本方案通过在大鼠股骨滑车沟处钻孔，建立全层软骨缺损（FTCD）模型，并检测随后的疼痛行为及组织病理学变化。
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本文内容
摘要
摘要
由创伤引起的膝关节软骨缺损是临床上常见的运动性关节损伤，此类缺损可导致关节疼痛、活动功能障碍，并最终发展为膝骨关节炎（kOA）。然而，目前对于软骨缺损甚至kOA均缺乏有效的治疗方法。动物模型在治疗药物的研发中具有重要意义，但现有的软骨缺损模型仍不理想。本研究通过在大鼠股骨滑车沟处钻孔，建立全层软骨缺损（FTCD）模型，并以术后疼痛行为学及组织病理学改变作为观察指标。术后机械缩足阈值降低，损伤部位软骨细胞丢失，基质金属蛋白酶MMP13表达上调，II型胶原表达下调，这些变化与人类软骨缺损的病理特征一致。该方法操作简便，可在损伤后立即进行大体观察。此外，该模型能够有效模拟临床软骨缺损，为研究软骨缺损的病理过程及开发相应治疗药物提供了可靠的实验平台。
引言
关节软骨是一种高度分化且致密的组织，由软骨细胞和细胞外基质组成1。关节软骨的表层为透明软骨，具有光滑的表面、低摩擦系数、良好的强度和弹性，以及优异的机械应力耐受能力2。细胞外基质主要由胶原蛋白、蛋白聚糖和水构成，其中II型胶原是胶原的主要结构成分，约占总胶原含量的90%3。由于软骨组织内无血管和神经分布，受伤后缺乏自我修复能力4。因此，由创伤引起的软骨缺损一直是临床上难以解决的关节疾病；此外，该病好发于青年人群，全球发病率呈上升趋势5,6。膝关节是最常见的软骨缺损部位，缺损常伴随关节疼痛、关节功能障碍和关节软骨退变，最终导致膝骨关节炎（kOA）7。膝关节软骨缺损给患者带来经济和生理上的双重负担，严重影响患者的生活质量8。该疾病构成了重大而紧迫的临床挑战，目前尚无即刻可行的解决方案。当前，手术仍是治疗软骨缺损的主要手段，但其长期疗效仍不理想9。
临床软骨缺损最终会导致膝骨关节炎（kOA），因此，kOA动物模型常被用于软骨缺损的病理学....
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方案
动物实验经浙江中医药大学医学标准与伦理委员会批准，符合中国关于实验动物使用和护理的法律法规。本研究采用6周龄雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重为150-180 g。动物购自商业来源（见材料表）。
1. 大鼠全层软骨缺损模型的建立
- 在新环境中适应1周后，将大鼠随机均分为两组（每组8只大鼠）。假手术组大鼠接受假手术，模型组大鼠则接受在股骨滑车沟钻孔的实验性手术。
注意：每个笼子必须铺上无菌玉米芯垫料（见材料表），以保护大鼠的脚趾。 - 通过腹腔注射（i.p.）戊巴比妥钠（40 mg/kg）对大鼠进行麻醉。随后轻压大鼠脚趾以确认麻醉效果充分。在麻醉期间，使用兽用眼膏涂抹大鼠眼睛，防止角膜干燥。
注意：动物手术必须在专用手术室中进行，并使用经高压灭菌的手术器械。操作人员在手术过程中必须穿戴洁净实验服、口罩、头套和无菌手套。 在手术区域覆盖无菌垫巾，使用前对所有器械进行灭菌处理。在整个手术过程中提供保温支持。 - 将大鼠仰卧位固定于手术台上，剃除左右后肢毛发，在无菌条件下先用外科皂液清洗膝关节区域，再交替使用聚维酮碘溶液和酒精消毒三次。用无菌手术巾覆盖大鼠身体，仅暴露已消毒的膝关节部位。
- 使用11号手术刀片从上至下在大鼠膝关节中央做1 cm长切口，在浅层解剖....
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结果
本研究通过在股骨滑车沟处钻孔，建立FTCD大鼠模型，并检测其后续的疼痛行为及组织病理学变化。如图1所示，造模后第3天，与假手术组相比，模型组大鼠的机械缩足阈值（MWT）显著降低，提示FTCD引起了痛觉过敏。造模后第17天，模型组大鼠的机械缩足阈值仍维持在较低水平，表明疼痛敏化可至少持续17天。组织病理学染色结果显示，假手术组关节软骨结构清晰，软骨表面完整，软骨细胞分布均匀，II型胶原高表达；而模型组软骨表面出现凹陷，软骨细胞丢失，基质金属蛋白酶MMP13表达增加，II型胶原表达减少（图2和 图3）。
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讨论
本研究描述了一种通过在大鼠股骨滑车沟处钻孔来模拟临床软骨缺损的动物模型（补充图 1）。软骨损伤后，外周伤害性感受器的兴奋性或反应性增强，可能导致痛阈降低以及对刺激的反应性增强18。在临床前研究中，不同动物物种的软骨缺损模型始终会引发疼痛19。临床研究也表明，软骨损伤患者的疼痛视觉模拟评分（VAS）显著低于健康个体20。我们采用FTCD模型来检测FTCD治疗的效果，结果显示机械缩足阈值（MWT）的下降并非短暂现象，且在短时间内未迅速恢复。经过一段时间的治疗后，模型组的MWT仍显著降低，而治疗组则有所缓解（数据未显示）。临床疗效通常以1个月疗程为评估依据，因此即使数月后出现恢复，也不影响该模型的实验应用。此外，通过病理染色和免疫组织化学方法观察软骨表面缺损，证实了FTCD模型的成功建立。
该FTCD模型构建方法具有以下优势：（1）操作简便；（2）建模周期短；（3）成功.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由浙江省自然科学基金（项目编号 LQ20H270009）、国家自然科学基金（项目编号 82074464 和 82104890）、浙江省中医药科学研究基金（项目编号 2020ZA039、2020ZA096 和 2022ZB137）以及浙江省卫生健康委员会医学卫生科技计划项目（项目编号 2016KYA196）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3,3'-二氨基联苯胺 | 杭州正博生物科技有限公司 | ZLI-9019 | 免疫组化染色用染料 |
| 抗胶原蛋白III抗体 | Novus | NB600-594 | 免疫组化一抗 |
| 抗胶原蛋白II抗体 | Abcam (英国) | 34712 | 免疫组化一抗 |
| 抗胶原蛋白I抗体 | Novus | NB600-408 | 免疫组化一抗 |
| 波因溶液 | 上海源叶科技有限公司 | R20381 | 马松染色用染料 |
| 天青石蓝 | 上海源叶科技有限公司 | R20381 | 马松染色用染料 |
| 玉米芯垫料 | 小河科技有限公司 | 实验动物垫料 | |
| 伊红 | Sigma-Aldrich | 861006 | 苏木精-伊红染色用染料 |
| 快绿FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | 固绿染色用染料 |
| 羊抗小鼠抗体 | 中杉金桥（北京，中国） | PV-9002 | 免疫组化二抗 |
| 羊抗兔抗体 | 中杉金桥（北京，中国） | PV-9001 | 免疫组化二抗 |
| 苏木精 | Sigma-Aldrich | H3163 | 苏木精-伊红染色用染料 |
| 马松染色试剂 | 上海源叶科技有限公司 | R20381 | 马松染色用染料 |
| 微型钻机 | Rwd生命科学有限公司 | 78001 | 手术设备 |
| MMP13 | Cell Signaling Technology, Inc. (美国马萨诸塞州丹弗斯) | 69926 | 免疫组化一抗 |
| 模块化组织包埋中心 | Thermo Fisher Scientific (美国) | EC 350 | 制备石蜡包埋块 |
| 中性树脂 | 杭州正博生物科技有限公司 | ZLI-9555 | 免疫组化封片剂 |
| 不可吸收缝合线 | 杭州华为医疗器械有限公司 | 4-0 | 手术设备 |
| 戊巴比妥钠 | 杭州正博生物科技有限公司 | WBBTN5G | 动物麻醉剂 |
| 磷钼酸 | 上海源叶科技有限公司 | R20381 | 马松染色用染料 |
| 丽春红品红 | 上海源叶科技有限公司 | R20381 | 马松染色用染料 |
| 旋转式与滑动式切片机 | Thermo Fisher Scientific (美国) | HM325 | 精确切制石蜡切片 |
| 番红O | Sigma-Aldrich | S2255 | 固绿染色用染料 |
| 手术刀片 | 上海联辉医疗器械有限公司 | 11 | 手术设备 |
| 柠檬酸钠溶液 (20x) | 杭州浩克生物科技有限公司 | HK1222 | 免疫组化抗原修复液 |
| 斯普拉-道利（SD）大鼠 | 上海斯莱克实验动物有限公司 | SD | 实验动物 |
| Tissue-Tek VIP 5 Jr | Sakura (日本) | 真空浸润处理仪 | |
| 甲苯胺蓝 | Sigma-Aldrich | 89640 | 甲苯胺蓝染色用染料 |
| 冯·弗雷纤维丝 | UGO Basile (意大利) | 37450-275 | MWT实验设备 |
| 金属丝网平台 | 上海玉研仪器有限公司 | MWT实验设备 |
参考文献
- Zhang, Z. Chondrons and the pericellular matrix of chondrocytes. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 21 (3), 267-277 (2015).
- Correa, D., Lietman, S. A. Articular cartilage repair: Current needs, methods and research directions.
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