方法文章

踝-距下复合关节不稳的小鼠模型

DOI：

10.3791/64481

⸱

2022年10月28日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopaedics, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 2Orthopaedic Institute, Soochow University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

踝-距下复合关节（ASCJ）是足部的核心结构，在日常活动中对平衡控制起着关键作用。运动损伤常导致该关节不稳定。本文介绍一种通过韧带横断诱导ASCJ不稳定的 小鼠模型。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

踝关节扭伤可能是日常生活中最常见的运动损伤，常导致踝-距下复合关节（ASCJ）不稳定，并可能长期发展为创伤后骨关节炎（PTOA）。然而，由于损伤机制复杂，且临床表现多样，如足外侧出现瘀斑、血肿或压痛等，目前临床上对ASCJ不稳定的诊断和治疗尚无统一共识。由于小鼠后足骨骼与韧带的肌肉骨骼结构与人类相似，本研究通过切断ASCJ周围韧带，建立了小鼠ASCJ不稳定的动物模型。该模型通过一系列行为学测试和组织学分析得到了充分验证，包括平衡木实验、足迹分析（用于评估小鼠运动水平与平衡能力）、热痛觉测试（用于评估小鼠足部感觉功能）、显微计算机断层扫描（CT）以及关节软骨切片染色（用于评估小鼠关节软骨的损伤与退变情况）。小鼠ASCJ不稳定模型的成功建立，将为临床研究踝关节扭伤的损伤机制提供有价值的参考，并有助于开发更有效的治疗方案。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

踝关节扭伤是全球最常见的运动损伤之一。据估计，仅在美国每天就有约10,000人发生此类损伤1，其中运动相关损伤占15%–45%2。美国每年用于治疗踝关节扭伤的医疗费用高达42亿美元3,4,5。慢性足部不稳是踝关节扭伤后常见的问题，约74%的踝关节扭伤患者会出现此类情况6，包括踝关节或距下关节不稳。然而，由于临床症状和体征相似，医务人员在临床上难以判断慢性踝关节不稳是否同时伴有慢性距下关节不稳，因此慢性距下关节不稳容易被漏诊。因此，慢性踝-距下复合关节（ASCJ）不稳（一种同时包含慢性踝关节不稳和慢性距下关节不稳的特定类型慢性足部不稳）的真实发病率可能高于现有报道7,8,9。若未及时治疗，慢性踝-距下复合关节不稳可导致反复的踝关节扭伤，从而形成踝关节扭伤与慢性踝-距下复合关节不稳之间的恶性循环。长期的慢性踝-距下复合关节不稳可引起ASCJ退行性变及创伤后骨关节炎，在严重情况下还可能影响邻近关节

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有动物实验均按照《实验动物护理和使用指南》进行，并经苏州大学 Institutional Animal Care and Use Committee 批准。

1. 手术操作

  1. 将21只6周龄的C57BL/6雄性小鼠分为三组：横突间韧带与距腓前韧带组、横突间韧带与三角韧带组以及假手术组。确保所有小鼠均饲养在符合特定病原体阴性（SPF）标准的环境中。
  2. 在实验开始前，将小鼠适应新的饲养环境（12小时光照/12小时黑暗循环，恒定温度和湿度分别为18–22 °C和40%–70%）2周。实验前1周对小鼠进行平衡木和步态训练，使其能够从平衡木或U形管的一端不停顿地走到另一端。
  3. 在8周龄时，通过将2 mL异氟烷滴加于棉球上并置于密闭容器中使其充分挥发，采用异氟烷吸入法对小鼠进行麻醉。监测小鼠活动情况，持续吸入直至其活动明显减少。通过夹捏小鼠脚趾观察其反应以判断麻醉深度。在后续操作过程中，通过面罩吸入2%气化异氟烷以维持麻醉状态。麻醉期间使用兽用眼膏防止眼睛干燥。
  4. 麻醉完成后，使用剃毛器去除小鼠右后肢踝关节处的毛发，并交替使用碘伏棉球和酒精棉球对暴露的皮肤进行三次消毒。皮下注射5 mg/kg卡洛芬。将小鼠转移至显微外科动物手术室，使用无菌手术垫。
  5. 对于横突间韧带与距腓前韧带（CL + ATFL）组，在右踝关节上方皮肤处用手术刀做一个7 mm斜向下的纵向切口，....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

相关性数据的统计分析使用在线统计分析工具进行。符合正态分布和方差齐性两项检验的数据，采用单因素方差分析进行进一步的统计分析；若数据不符合这两项检验，则采用Kruskal-Wallis检验进行统计分析。数据以均值 ± 标准差（SD）表示，p < 0.05 被认为具有统计学意义。

平衡木实验
对每只小鼠在每个阶段两次通过平衡木所需的平均时间进行统计学分析，结果显示各组小鼠在术前通过平衡木所需时间之间无统计学差异（p = 0.73）。术后3天，CL + ATFL组和CL + DL组小鼠通过平衡木所需时间较假手术组更长，差异具有统计学意义（p < 0.05）。术后4周，CL + ATFL组和CL + DL组小鼠通过平衡木所需时间与假手术组相比无显著差异（p > 0.05）。此外，术后8周和12周，CL + ATFL组和CL + DL组小鼠通过平衡木所需时间均长于假手术组，差异具有统计学意义（p < 0.01）。在各个测试时间段内，CL .......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究通过切断CL + ATFL或CL + DL，成功构建了两种ASCJ不稳定的鼠类模型。术后8周和12周，小鼠通过平衡梁所需的时间显著延长，这与Hubbard-Turner团队通过切断踝关节外侧韧带所得结果相似23,24。在右足滑移试验中，我们观察到两组韧带切断小鼠的滑移次数显著高于假手术组小鼠，且滑移次数在术后12周达到峰值，提示这两组小鼠可能出现了ASCJ不稳定。步态分析显示，尽管小鼠步长随年龄增长逐渐增加，但术后12周时，两组韧带切断小鼠的步长仍低于假手术组，其中CL + ATFL组的步长比假手术组短7.2%。综上所述，上述结果表明，两组韧带切除小鼠的运动水平和平衡能力均受到显著损害。

在CT图像的三维重建中观察到，韧带切断组小鼠的ASCJ关节面比假手术组小鼠更粗糙，关节周围形成骨赘，关节的骨体积分数增加。这些结果提示，韧带切断组小鼠的ASCJ关节软骨存在退行性病变。关节软骨切片染色显示软骨退变，如软骨表面不连续和软骨细胞减少，进一步证实长期ASCJ不稳定可.......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有作者均无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究得到了江苏省政府奖学金项目和江苏省高等教育优势学科建设工程项目（PAPD）的支持。

....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5-0 外科尼龙缝线Ningbo Medical Needle Co., Ltd.191104
酸性乙醇分化液（1%）上海源叶生物科技有限公司R20778
粘附性载玻片江苏世泰实验器材有限公司
氨水溶液（1%）上海源叶生物科技有限公司R20788
无水乙醇国药集团化学试剂上海有限公司
水性乙酸（1%）上海源叶生物科技有限公司R20773
黑色立方体包埋盒上海轶哲仪器有限公司
15 ml 离心管北京索莱宝科技有限公司YA0476
50 ml 离心管北京索莱宝科技有限公司YA0472
盖玻片江苏世泰实验器材有限公司
CTAn 软件Blue scientificmicro-CT 分析软件
Dataview 软件AEMC instruments商业数据分析软件
乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）北京索莱宝科技有限公司E8490
电热恒温培养箱苏州华美设备厂
包埋石蜡Leica, Germany39001006
伊红染色液（醇溶性，1%）上海源叶生物科技有限公司R30117
快绿染色液Sigma-Aldrich, USAF7275
步态纸保定华融造纸厂
GraphPad Prism 8.0Graphpad software在线统计分析工具
碘伏棉球青岛海诺生物工程有限公司
Leica 818 刀片Leica, Germany
Micro-CTSkyscan, BelgiumSkyScan 1176
显微操作镜苏州欧迈特光电科技有限公司
Mimics 软件Materialise 3D 医学图像处理软件 
改良 Harris 苏木精染色液上海源叶生物科技有限公司R20566
小鼠抗小鼠 II 型胶原抗体美国 Abcam 公司
NaOH国药集团化学试剂上海有限公司
正丁醇国药集团化学试剂上海有限公司
中性福尔马林固定液（10%）上海源叶生物科技有限公司
中性树胶Sigma-Aldrich, USA
Nrecon 重建软件 Micro Photonics Inc.
Oaks 电动剃毛器Oaks 集团有限公司
石蜡包埋机Leica, Germany
pH 计上海雷磁公司
磷酸盐缓冲液（PBS）美国 Biosharp
生理盐水（哺乳动物用，无菌）上海源叶生物科技有限公司R22172
萨弗兰宁 O 染色液Sigma-Aldrich, USAHT90432
生理盐水（0.9%）上海百特医疗药品有限公司309107
摇床海门麒麟贝尔仪器制造有限公司2008779
SPSS 23IBM在线统计分析工具
切片机Leica, Germany
组织切片机Leica, Germany
Ugo BasileUgo Basile 生物研究公司
正置荧光显微镜Zeiss Axiovert, Germany
U 形塑料通道上海轶哲仪器有限公司
兽用眼膏Pfizer
二甲苯国药集团化学试剂上海有限公司
YLS-10B 轮式疲劳测试仪济南益延科技发展有限公司

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Waterman, B. R., Belmont, P. J. Jr, Cameron, K. L., Deberardino, T. M., Owens, B. D. Epidemiology of ankle sprain at the United States Military Academy. American Journal of Sports Medicine. 38 (4), 797-803 (2010).
  2. Fong, D. T., Chan, Y. Y., Mok, K. M., Yung, P. S., Chan, K. M.

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

CT

相关文章