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方法文章

全层软骨缺损大鼠模型的建立与评价

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DOI：

10.3791/64475

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2023年5月19日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The First Affiliated Hospital, Zhejiang Chinese Medical University, 2Fuyang Orthopaedics and Traumatology Affiliated Hospital, Zhejiang Chinese Medical University, 3College of Pharmaceutical Science, Zhejiang Chinese Medical University, 4Affiliated Zhejiang Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 5Xianju County Hospital of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案通过在大鼠股骨滑车沟处钻孔，建立全层软骨缺损（FTCD）模型，并检测随后的疼痛行为及组织病理学变化。

摘要

由创伤引起的膝关节软骨缺损是临床上常见的运动性关节损伤，此类缺损可导致关节疼痛、活动功能障碍，并最终发展为膝骨关节炎（kOA）。然而，目前对于软骨缺损甚至kOA均缺乏有效的治疗方法。动物模型在治疗药物的研发中具有重要意义，但现有的软骨缺损模型仍不理想。本研究通过在大鼠股骨滑车沟处钻孔，建立全层软骨缺损（FTCD）模型，并以术后疼痛行为学及组织病理学改变作为观察指标。术后机械缩足阈值降低，损伤部位软骨细胞丢失，基质金属蛋白酶MMP13表达上调，II型胶原表达下调，这些变化与人类软骨缺损的病理特征一致。该方法操作简便，可在损伤后立即进行大体观察。此外，该模型能够有效模拟临床软骨缺损，为研究软骨缺损的病理过程及开发相应治疗药物提供了可靠的实验平台。

引言

关节软骨是一种高度分化且致密的组织，由软骨细胞和细胞外基质组成1。关节软骨的表层为透明软骨，具有光滑的表面、低摩擦系数、良好的强度和弹性，以及优异的机械应力耐受能力2。细胞外基质主要由胶原蛋白、蛋白聚糖和水构成，其中II型胶原是胶原的主要结构成分，约占总胶原含量的90%3。由于软骨组织内无血管和神经分布，受伤后缺乏自我修复能力4。因此，由创伤引起的软骨缺损一直是临床上难以解决的关节疾病；此外，该病好发于青年人群，全球发病率呈上升趋势5,6。膝关节是最常见的软骨缺损部位，缺损常伴随关节疼痛、关节功能障碍和关节软骨退变，最终导致膝骨关节炎（kOA）7。膝关节软骨缺损给患者带来经济和生理上的双重负担，严重影响患者的生活质量8。该疾病构成了重大而紧迫的临床挑战，目前尚无即刻可行的解决方案。当前，手术仍是治疗软骨缺损的主要手段，但其长期疗效仍不理想9。

临床软骨缺损最终会导致膝骨关节炎（kOA），因此，kOA动物模型常被用于软骨缺损的病理学研究和药物开发。建立动物模型对于理解软骨缺损修复的病理生理过程至关重要，可用于观察软骨再生以及纤维软骨与透明软骨之间的转变10。然而，常用的kOA动物模型，如前交叉韧带横断（ACLT）手术模型、内侧半月板失稳（DMM）、卵巢切除（OVX）和Hulth模型，通常需要较长时间建模，且仅适用于病理学和疼痛评估，这限制了药物开发的效率11。除手术模型外，化学诱导模型如单碘乙酸钠（MIA）和木瓜蛋白酶注射也可导致软骨缺损，但缺损程度难以精确控制，且条件与临床实际情况相差较远11。撞击法是另一种在大型动物中建立软骨缺损模型的方法，但该方法依赖特定仪器，应用较少12。

总之，现有的膝骨关节炎（kOA）模型在研究软骨缺损的发病机制或开发新药方面并不理想，因此需要建立一种针对软骨缺损的特异性且标准化的模型。本研究通过在大鼠股骨滑车沟处钻孔，建立了全层软骨缺损（FTCD）模型，并通过大体观察、疼痛行为学检测及组织病理学分析对模型进行了评估。与其他kOA动物模型不同，该模型对大鼠的一般状况影响较小。该造模方法易于操作、便于控制，有助于理解从软骨缺损发展为kOA的进程，并推动有效治疗策略的开发。此外，该模型还可用于测试通过修复前骨关节炎关节的软骨缺损以预防kOA的治疗方法。

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方案

动物实验经浙江中医药大学医学标准与伦理委员会批准，符合中国关于实验动物使用和护理的法律法规。本研究采用6周龄雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重为150-180 g。动物购自商业来源（见材料表）。

1. 大鼠全层软骨缺损模型的建立

  1. 在新环境中适应1周后，将大鼠随机均分为两组（每组8只大鼠）。假手术组大鼠接受假手术，模型组大鼠则接受在股骨滑车沟钻孔的实验性手术。
    注意：每个笼子必须铺上无菌玉米芯垫料（见材料表），以保护大鼠的脚趾。
  2. 通过腹腔注射（i.p.）戊巴比妥钠（40 mg/kg）对大鼠进行麻醉。随后轻压大鼠脚趾以确认麻醉效果充分。在麻醉期间，使用兽用眼膏涂抹大鼠眼睛，防止角膜干燥。
    注意：动物手术必须在专用手术室中进行，并使用经高压灭菌的手术器械。操作人员在手术过程中必须穿戴洁净实验服、口罩、头套和无菌手套。 在手术区域覆盖无菌垫巾，使用前对所有器械进行灭菌处理。在整个手术过程中提供保温支持。
  3. 将大鼠仰卧位固定于手术台上，剃除左右后肢毛发，在无菌条件下先用外科皂液清洗膝关节区域，再交替使用聚维酮碘溶液和酒精消毒三次。用无菌手术巾覆盖大鼠身体，仅暴露已消毒的膝关节部位。
  4. 使用11号手术刀片从上至下在大鼠膝关节中央做1 cm长切口，在浅层解剖后沿髌骨内侧缘切开关节囊及股四头肌腱。
    注意：当膝关节屈曲时，股四头肌腱附着于髌骨及股骨髁部13。关节囊内可见的沟槽即为股骨滑车沟，远端股骨髁形成内侧和外侧髁。
  5. 将髌骨向外侧翻转，将胫骨和腓骨屈曲至90°角，以充分暴露股骨髁的滑车部位。使用直径1.6 mm的圆形钻头（见材料表），垂直于软骨表面，以4,000 rpm转速钻孔10秒，在股骨滑车沟内制造一个深度为0.1 mm的全层软骨缺损。
    注意：钻孔过程中应间歇使用生理盐水冲洗，以尽量减少对周围骨组织的热损伤。
  6. 用浸有0.9%生理盐水的棉球擦拭手术部位，复位髌骨，保持膝关节处于伸展位置，并使用不可吸收的4-0缝线逐层缝合切口（见材料表）。
    1. 将动物置于加热垫上，保持胸卧位，密切监测直至苏醒，然后将其放回笼中。术后每8小时皮下注射一次布托啡诺（0.05 mg/kg），共注射三次，以缓解疼痛。
  7. 按照第2节所述方法，在术后第3天、第10天和第17天检测所有大鼠的疼痛相关行为。

2. 机械缩足阈值（MWT）

注意：采用经典的 von Frey 纤维痛觉测量法14测定大鼠双侧足底后部的机械缩足阈值（MWT）。

  1. 将大鼠置于一个塑料单腔室（17 cm × 11 cm × 13 cm）内，腔室底部为金属网平台（参见材料表），并将金属网底座置于距实验台面50 cm高处。大鼠适应30 min后测定机械缩足阈值（MWT）。
  2. 将von Frey纤维丝（参见材料表）垂直作用于每只大鼠后足底面，使纤维丝弯曲约2 s，注意避开后足掌中心最厚区域。
  3. 从最低刺激强度4 g开始，逐步增加刺激重量，直至出现阳性反应（缩足或舔足）。
    注意：每次刺激之间的间隔应超过1 min。MWT定义为在5次刺激中出现3次阳性反应时的刺激重量；记录刺激重量，单位为克（g）。
  4. 根据记录的最小刺激重量（单位：克），计算假手术组和模型组的平均值。

3. 组织病理学与免疫组织化学分析

  1. 术后第17天和第56天，使用40 mg/kg戊巴比妥钠（腹腔注射）麻醉大鼠，并通过心脏采血法处死所有大鼠。在股骨中段和胫骨中段处切断骨骼以分离膝关节，解剖去除周围肌肉组织，取出膝关节用于组织学分析。
  2. 将膝关节置于20 mL 10%多聚甲醛溶液中，室温固定48小时，随后在4 °C条件下，使用20 mL 10% EDTA溶液在旋转摇床上脱钙8周。每天更换一次EDTA溶液。
  3. 修整膝关节至包埋盒大小，将脱水后的膝关节包埋于100%石蜡15中。
  4. 将石蜡包埋的膝关节固定于切片机持样器上，调整角度，用刀片修切石蜡样品直至表面平整。
  5. 设定石蜡切片厚度为3 µm，并在40 °C水浴中展平切片。
  6. 将切片贴附于载玻片上，放入45 °C烘片机（见材料表）中烘干，随后于室温保存。
  7. 脱蜡与水化：将切片置于60 °C烘箱中脱蜡4小时，随后依次浸入100%二甲苯（三次）、100%乙醇（两次）、95%乙醇、80%乙醇和75%乙醇中，每次5分钟。
  8. 苏木精-伊红（H&E）染色
    1. 脱蜡、水化后，用双蒸水洗涤切片2分钟。
    2. 用0.5%苏木精（见材料表）染色3分钟，再用双蒸水洗涤切片，直至切片表面无残留苏木精。
    3. 将切片浸入1%盐酸乙醇中3秒，再用双蒸水洗涤2分钟。
    4. 将切片浸入1%氨水10秒，再用双蒸水洗涤2分钟。
    5. 用伊红（见材料表）染色1分钟，再用双蒸水洗涤切片，直至切片表面无残留伊红。
    6. 依次将切片浸入95%乙醇、100%乙醇和100%二甲苯（三次），每次1分钟。
    7. 每张切片滴加一滴中性树胶（见材料表），加盖盖玻片封片。
  9. 番红O/快绿（SO）染色
    1. 脱蜡、水化后，用双蒸水洗涤切片2分钟。
    2. 用0.05%快绿（见材料表）染色3分钟，再用双蒸水洗涤切片，直至切片表面无残留快绿。
    3. 将切片浸入1%乙酸溶液10秒，再用双蒸水洗涤2分钟。
    4. 用2.5%番红O（SO）（见材料表）染色2分钟，再用双蒸水洗涤切片，直至切片表面无残留SO。
    5. 依次将切片浸入95%乙醇、100%乙醇和100%二甲苯（三次），每次1分钟。
    6. 每张切片滴加一滴中性树胶，加盖盖玻片封片。
  10. 甲苯胺蓝（TB）染色
    1. 脱蜡、水化后，用双蒸水洗涤切片2分钟。
    2. 将切片浸入1%甲苯胺蓝（TB）溶液（见材料表）中2分钟，再用双蒸水洗涤切片，直至切片表面无残留甲苯胺蓝。
    3. 依次将切片浸入95%乙醇、100%乙醇和100%二甲苯（三次），每次1分钟。
    4. 每张切片滴加一滴中性树胶，加盖盖玻片封片。
  11. Masson染色
    1. 脱蜡、水化后，用双蒸水洗涤切片2分钟。
    2. 滴加Bouin溶液（见材料表）至切片上，在37 °C染色2小时，再用双蒸水洗涤切片，直至切片表面黄色消失。
    3. 用天青石蓝（见材料表）染色3分钟，再用双蒸水洗涤切片，直至切片表面无残留天青石蓝。
    4. 用苏木精染色3分钟，再用双蒸水洗涤切片，直至切片表面无残留苏木精。
    5. 将切片浸入酸性乙醇5秒，再用双蒸水洗涤2分钟。
    6. 用丽春红品红（见材料表）染色10分钟，再用双蒸水洗涤切片，直至切片表面无残留丽春红品红。
    7. 将切片浸入磷钼酸（见材料表）10分钟，再浸入甲苯胺蓝（TB）溶液5分钟，再用双蒸水洗涤切片，直至切片表面无残留TB。
    8. 将切片浸入弱酸溶液2分钟，再用双蒸水洗涤2分钟。
    9. 依次将切片浸入95%乙醇、100%乙醇和100%二甲苯（三次），每次1分钟。
    10. 每张切片滴加一滴中性树胶，加盖盖玻片封片。
  12. 在双盲条件下于显微镜下观察所有切片，依据Mankin评分系统16评估关节软骨退变程度。
  13. 免疫组织化学
    1. 常规脱蜡、水化切片，用PBS洗涤2分钟。
    2. 将切片浸入柠檬酸钠溶液，置于60 °C烘箱中4小时进行抗原修复，再用PBS洗涤三次，每次3分钟。
    3. 将切片浸入0.3% Triton X-100溶液10分钟，再用PBS洗涤两次，每次3分钟。
    4. 在室温下用甲醇配制的3% H2O2溶液处理30分钟，以封闭内源性过氧化物酶活性，再用PBS洗涤两次，每次3分钟。
    5. 在室温下用含5%山羊血清的PBS孵育30分钟，以封闭非特异性结合位点，再用PBS洗涤两次，每次3分钟。
    6. 每张切片加入100 µL PBS稀释的一抗（抗col1，1:50；抗col3，1:50；抗col2，1:100；抗MMP13，1:100；见材料表），于4 °C孵育过夜，再用PBS洗涤两次，每次3分钟。
    7. 每张切片加入100 µL PBS稀释的二抗（1:100，山羊抗兔或山羊抗小鼠，见材料表），室温孵育20分钟，再用PBS洗涤两次，每次3分钟。
    8. 每张切片加入100 µL 3,3'-二氨基联苯胺（DAB，见材料表）工作液。
    9. 在显微镜下观察并记录棕黄色出现的时间；显色反应使抗原表位呈棕黄色17。其余样本均采用相同记录的反应时间进行处理。
    10. 切片显色呈棕黄色后，用双蒸水洗涤两次，每次3分钟。
    11. 用苏木精复染1分钟，再用双蒸水洗涤2分钟。
    12. 将切片浸入盐酸3秒，再用双蒸水洗涤2分钟。
    13. 将切片浸入1%氨水10秒，再用双蒸水洗涤2分钟。
    14. 依次将切片浸入95%乙醇、100%乙醇和100%二甲苯（三次），每次1分钟。
    15. 每张切片滴加一滴中性树胶，加盖盖玻片封片。

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结果

本研究通过在股骨滑车沟处钻孔，建立FTCD大鼠模型，并检测其后续的疼痛行为及组织病理学变化。如图1所示，造模后第3天，与假手术组相比，模型组大鼠的机械缩足阈值（MWT）显著降低，提示FTCD引起了痛觉过敏。造模后第17天，模型组大鼠的机械缩足阈值仍维持在较低水平，表明疼痛敏化可至少持续17天。组织病理学染色结果显示，假手术组关节软骨结构清晰，软骨表面完整，软骨细胞分布均匀，II型胶原高表达；而模型组软骨表面出现凹陷，软骨细胞丢失，基质金属蛋白酶MMP13表达增加，II型胶原表达减少（图2和 图3）。

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讨论

本研究描述了一种通过在大鼠股骨滑车沟处钻孔来模拟临床软骨缺损的动物模型（补充图 1）。软骨损伤后，外周伤害性感受器的兴奋性或反应性增强，可能导致痛阈降低以及对刺激的反应性增强18。在临床前研究中，不同动物物种的软骨缺损模型始终会引发疼痛19。临床研究也表明，软骨损伤患者的疼痛视觉模拟评分（VAS）显著低于健康个体20。我们采用FTCD模型来检测FTCD治疗的效果，结果显示机械缩足阈值（MWT）的下降并非短暂现象，且在短时间内未迅速恢复。经过一段时间的治疗后，模型组的MWT仍显著降低，而治疗组则有所缓解（数据未显示）。临床疗效通常以1个月疗程为评估依据，因此即使数月后出现恢复，也不影响该模型的实验应用。此外，通过病理染色和免疫组织化学方法观察软骨表面缺损，证实了FTCD模型的成功建立。

该FTCD模型构建方法具有以下优势：（1）操作简便；（2）建模周期短；（3）成功...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由浙江省自然科学基金（项目编号 LQ20H270009）、国家自然科学基金（项目编号 82074464 和 82104890）、浙江省中医药科学研究基金（项目编号 2020ZA039、2020ZA096 和 2022ZB137）以及浙江省卫生健康委员会医学卫生科技计划项目（项目编号 2016KYA196）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3,3'-二氨基联苯胺  杭州正博生物科技有限公司ZLI-9019免疫组化染色用染料
抗胶原蛋白III抗体NovusNB600-594免疫组化一抗
抗胶原蛋白II抗体Abcam (英国)34712免疫组化一抗
抗胶原蛋白I抗体NovusNB600-408免疫组化一抗
波因溶液上海源叶科技有限公司R20381马松染色用染料
天青石蓝上海源叶科技有限公司R20381马松染色用染料
玉米芯垫料  小河科技有限公司 实验动物垫料 
伊红Sigma-Aldrich861006苏木精-伊红染色用染料
快绿FCFSigma-AldrichF7252固绿染色用染料
羊抗小鼠抗体中杉金桥（北京，中国）PV-9002免疫组化二抗
羊抗兔抗体中杉金桥（北京，中国）PV-9001免疫组化二抗
苏木精Sigma-AldrichH3163苏木精-伊红染色用染料
马松染色试剂上海源叶科技有限公司R20381马松染色用染料
微型钻机Rwd生命科学有限公司78001手术设备
MMP13Cell Signaling Technology, Inc. (美国马萨诸塞州丹弗斯)69926免疫组化一抗
模块化组织包埋中心Thermo Fisher Scientific (美国)EC 350制备石蜡包埋块
中性树脂杭州正博生物科技有限公司ZLI-9555免疫组化封片剂
不可吸收缝合线杭州华为医疗器械有限公司4-0手术设备
戊巴比妥钠 杭州正博生物科技有限公司WBBTN5G动物麻醉剂
磷钼酸 上海源叶科技有限公司R20381马松染色用染料
丽春红品红上海源叶科技有限公司R20381马松染色用染料
旋转式与滑动式切片机Thermo Fisher Scientific (美国)HM325精确切制石蜡切片
番红OSigma-AldrichS2255固绿染色用染料
手术刀片上海联辉医疗器械有限公司11手术设备
柠檬酸钠溶液 (20x)杭州浩克生物科技有限公司HK1222免疫组化抗原修复液
斯普拉-道利（SD）大鼠 上海斯莱克实验动物有限公司SD实验动物
Tissue-Tek VIP 5 JrSakura (日本)真空浸润处理仪
甲苯胺蓝Sigma-Aldrich89640甲苯胺蓝染色用染料
冯·弗雷纤维丝UGO Basile (意大利) 37450-275MWT实验设备
金属丝网平台 上海玉研仪器有限公司MWT实验设备

参考文献

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