损伴有关节疼痛、关节功能障碍和关节软骨变性，最终导致膝关节骨关节炎（kOA）⁷。膝关节软骨缺损给患者带来经济和生理负担，严重影响患者的生活质量⁸.这种疾病构成了重大而紧迫的临床挑战，没有迫在眉睫的解决方案。目前，手术是治疗软骨缺损的主要手段，但其长期结果仍不令人满意^9。

临床软骨缺陷最终导致kOA，因此kOA动物模型常用于软骨缺陷的病理研究和药物开发。动物模型的建立对于理解软骨缺损修复的病理生理过程具有重要意义，可用于观察软骨再生和纤维软骨与透明软骨之间的改变¹⁰。然而，常用的kOA动物模型，如前交叉韧带横断（ACLT）、内侧半月板不稳定（DMM）、卵巢切除术（OVX）和Hulth的手术模型，通常需要长期建模，并且只允许病理和疼痛评估，这限制了药物开发的效率¹¹。除了手术模型外，化学模型，如单碘乙酸酯（MIA）和木瓜蛋白酶注射液，也会导致软骨缺陷，但缺陷的程度无法很好地控制，条件与临床现实相去甚远¹¹。碰撞是模拟大型动物软骨缺陷的另一种方法，但这种方法取决于特定仪器的使用，很少应用¹²。

综上所述，现有的kOA模型对于研究软骨缺损的发病机制或开发新药并不理想，需要针对软骨缺损建立特异性和标准化的模型。本研究通过在大鼠股骨滑车槽中钻孔建立了全层软骨缺损（FTCD）模型。进行大体观察、疼痛行为测试和组织病理学分析以进行模型评估。与其他kOA动物模型不同，该模型对大鼠的一般状况几乎没有影响。这种建模方法是可访问的，可以很好地管理，并支持了解从软骨缺陷到kOA的进展以及有效疗法的开发。该模型还可用于测试通过治愈骨关节炎前关节缺陷来预防kOA的疗法。

Protocol

动物实验经浙江中医药大学医学标准伦理委员会批准，符合中国关于实验动物使用和护理的立法。在本研究中，使用体重150-180g的6周龄雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。

1. 大鼠全层软骨缺损模型的建立

1. 适应新环境1周后，将大鼠随机平均分为两组（n = 8只大鼠/组）。假手术组的大鼠将进行假手术，而模型组的大鼠将进行实验性手术，涉及在股骨滑车槽中钻孔。
   注意:每个笼子必须覆盖无菌玉米芯衬垫（见 材料表）以保护老鼠的脚趾。
2. 通过腹膜内注射戊巴比妥钠（40mg / kg）麻醉大鼠。然后，轻轻按压大鼠的脚趾以确认充分麻醉。在大鼠的眼睛上使用兽医软膏以防止麻醉时干燥。
   注意:动物手术需要在专用手术室使用高压灭菌手术器械进行。手术人员在手术期间必须穿着干净的实验室外套、口罩、头套和无菌手套。将无菌垫放在手术区域，并在使用前对所有设备进行消毒。在整个过程中提供热支持。
3. 将大鼠仰卧放在手术台上，剃除左右后肢，并用手术肥皂清洁膝关节区域，然后在无菌条件下交替使用抗菌聚维酮碘溶液和酒精三次。将无菌窗帘放在大鼠身上，仅露出消毒的膝关节。
4. 用手术刀刀片（11号）在大鼠膝关节中间从上到下切开1厘米的切口，浅表夹层后沿髌骨内侧边缘切开关节囊和股股四头肌肌腱。
   注意:股股四头肌肌腱在膝关节屈曲期间附着在髌骨和股骨髁上¹³.关节囊中的凹槽是股骨滑车沟，股骨远端髁形成内侧和外侧髁。
5. 将髌骨向外转动，将胫骨和腓骨弯曲 90° 角，以充分暴露股骨髁的滑车。使用直径为 1.6 mm 的圆形钻头（见材料 表）垂直于软骨表面以 4,000 rpm 的速度持续 10 秒，在股骨滑车槽中形成一个深度为 0.1 mm 的全层软骨缺损。
   注意:间歇性使用生理盐水，以尽量减少钻孔过程中对周围骨组织的热创伤。
6. 用浸泡在0.9%盐水溶液中的棉球擦拭手术部位，置换髌骨，保持膝盖处于伸展位置，并用不可吸收的4-0缝合线逐层缝合切口（见 材料表）。
   1. 将动物放在胸骨卧位的加热垫上，监视它们直到它们醒来，然后将它们放回笼子里。手术后每8小时皮下注射丁丙诺啡（0.05mg / kg），每次三次以缓解疼痛。
7. 测试所有大鼠在手术后3天，10天和17天的疼痛相关行为，如第2节所述。

2. 机械戒断阈值

注意:大鼠双侧后足底的MWT通过经典的冯弗雷丝疼痛测量方法¹⁴测量。

1. 将大鼠放在金属丝网平台上的单个塑料室（17cm x 11 cm x 13 cm）中（参见 材料表），并将金属丝网底座放置在桌子上方50厘米处。适应30分钟后测量MWT。
2. 将冯弗雷细丝（见 材料表）垂直按压在每只大鼠后爪的足底表面上，弯曲刷子约2秒，避开后爪中心最厚的部分。
3. 从最低的4g逐渐增加刺激重量，直到发生积极的反应（爪子撤回或爪子舔）。
   注意:每次刺激之间的间隔应超过1分钟。MWT定义为五次刺激中的三次阳性反应;以克为单位记录刺激权重。
4. 根据记录的最小刺激权重（以克为单位）计算假和模型组的平均值。

3. 组织病理学和免疫组织化学分析

1. 在手术后17天和56天，用40mg / kg戊巴比妥钠（ip）麻醉大鼠，并通过从心脏抽血来处死所有大鼠。通过切割股骨中部和胫骨中部的骨头来隔离膝盖，并解剖周围的肌肉组织。切除膝关节进行组织学分析。
2. 在室温下将膝关节固定在20mL的10%多聚甲醛溶液中48小时，然后在4°C的轨道振荡器中用20mL的10%EDTA溶液脱钙8周。 每天更换EDTA解决方案。
3. 修剪膝关节以适合嵌入盒的大小。将脱水的膝关节嵌入 100% 石蜡¹⁵ 中。
4. 将石蜡嵌入的膝关节放在切片机的支架上，调整角度，然后用刀片修剪石蜡样品，直到表面平坦。
5. 将石蜡切片的厚度设置为3μm，并在40°C的水浴中将切片压平。
6. 将切片粘在载玻片上，将它们放入45°C烘烤机（见 材料表）中直至干燥，并在室温下储存。
7. 脱蜡和复水:将切片在60°C的烤箱中脱蜡4h，然后将切片依次放入100%二甲苯（三次），100%乙醇（两次），95%乙醇，80%乙醇和75%乙醇中，每次5分钟。
8. 苏木精和伊红（H&E）染色
   1. 脱蜡，再水化，用双蒸水清洗切片2分钟。
   2. 用0.5%苏木精（见 材料表）对切片染色3分钟，然后用双蒸水洗涤切片，直到切片表面没有苏木精残留物。
   3. 将切片浸入1%盐酸醇中3秒，然后用双蒸水清洗切片2分钟。
   4. 将切片浸泡在1%氨水中10秒，然后用双蒸水清洗切片2分钟。
   5. 用伊红（见 材料表）染色切片1分钟，然后用双蒸水洗涤切片，直到切片表面没有曙红残留物。
   6. 将切片分别浸入95%乙醇，100%乙醇和100%二甲苯（三次）中，每次1分钟。
   7. 在每个切片中加入一滴中性树脂（见 材料表），并用盖玻片密封。
9. 赛峰素 O/快速弗里恩 （SO） 染色
   1. 脱蜡，再水化，用双蒸水清洗切片2分钟。
   2. 用0.05%固绿（见 材料表）对切片染色3分钟，然后用双蒸水清洗切片，直到切片表面没有固绿残留物。
   3. 将切片浸入1%乙酸溶液中10秒，然后用双蒸水洗涤切片2分钟。
   4. 用2.5%SO（参见 材料表）对切片染色2分钟，然后用双蒸水清洗切片，直到切片表面没有SO残留物。
   5. 将切片分别浸入95%乙醇，100%乙醇和100%二甲苯（三次）中，每次1分钟。
   6. 在每个切片中加入一滴中性树脂，并用盖玻片密封。
10. 甲苯胺蓝 （TB） 染色
    1. 脱蜡，再水化，用双蒸水清洗切片2分钟。
    2. 将切片浸入1%TB溶液（参见 材料表）中2分钟，并用双蒸水洗涤切片，直到切片表面没有甲苯胺蓝残留物。
    3. 将切片分别浸入95%乙醇，100%乙醇和100%二甲苯（三次）中，每次1分钟。
    4. 在每个切片中加入一滴中性树脂，并用盖玻片密封。
11. 马森染色
    1. 脱蜡，再水化，用双蒸水清洗切片2分钟。
    2. 将Bouin溶液（参见 材料表）滴加到切片中，在37°C下染色2小时，然后用双蒸水洗涤，直到切片表面的黄色消失。
    3. 用天青石蓝（见 材料表）染色切片3分钟，然后用双蒸水清洗切片，直到切片表面没有天青蓝残留物。
    4. 用苏木精染色切片3分钟，然后用双蒸水清洗切片，直到切片表面没有苏木精残留物。
    5. 将切片浸入酸性乙醇中5秒，然后用双蒸水洗涤切片2分钟。
    6. 用丽春红染色切片（见 材料表）10分钟，然后用双蒸水清洗切片，直到切片表面没有丽春红残留物。
    7. 将切片浸入磷钼酸（见 材料表）中10分钟，然后将其浸入TB溶液中5分钟，并用双蒸水洗涤切片，直到切片表面没有结核病残留物。
    8. 将切片浸入弱酸溶液中2分钟，然后用双蒸水洗涤切片2分钟。
    9. 将切片依次浸入95%乙醇，100%乙醇和100%二甲苯（三次）中，每次1分钟。
    10. 在每个切片中加入一滴中性树脂，并用盖玻片密封。
12. 在双盲设置下观察显微镜下的所有切片，以确定关节软骨退化的程度，根据曼金评分系统¹⁶。
13. 免疫组化
    1. 定期对切片进行脱蜡和再水化，并用PBS清洗切片2分钟。
    2. 将切片浸入柠檬酸钠溶液中，并将切片置于60°C的烤箱中4小时以修复抗原。用PBS清洗切片三次，每次3分钟。
    3. 将切片浸入0.3%Triton X-100溶液中10分钟，并用PBS清洗切片两次，每次3分钟。
    4. 通过在室温下在甲醇中加入3%H₂O₂ 溶液30分钟来阻断内源性过氧化物酶活性。用PBS清洗切片两次，每次3分钟。
    5. 在室温下将切片与PBS中的5%山羊血清孵育30分钟，以阻断任何非特异性结合。用PBS清洗切片两次，每次3分钟。
    6. 向每个切片中加入 100 μL PBS 稀释的一抗（抗 col1,1:50;抗 col3,1:50;抗 col2,1:100;和抗 MMP13,1:100;参见 材料表），并在 4 °C 下孵育过夜。 用PBS清洗切片两次，每次3分钟。
    7. 将每个切片与 100 μL PBS 稀释的 （1:100） 二抗（山羊抗兔或山羊抗小鼠，参见 材料表）在室温下孵育 20 分钟。用PBS清洗切片两次，每次3分钟。
    8. 向每片中加入 100 μL 3,3'-二氨基联苯胺（DAB，参见 材料表）工作溶液。
    9. 在显微镜下观察并记录棕色的出现时间;显色反应使表位位点变成棕色¹⁷。用相同的记录反应时间处理其余样品。
    10. 切片变成棕色后，用双蒸水清洗切片两次，每次 3 分钟。
    11. 用苏木精重新染色切片1分钟，然后用双蒸水清洗切片2分钟。
    12. 将切片浸入盐酸中3秒，然后用双蒸水清洗切片2分钟。
    13. 将切片浸泡在1%氨水中10秒，然后用双蒸水清洗切片2分钟。
    14. 将切片分别浸入95%乙醇，100%乙醇和100%二甲苯（三次）中，每次1分钟。
    15. 在每个切片中加入一滴中性树脂，并用盖玻片密封。

Results

本工作通过在股骨滑车槽上钻孔并检测后续疼痛行为和组织病理学变化，建立了FTCD大鼠模型。如图1所示，建模后3天，与假手术组相比，模型组大鼠MWT明显降低，提示FTCD引起的痛觉过敏。建模后17 d，模型组大鼠机械戒断阈值保持在较低水平，表明疼痛致敏性至少可持续17 d。组织病理学染色结果显示，假手术组关节软骨结构清晰，软骨表面完整，软骨细胞分布均匀，II.型胶原蛋白表达高。相反，在模型组中，软骨表面形成凹陷，软骨细胞丢失，基质金属蛋白酶MMP13表达增加，II型胶原蛋白表达降低（图2和图3）。

Discussion

本研究描述了一种通过在大鼠股骨滑车槽中钻孔来模拟临床软骨缺陷的动物模型（补充图1）。软骨损伤后，外周伤害感受器的兴奋性或反应性增强，这可能导致疼痛阈值降低和对刺激的反应性增强¹⁸。在临床前研究中，不同种类动物软骨缺陷的建模总是引起疼痛¹⁹。临床研究还表明，软骨损伤患者的疼痛视觉模拟量表（VAS）评分明显低于健康个体²⁰。我们采用FTCD模型测试FTCD处理的效果，结果表明MWT的降低不是短暂的，MWT在短时间内没有快速恢复。经过一段时间的治疗后，模型组的MWT仍然显着，而治疗组缓解（数据未显示）。临床疗效一般以1个月的疗程来评估，因此即使几个月后恢复，也不影响该模型的实验应用。此外，采用病理染色和免疫组化法观察软骨表面缺损，证明FTCD的建立。

该方法对FTCD进行建模具有以下优点:（1）操作简单易行;（2）建模时间短;（3）成功率高;（4）通过粗略观察 存在

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3， 3 '-二氨基联苯胺	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co.， Ltd. 杭州正博生物科技有限公司	ZLI-9019	IHC 染色
染料 抗胶原 III 抗体	Novus	NB600-594	IHC
抗胶原 II 抗体	Abcam （UK）	34712	IHC
抗胶原 I 抗体	Novus	NB600-408	IHC 一抗
Bouin 溶液	上海元业科技有限公司	R20381	用于 Masson 染色
天青石蓝	的染料 上海远业科技有限公司	R20381	用于 Masson 染色
玉米芯填充物的染料	小禾科技有限公司		动物床上用品
曙红	Sigma-Aldrich	861006	用于 HE 染色
染料 固绿 FCF	Sigma-Aldrich	F7252	用于 SO 染色
染料 山羊抗小鼠抗体	ZSGQ-BIO （中国北京）	PV-9002	IHC
山羊抗兔抗体	ZSGQ-BIO （中国北京）	PV-9001	IHC
苏木精	Sigma-Aldrich	H3163	HE染色染料
Masson	Shanghai Yuanye Technology Co.， Ltd.	R20381	用于 Masson 染色的染料
Microdrill	Rwd Life Science Co.， Ltd	78001	手术设备
MMP13	Cell Signaling Technology， Inc. （Danvers， MA， USA）	69926	IHC 一抗
模块化组织包埋中心	Thermo Fisher Scientific （USA）	350	生产石蜡块
中性树脂	杭州正波Biotechnology Co.， Ltd. 生物科技股份有限公司	ZLI-9555	IHC
不可吸收缝合	杭州华威医疗用品有限公司	4-0	手术设备
戊巴比妥钠	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co.， Ltd. 杭州正博生物科技有限公司	WBBTN5G	麻醉动物
磷酸钼酸	Shanghai Yuanye Technology Co.， Ltd.[上海元业科技有限公司]	R20381	用于 Masson 染色
的染料 丽春	上海远业科技有限公司	R20381	用于马森染色的染料
旋转和滑动切片机	Thermo Fisher Scientific （USA）	HM325	精密石蜡切片
Safranin-O	Sigma-Aldrich	S2255	用于 SO 染色的染料
手术刀刀片	上海联辉医疗用品有限公司	11	手术设备
柠檬酸钠溶液（20x）	Hangzhou Haoke Biotechnology Co.， Ltd.	HK1222	IHC
Sprague Dawley （SD） 大鼠	上海斯莱克实验动物有限公司	SD	实验动物
组织-Tek VIP 5 Jr	Sakura （日本）		真空浸润处理器
甲苯胺蓝	Sigma-Aldrich	89640	TB染色染料
Von Frey 细丝	UGO Basile （意大利）	37450-275	MWT 分析设备
金属丝网平台	Shanghai Yuyan Instruments Co.，Ltd. 上海昱燕仪器有限公司		MWT 检测设备