neuroHuMiX 是一种先进的肠芯片模型，用于在邻近且具有代表性的共培养条件下研究细菌、上皮和神经细胞之间的相互作用。该模型有助于揭示肠道微生物组与神经系统之间通信的分子机制。
本文内容
摘要
摘要
人体定植的微生物细胞数量至少与人体自身细胞数量相当，其中大多数微生物位于肠道内。尽管宿主与肠道微生物组之间的相互作用已被广泛研究，但肠道微生物组如何与肠神经系统相互作用在很大程度上仍不清楚。迄今为止，尚不存在可用于研究肠道微生物组与神经系统相互作用的生理相关性体外模型。
为了填补这一空白，我们通过在装置中引入由诱导性多能干细胞分化而来的肠神经元，进一步开发了人-微生物互作（HuMiX）肠道芯片模型。由此构建的模型“neuroHuMiX”可在微流控通道中实现细菌、上皮细胞和神经元细胞的共培养，这些通道由半透膜相互分隔。尽管不同类型的细胞彼此分离，但它们仍可通过可溶性因子相互交流，同时还能对每种细胞类型进行独立研究。该体系为探究肠道微生物组如何影响肠神经元细胞提供了初步见解，是研究和理解人类肠道微生物组-神经系统轴的关键第一步。
引言
人类肠道微生物组在人类健康与疾病中发挥着关键作用。过去十多年中，该领域得到了广泛研究，其在调节健康与疾病中的潜在作用现已得到证实1。微生物组的紊乱导致微生物群落失衡（即菌群失调），被认为参与多种慢性疾病的发生发展，如肥胖、炎症性肠病和结直肠癌，甚至包括帕金森病等神经退行性疾病2,3。
尽管人类肠道微生物组与神经系统疾病相关，但肠道微生物组如何与肠神经系统进行通信并影响其功能仍不清楚。由于人类肠神经系统难以直接用于即时研究，迄今为止相关实验主要依赖动物模型4然而，鉴于动物模型与人类之间存在的明显差异5，其发展 体外 模拟人类肠道的模型具有重要的研究价值。在此背景下，人类诱导性多能干细胞（iPSCs）这一快速发展且不断进步的领域使我们能够获得具有代表性的肠神经元（ENs）6. 由iPSC衍生的ENs可用于研究肠神经系统 体外 培养模型，例如细胞培养小室、类器官或器官芯片7,8.
人-微生物互作（HuMiX）模型是一种模拟人体肠道的“肠道芯片”模型9。最初的HuMiX模型（下文称为初始装置）可容纳肠上皮细胞（Caco-2）和细菌细胞10,11。然而，为了研究肠道微生物组与神经系统之间的联系，该系统中也引入了由诱导多能干细胞（iPSC）衍生的肠神经元（ENs）6（图1）。神经元、上皮细胞和细菌细胞在近端共培养的条件下，可对不同类型细胞分别进行分析，并在模拟人体肠道环境的条件下研究各类细胞之间的相互作用。
近年来，通过使用器官芯片（例如肠道芯片）模型，已开发出更能真实反映生理条件的器官研究模型。由于能够持续供应营养物质并清除代谢废物，同时可实时监测氧浓度或屏障完整性等参数，这些模型能更真实地模拟人体肠道环境8,12。此类模型特别适用于研究肠道细菌对宿主细胞的影响。然而，若要利用器官芯片研究肠道微生物组与神经系统之间的相互关系，则需要将神经元细胞整合到这些系统中。因此，进一步开发HuMiX并建立神经HuMiX系统（以下简称装置）的目标是构建一种包含肠道上皮细胞、细菌以及邻近共培养的肠神经元细胞的肠道芯片模型。
方案
1. 细胞培养与分选
- 诱导多能干细胞来源的肠神经元
注意：在实验开始前6周培养诱导多能干细胞（iPSCs）。肠神经元（ENs）的分化方案改编自Fattahi等人的研究6。- 将iPSCs接种于基质胶包被的6孔板中，每孔加入2 mL iPSC培养基，并添加1%青霉素-链霉素（P/S）。
- 当细胞融合度达到80%–90%时进行传代，将细胞接种至基质胶包被的培养板中，使用相同培养基，在37 °C、5% CO2、相对湿度90%（RH）条件下培养。
- 对于iPSC的衍生培养，在解冻后经过两次传代且细胞融合度达80%–90%时，以每孔100,000个细胞的密度将细胞接种于基质胶包被的6孔板中。加入上述培养基并添加ROCK抑制剂Y-27632（1:2,000），在37 °C下孵育24小时。
- 24小时后，根据表1更换为第0天培养基。设置一个对照孔，用于后续细胞分选过程中的阴性对照。在整个衍生期间，对照孔始终使用第0天的培养基成分。从第2天到第10天，每隔一天更换一次培养基，具体参照表1。
- 第11天，对细胞进行CD49d阳性细胞分选，用于本方案的后续步骤。
- 收集待分选的细胞（包括CD49d阳性细胞群体及对照孔细胞），以300 × g离心3分钟。将细胞沉淀重悬于含2%牛血清白蛋白（BSA）和1% P/S的1×磷酸盐缓冲液（PBS）中。
- 将每批细胞（混合样本和对照）分为两份：一份用抗人CD49d抗体染色，另一份用同型对照抗体染色。
- 首先圈选主要细胞群，再圈选单细胞群体，据此筛选出表面表达CD49d的细胞。收集这些细胞用于下一步分化。
注意：通常情况下，分选出的细胞中有30%–40%为CD49d阳性。
- 将200万至400万个分选后的细胞转移至超低吸附6孔板中的一个孔内，加入N2B27培养基（见表2），并添加FGF2和CHIR，培养4天以促进类球体形成。
- 第15天，将类球体重新接种于经多聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白/纤连蛋白（P/L/F）包被的6孔板中，每孔加入2 mL N2B27培养基，并添加GDNF和抗坏血酸（AA）。每2–3天更换一次培养基。
注意：包被比例为：多聚-L-鸟氨酸15 µg/mL，层粘连蛋白2 µg/mL，纤连蛋白2 µg/mL，溶于1× PBS中。 - 3周后，将细胞用于装置中的接种。
- Caco-2细胞
注意：实验前至少1周解冻Caco-2细胞。- 在T75培养瓶中接种1 × 106个Caco-2细胞，使用含谷氨酰胺补充剂、HEPES及10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基，在37 °C、5% CO2、相对湿度90%的条件下培养。
注意：本实验建议使用解冻后第一或第二代的Caco-2细胞。
- 在T75培养瓶中接种1 × 106个Caco-2细胞，使用含谷氨酰胺补充剂、HEPES及10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基，在37 °C、5% CO2、相对湿度90%的条件下培养。
2. HuMiX 运行准备
- 聚碳酸酯盖板的准备与包被
- 使用初始设备仪器循环，对一对聚碳酸酯（PC）盖板（图2）以及四枚螺丝进行高压灭菌（详见表3）。
- 在生物安全柜中，将四枚螺丝分别插入底部PC盖板的四个角（见图3），然后转移至无菌方形培养皿中，进行两步包被处理。
- 第一天，在PC盖板中央加入2 mL含1.5%多聚-L-鸟氨酸的PBS（1×）溶液。于37 °C、5% CO2、90%相对湿度条件下过夜孵育。
- 第二天，移除溶液，并替换为含有0.2%层粘连蛋白和0.2%纤连蛋白的PBS（1×）溶液，以覆盖神经元细胞腔表面。于37 °C、5% CO2、90%相对湿度条件下过夜孵育盖板。
- 孵育结束后，保留包被液于PC盖板上，并用封口膜密封培养皿。置于4 °C保存，直至使用。
- 使用前，移除包被液，并在生物安全柜中风干30分钟，直至包被层完全干燥。
- 垫圈的准备与包被
注：本节描述如何通过将半透膜粘附至硅胶垫圈来制备垫圈。在初步高压灭菌后，使用胶原蛋白或黏蛋白对垫圈进行包被，以促进肠上皮细胞或细菌的黏附。经黏蛋白包被的膜可模拟人体肠道中存在的黏液屏障。- 将孔径为1 µm的聚碳酸酯膜贴附于胶原蛋白垫圈上，将孔径为50 nm的聚碳酸酯膜置于上下夹心式垫圈之间。使用初始设备仪器循环对带有膜的垫圈进行高压灭菌（见表3）。
- 为包被膜，将每个垫圈置于无菌方形培养皿中。
注：包被操作需在生物安全柜内的无菌条件下进行。- 对于胶原蛋白垫圈，在膜上加入3 mL浓度为50 µg/mL的胶原蛋白溶液，并于37 °C孵育3小时。
注：加入胶原蛋白时，注意避免移液枪头接触膜表面，以防损坏膜。 - 对于黏蛋白包被，将夹心式垫圈顶部朝上放置于培养皿中，向膜的上表面加入3 mL浓度为0.025 mg/mL的黏蛋白溶液。于37 °C孵育1小时。
- 对于胶原蛋白垫圈，在膜上加入3 mL浓度为50 µg/mL的胶原蛋白溶液，并于37 °C孵育3小时。
- 孵育结束后，吸除胶原蛋白和黏蛋白溶液，并在生物安全柜中风干膜30分钟。盖上培养皿，用实验室封口膜密封，于4 °C保存至使用。
- 管路组装
注：本节描述如何组装用于设备灌注的管路。组装前，应对所有组件进行高压灭菌，或购买已单独包装于无菌容器中的组件。将所有部件置于生物安全柜中。- 每个设备使用三条管路；每条管路包括一段泵管、两段长Marprene管（20 cm）、两段短Marprene管（8 cm）、一根40 mm针头用于流出液瓶、一根120 mm针头用于250 mL流入液瓶或一根80 mm针头用于较小流入液瓶、三个雄式和七个雌式鲁尔接头转接头、三个鲁尔适配器，以及两个三通旋塞阀。
- 使用上述已高压灭菌并灭菌的组件，从左至右组装管路（图4）。
注：每次连接步骤之间，需用70%乙醇喷洒各组件。
- 培养基的制备
注：本节描述如何为设备中不同类型的细胞制备培养基，以及如何以无菌方式将培养基转移至血清瓶中。- 在RPMI 1640培养基中添加10%经0.22 µm滤膜过滤并热灭活的胎牛血清（FBS）。新鲜配制N2B27培养基，并添加GDNF和AA。
- 在无菌条件下将培养基转移至血清瓶中。将200 mL RPMI 1640培养基转移至250 mL瓶中，将30 mL N2B27培养基转移至50 mL瓶中。
- 细菌培养基（RPMI 1640 + 10% FBS + 5% De Man, Rogosa和Shapre培养基[MRS]）在后续阶段配制，因其仅在实验最后24小时需要。
- 用隔垫封闭瓶口，铝帽压封，并进行高压灭菌。
- 转移培养基时，使用合适的开瓶器（直径=20 mm）去除铝帽，同时取下隔垫。小心将配制好的培养基倒入血清瓶中，避免接触瓶体。
- 为灭菌，使用便携式本生灯火焰灼烧瓶口。通过向隔垫喷洒70%乙醇，将其置于瓶口后使用压封器加装铝帽密封瓶口。
- 将密封后的瓶子置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育24小时，使培养基升温至37 °C，并确保在用于设备前无可见污染迹象。
3. HuMiX 启动
- NeuroHuMiX 组装
注意：本节介绍设备的组装方法。简而言之，首先对夹紧系统进行灭菌并重新拧紧，然后将底部聚碳酸酯（PC）盖置于夹具底座上。随后依次叠加涂覆过的垫圈和顶部PC盖，再放上夹具的上部组件。最后拧紧夹具，使垫圈受压，确保系统无泄漏且气密。 图4 展示了组装所需的不同部件。- 在组装前对夹具和两个PC盖子（上盖和下盖）进行高压灭菌。
- 拧紧用于组装夹具顶部和底部的螺丝（图4C，D）。在高压灭菌前先打开螺丝，灭菌后再重新拧紧。
- 将已包被并干燥（步骤 2.2.3）的底部 PC 盖转移图4 A1通过握住PC盖四角的四个螺丝，将方形培养皿移至夹具底座的顶部。
注意：避免触碰 PC 盖子，以降低污染风险。 - 将上皮细胞室密封圈朝上放置（即., 使用无菌镊子将膜朝上放置于PC盖上。利用螺丝对齐垫圈与PC盖，确保盖子角落的进出口与垫圈上的开口对齐（图3).
- 使用无菌镊子将三明治垫片放置在胶原垫片上方，确保正面朝上。
- 将上层聚碳酸酯（PC）盖置于夹心垫圈上方。为降低污染风险，操作时仅可触碰盖子的边缘（不可触碰盖子的顶部或底部表面）。确保夹具盖上的凸起接头与膜组件的进液口和出液口对齐，且下层PC盖的螺钉插入上层PC盖的开孔中。
- 关闭装置时，将夹具盖（夹具的上部）放置在PC盖的顶部，确保盖子上的开口与顶部PC盖的进液口和出液口接头对齐。扣紧卡扣。保持装置处于闭合状态（图5在通风橱内连接已预冲的管路（步骤 3.2.6）。
- 管路预处理
注意：本节介绍如何将管路连接至进液瓶和出液瓶，以及泵体，并随后用培养基对管路进行预灌注，以清除清洁和灭菌过程中残留的任何物质，同时确保管路中无气泡存在。- 在生物安全柜中进行管路预充。将带滤器的通气针插入每个进液瓶和出液瓶的隔膜中。使用洁净的无菌镊子，将120 mm针头插入250 mL血清瓶中，将80 mm针头插入50 mL血清瓶中。
- 将每根管路末端的40 mm针头插入流出液血清瓶中。每个装置配备两个流出液瓶，对应三条管路。上皮和神经管路的40 mm针头连接至同一个流出液瓶，用于废弃培养基；细菌管路则接入第二个流出液瓶。
- 将泵管路插入泵 cassette 中，确保管路的三通旋塞均处于打开状态。
- 最初，将蠕动泵设置为以5 rpm的速度将培养基从流入瓶输送至流出瓶（参见 表4).
注意：在管路预充期间，可将转速提高至10 rpm以加快进程。 - 按下按钮启动泵 开始 按钮，并确保泵送方向为顺时针。当培养基开始滴入流出瓶时，检查是否存在泄漏，并确保管路和连接处无残留气泡。通过轻敲管路和接头或提高泵速的方式排除任何残留气泡。
- 当所有导管管路均已接入流出瓶后，将流速设置为2 rpm，以连接初始装置。
- 设备的预处理
注意：本节介绍如何使用细胞培养基对装置进行预灌注，以确保所有腔室均被培养基充满并预先包被，从而避免系统中残留气泡，并使细胞在接种时易于贴附。- 在生物安全柜内以无菌条件对装置进行预处理。连接装置时，首先连接神经元通道，即装置的下室。
- 连接管路时，关闭三通旋塞阀（图5C），首先从流出端开始，将短管从雌性鲁尔接头断开，并通过将管路推至倒刺接头上，连接到设备的出口端口。为确保连接正确并减少泄漏和/或污染的风险，请将管路完全推到底，使其与盖子紧密接触。以相同方式连接流入端管路。当一条管路（流入和流出）完全连接到设备后，打开三通旋塞。
- 用上皮细胞悬液重复上述步骤，然后用细菌悬液重复相同操作。保持泵的流速为2 rpm。将泵速提高至2.5 rpm，但不得超过此速度，以避免因压力积聚导致泄漏。让泵对装置中的腔室进行预灌注。
- 始终密切监测流出液血清瓶。如果气泡滞留在腔室、管路或连接器中，含有气泡的管路在流出腔中将不再持续滴液。为排除气泡，首先让装置运行数分钟。若此操作未能解决问题，可暂时关闭其中一个正在滴液的管路，即关闭流出端的三通旋塞阀。
- 当装置的所有腔室完全预充（所有腔室均充满细胞培养基且装置内无气泡）后，将泵速降低至0.5 rpm。此时装置已准备好进行细胞接种。
4. 细胞准备与接种
注意：本节介绍如何制备接种装置所需的不同细胞类型，以及如何以无菌方式将细胞接种至装置中且不引入气泡。此外，还介绍了如何对神经元细胞进行培养基更换，以及如何为装置中的细菌培养物制备培养基。
- 上皮细胞
- 使用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）从培养瓶中消化Caco-2细胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬细胞，台盼蓝排斥法在血球计数板上进行细胞计数。将Caco-2细胞悬液离心（3分钟，300 × g） g），弃去上清液以去除残留的胰蛋白酶-EDTA。将Caco-2细胞重悬于RPMI 1640培养基（含10% FBS）中，制成浓度为350,000个细胞/mL的细胞悬液。每个装置需要1.5 mL。
- 将1.5 mL Caco-2细胞悬液转移至一支无菌的2 mL注射器中，并排出注射器中残留的任何空气或气泡。
- 关闭细菌室和神经元室管路上的三通旋塞阀。通过将带有相应管路的泵管组件从转子上取下，使细菌室和神经元室的管路与泵分离。
- 打开通向上皮腔的进液管路上三通旋塞阀的盖帽，并旋转三通旋塞阀，将培养基流动方向从装置重定向至“开放连接头”（图5C让培养基流动，直至三通旋塞阀的开口端出现一滴培养基。
- 使用液滴-液滴连接法，将装有上皮细胞的注射器插入“开放连接器”中，以便在不引入气泡的情况下将注射器接入连接器。旋转三通旋塞阀，阻断来自进液瓶的培养基流动通过 泵）并允许连接的注射器向初始装置流动。将上皮细胞通道与泵断开。
- 缓慢推动注射器，将细胞悬液接种至上皮细胞腔室中。确保每3秒左右有一滴液体滴入流出瓶中。
- 加入1.5 mL细胞悬液，然后关闭流出三通旋塞阀。取下注射器，并用盖帽封闭三通旋塞阀的开放端。保持灌流室封闭至少2小时。在此期间，接种神经元细胞。
- 神经元细胞
- 使用移液器将细胞重悬于各自孔中的培养基中，从而从孔中解离神经元细胞。每个装置接种一个孔的完全汇合细胞（9.6 cm²）26 孔板中的孔
- 将细胞沉淀重悬于相应体积的N2B27培养基中（每装置1.5 mL培养基）+ 每毫升细胞悬液加入1 µL纤连蛋白。取1.5 mL重悬的细胞悬液转移至2 mL注射器中，并去除注射器中残留的气泡。将装有细胞悬液的注射器置于无菌50 mL锥形管中，转移至含有预启动HuMiX装置的生物安全柜内。
- 采用与上皮细胞室接种相同的接种流程，仅更换管路。此处，将细菌管路和上皮细胞管路从泵上断开。
- 神经元细胞接种后，关闭管路中所有三通旋塞，并从泵上断开。将装置置于37 °C、5% CO₂的培养箱中2保持所有通道关闭2小时，以使细胞充分贴壁。
- 2小时后，将细菌通道和上皮细胞通道连接至泵，并打开两条管路的进液和出液三通旋塞。在装置初始运行的接下来14天内，除更换培养基外，保持神经元腔室关闭。
- 在14天的培养过程中，每隔3-4天更换一次神经元培养室的培养基。每次更换培养基时，每个装置准备3 mL新鲜N2B27培养基，转移至无菌的20 mL血清瓶中。使用无菌隔垫和铝制压盖密封含培养基的血清瓶。
- 在新瓶子的隔膜中插入通气针和80毫米针头。将孵育箱中的旧培养基瓶更换为新瓶，方法是将公鲁尔接头从旧瓶针头断开，连接至新瓶针头。
- 将神经元培养室的泵管与泵连接，并打开三通旋塞阀。以0.5 rpm的速度让培养基流动2小时，随后关闭神经元管路的三通旋塞阀，并从泵上断开，直至下一次更换培养基。
5. 细菌培养与接种
注意：本研究中，在第12天，从甘油保存液中复苏了一株罗伊氏粘液乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）F275的液体培养物。根据实验需求或研究设计的不同，也可使用其他细菌种类。
- 准备三支含有5 mL MRS肉汤的试管——一支无菌对照管和两支用于接种L. reuteri的试管。用接种环刮取甘油保存菌种的表面部分，并转移至其中一支试管中。对第二支接种试管重复此操作。将试管在37 °C、170 rpm条件下过夜培养。
注意：切勿让甘油保存菌种解冻。 - 通过将RPMI 1640培养基（含10% FBS）与5% MRS肉汤混合，为初始装置配制新鲜培养基。每套装置准备25 mL，并在无菌条件下转移至100 mL血清瓶中。用无菌隔膜和铝制压盖密封瓶子，并将瓶子置于37 °C、5% CO2培养箱中过夜。
- 在将瓶子连接至细菌管路之前，向每瓶RPMI 1640/MRS培养基中插入一根通气针和一根80 mm针头。
- 准备新的试管，每支含3 mL RPMI 1640 + 10% FBS + 5% MRS肉汤。至少准备两支试管，分别为一支对照管和每套装置对应的一支接种管。取15 µL的L. reuteri过夜培养物（光密度[OD] > 2）接种至其中两支新制备的试管中。
- 将试管在37 °C、170 rpm条件下孵育1小时，直至达到OD值0.05–0.10，相当于约1 × 107菌落形成单位（CFU）/mL。将1.5 mL菌液转移至一支2 mL注射器中（每套装置一支）。剩余菌悬液用于CFU平板计数及活/死染色分析。
- 对装置进行细菌接种时，操作步骤同第4.1步所述，但此处神经元和上皮细胞管路应保持关闭状态。
- 接种后，关闭细菌管路的阀门并从泵上断开，使系统静置30分钟。随后连接上皮细胞与细菌管路并重新开启。让装置在37 °C、0.5 rpm条件下继续运行24小时。
6. HuMiX 装置的开启与取样
注意：以下部分描述了不同类型细胞的取样。例如，神经元细胞沉淀用于RNA提取及后续定量聚合酶链式反应（qPCR），细菌沉淀用于DNA提取和16S rRNA基因测序，上清液则用于酶联免疫吸附测定（ELISA）及其他检测（如乳酸测定）。
- 第14天，即开放日，关闭所有三通旋塞，将管路从泵上断开，并将培养箱中的装置取出至实验台。
注意：移动设备时，应确保设备本体保持水平。 - 在缓慢打开夹子之前，先移除连接到设备上的管路，然后取下夹子盖。小心地取下顶部的PC盖，将培养基收集到1.5 mL微量离心管中，并置于冰上。
- 轻轻取下夹心垫圈，同时收集上皮侧室中的培养基；注意不要触碰细胞层。将夹心垫圈放入方形培养皿中，并加入无菌0.9% NaCl溶液2将液体加入细菌室，直至完全覆盖该室（约1 mL）。
- 缓慢移除胶原垫，同时收集神经元室中的培养基，并转移至微量离心管中。将所有装有培养基的离心管置于冰上。将胶原垫放入方形培养皿中，并向Caco-2细胞层轻轻加入数毫升1x PBS，直至完全覆盖细胞层。
- 将底部PC盖置于方形培养皿中，并在神经元细胞上方轻轻加入约2 mL的1×PBS，以防止取样过程中细胞干燥。
- 将细菌培养液管在5,000 × g 4 °C下离心5分钟。将上皮和神经元培养基管在300 × g 4 °C下离心5分钟。离心后，将每管的上清液转移至新的微量离心管中，并立即置于干冰上。
- 上皮细胞
- 轻轻移除垫片中的 PBS，并收集至 15 mL 圆锥管中。向细胞中加入 2 mL 胰蛋白酶，将垫片置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 5 分钟。2孵育后，向垫圈中加入 2 mL RPMI 1640 培养基，重悬细胞，并收集至另一支 15 mL 圆锥形离心管中。
- 将两个试管在300 × g下离心5分钟 g弃去上清液。将PBS洗涤所得沉淀重悬于300 µL PBS中，细胞沉淀重悬于1 mL PBS中。
- 将每管中的50 µL转移至0.5 mL微量离心管中，用于自动细胞计数仪和台盼蓝排斥法细胞计数。将重悬的细胞沉淀（1 mL）转移至1.5 mL离心管中，在300 × g 5 分钟。
- 移去上清液，将细胞沉淀重悬于 250 µL 裂解缓冲液 + 1% beta-mercaptoethanol 中，然后将离心管置于干冰上。
- 神经元细胞
- 将上一步骤（6.5）中带有神经元细胞的方形培养皿（含底部和透明聚碳酸酯盖）置于倒置相差显微镜下观察。
注意：在移动装有 PBS 的 PC 盖玻片时，务必格外轻柔，因为神经元网络极易脱落。 - 在接种前，使用明场显微镜观察神经元细胞的形态和细胞密度，进行最终质量检查。确认细胞已从类球体迁移出来，并形成了神经元网络。神经元网络应达到约90%的融合度。更多细节请参见 Fattahi 等人的研究。6.
- 在实验台处，用 PBS 重悬细胞并收集至 1.5 mL 离心管中。以 300 × g 3分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于250 µL裂解缓冲液加1% β-巯基乙醇中，并置于干冰上。
注意：免疫荧光（IF）染色可在聚碳酸酯（PC）盖片上的神经元细胞上进行。若优先选择IF染色以避免破坏神经元网络，则应使用4%多聚甲醛（PFA）对细胞进行固定，但此操作将导致PC盖片无法在后续实验中重复使用。
- 将上一步骤（6.5）中带有神经元细胞的方形培养皿（含底部和透明聚碳酸酯盖）置于倒置相差显微镜下观察。
- 细菌细胞
- 将附着在膜上的细菌细胞重悬于0.9% NaCl溶液中。如果细胞附着牢固，可轻轻使用细胞刮刀将细菌细胞从膜上刮下。
注意：使用细胞刮可能会损伤细胞，增加观察到更多死细胞的概率。 - 将细胞悬液收集至15 mL锥形管中。将之前收集的培养基中剩余的沉淀物加入同一15 mL锥形管中。在5,000 × g 4 °C下离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL 0.9% NaCl溶液中。
- 将该体积分为三部分：一部分用于细菌沉淀的冷冻以进行核酸提取（650 µL），一部分用于在MRS平板上进行菌落形成单位（CFU）涂布（50 µL），另一部分用于活/死染色（300 µL）。为制备用于核酸提取的沉淀，将细胞悬液转移至微量离心管中，在5,000 × g 4 °C下离心5分钟，弃去上清液。将细胞沉淀置于干冰上。
- 采样结束后，将所有试管置于干冰上，转移至-80 °C冰箱中保存，以备后续分析使用。
注意：上清液可进一步用于气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析。此外，在打开装置时，可将胶原蛋白包被的膜分割为不同部分用于多种分析——一半用于occludin免疫荧光染色，另一部分用于RNA提取以进行后续基因表达分析，其余部分用于细胞计数。
- 将附着在膜上的细菌细胞重悬于0.9% NaCl溶液中。如果细胞附着牢固，可轻轻使用细胞刮刀将细菌细胞从膜上刮下。
结果
在neuroHuMiX中，我们将三种不同类型的细胞共同培养——细菌、上皮细胞和神经元细胞（图1）。为了确保所有细胞均具有活性，我们对不同类型的细胞进行了多种检测。例如，对细菌细胞进行菌落形成单位（CFU）计数，对上皮细胞进行细胞计数和细胞活力检测，而神经元细胞则进行评估 通过 显微分析
图1：neuroHuMiX 及其实验装置的示意图。（A）三个培养室被夹在两个聚碳酸酯（PC）盖板之间以保持封闭。每个培养室中加入特定的培养基，用于培养其中的细胞。不同培养室之间由半透膜隔开，允许可溶性因子穿过膜实现细胞间通讯。via 可溶性因子穿过膜实现细胞间通讯。（B）neuroHuMiX 装置的示意图。每个培养室连接不同的培养基瓶。对于细菌培养室，在前12.5天连接 RPMI + 10% FBS 培养基，最后36小时更换为 RPMI + 10% FBS + 5% MRS 培养基。缩写：PC = 聚碳酸酯（polycarbonate）；P/L/F = 多聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白/纤连蛋白（poly L-ornithine/laminin/fibronectin）；RPMI = 罗斯韦尔帕克纪念研究所细胞培养基（Roswell Park Memorial Institute cell culture medium）；MRS = 德曼、罗戈萨和夏普培养基（De Man, Rogosa, and Sharpe culture medium）。请点击此处查看该图的放大版本。
为确定细胞是否已正确贴附，在打开装置后，我们评估了胶原蛋白包被膜上细胞层的形成情况（图6A）。为确保装置内细胞具有活性，我们进行了自动细胞计数（图6B）和台盼蓝排斥实验细胞计数（图6C）。这些实验使用了来自三种不同HuMiX装置设置的Caco-2细胞：（i）与ENs共培养的Caco-2细胞，（ii）与L. reuteri共培养的Caco-2细胞，以及（iii）三种细胞类型共同培养的装置。采用单因素方差分析进行统计检验，结果显示各细胞类型之间无显著差异，表明在本研究测试的所有初始装置设置和条件下，Caco-2细胞均保持存活状态。这说明L. reuteri与两种人类细胞共培养期间达到的细菌密度对人类细胞无细胞毒性作用。
图 6：Caco-2 细胞在胶原蛋白包被膜上的评估。（A）打开装置后，Caco-2 细胞在胶原蛋白包被膜上的分布情况。箭头指示被虚线圆圈包围的胶原蛋白包被膜。Caco-2 细胞在膜上的螺旋结构上生长。在 HuMiX 中培养 14 天后 Caco-2 细胞的存活率。细胞计数通过（B）自动细胞计数仪和（C）台盼蓝排斥法获得。Caco-2 细胞计数来自初始装置中的不同培养设置：与肠神经元（ENs）共培养（黑色）、与 L. reuteri 共培养（橙色），以及在装置中同时与 ENs 和 L. reuteri 共培养（蓝色）。采用单因素方差分析（one-way ANOVA），结果显示不同培养条件之间无显著差异（单因素方差分析，p = 0.1234 [ns]；误差线表示标准误）。请点击此处查看该图的放大版本。
为了能够在装置中将L. reuteri与哺乳动物细胞共培养，我们首先优化并调整了适用于该装置的培养基。我们发现，在RPMI 1640培养基（添加10%胎牛血清）中加入5%的MRS培养基，最适合L. reuteri的生长，同时对本实验所用的哺乳动物细胞无细胞毒性。随后，通过菌落形成单位（CFU）计数评估了L. reuteri在装置中培养24小时后的生长情况。我们对两种不同的初始装置设置进行了CFU计数（图7）：L. reuteri与Caco-2细胞共培养，以及仅在装置中培养L. reuteri。在这两种设置中，CFU计数均显著不同于HuMiX接种物和收获的细胞（单因素方差分析，p = 0.0002），表明细菌细胞在装置内部发生了增殖。
图 7：Limosilactobacillus reuteri 接种物（稀释1:100,000）及在HuMiX中培养24小时后的CFU计数。 两种不同实验设置：Caco-2细胞与L. reuteri共培养并使用该装置。单因素方差分析显示接种物与收获细胞之间存在显著差异（p = 0.0002 [***]），表明细菌在HuMiX装置内生长。误差棒表示标准误差。缩写：CB.HX = Caco-2细菌HuMiX；nHX = 神经HuMiX。 请点击此处查看该图的放大版本。
为了评估在装置内培养肠神经元（ENs）是否会改变细胞的表型，使用倒置相差显微镜观察了肠神经元的总体形态。在此步骤中，同时评估了细胞融合度及肠神经元的形态。形成融合的神经元网络表明细胞已良好地贴附于经包被的装置聚碳酸酯（PC）盖上。重要的是，这表明细胞能够在与Caco-2细胞和L. reuteri共培养的条件下生长。融合神经元网络与垫圈界定的螺旋区域之间的边界清晰可见（图8）。
图8：在装置中培养14天后的肠神经元。 图像左侧，神经元已在螺旋结构上生长形成融合层。神经元层与无细胞区域之间的边界即为螺旋的边缘；放大10倍，比例尺 = 200 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：装置中使用的盖板。图像显示顶部（左）和底部（右）聚碳酸酯（PC）盖板。 PC盖板每边长6.4 cm。缩写：PC = 聚碳酸酯。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：底部PC盖板上的上皮细胞室垫片。 上皮细胞室垫片置于底部PC盖板上的俯视图（左），以及显示垫片与底部PC盖板的进样口和出样口对齐情况的底视图（右）。垫片各边及PC盖板边长均为6.4 cm。缩写：PC = 聚碳酸酯。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 4：装置的组装。（A）用于组装HuMiX的不同部件：（1）底部聚碳酸酯（PC）盖板；（2）带有胶原蛋白包被的微孔膜垫片，置于（1）之上；（3）夹层垫片，其中间含黏蛋白包被的纳米孔膜，置于（2）之上；（4）顶部PC盖板，置于（3）之上。垫片和PC盖板每边长度均为6.4 cm。（B）将（A）中所有部件组装在一起。（C,D）组装完成后的装置——顶部（左）和侧面（右）视图。B被放入夹紧系统中以封闭整个系统。（C）顶部夹具每边长度为8 cm。缩写：PC = 聚碳酸酯。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：单个腔室所需管路组件及组装完成的管路系统。 （A）构建管路系统的各个部件：a. 泵用管路；b. 三通旋塞阀；c. 40 mm 针头；d. 80 mm 针头；e. 120 mm 针头；f. 长管路（20 cm）；g. 短管路（8 cm）；h. 雄性鲁尔接头；i. 雌性鲁尔接头；j. 连接适配器。（B）用于细菌或上皮细胞腔室的组装管路系统。对于神经元腔室，需将 120 mm 针头更换为 80 mm 针头。（C）三通旋塞阀旋转至将培养基流动方向从装置重定向至“开放连接器”，并关闭腔室。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 天数 | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |
| 培养基成分 | 100% E6 | 100% E6 | 75% E6 | 50% E6 | 25% E6 | 100% N2 |
| + LDN | + LDN | 25% N2 | 50% N2 | 75% N2 | + LDN | |
| + SB | + SB | + LDN | + LDN | + LDN | + SB | |
| + CHIR | + SB | + SB | + SB | + CHIR | ||
| + CHIR | + CHIR | + CHIR | + RA | |||
| + RA | + RA | |||||
| 分子 | [浓度] | |||||
| LDN | 100 nM | |||||
| SB | 10 µM | |||||
| CHIR | 3 µM | |||||
| 视黄酸 (RA) | 1 µM |
表1：培养基成分。
| 培养基 | 成分（浓度见材料表） | 体积（mL） |
| N2 培养基（50 mL） | DMEM-F12 | 48 |
| N2 Supplement | 0.5 | |
| L-Glutamine | 0.5 | |
| Penicillin/Streptomycin | 0.5 | |
| NEAA | 0.5 | |
| N2B27/ENS 培养基（50 mL） | Neurobasal | 48 |
| N2 Supplement | 0.5 | |
| L-Glutamine | 0.5 | |
| Penicillin/Streptomycin | 0.5 | |
| B27-A | 0.5 |
表2：培养基配方。
| 灭菌温度 (°C) | 116 |
| 灭菌时间 (min) | 20 |
| 干燥时间 (min) | 10 |
| 脉冲次数 | 3 |
| 结束温度 (°C) | 99 |
表3：HuMiX高压灭菌运行。
| 每分钟转数 (rpm) | 平均流速 (µL/min) |
| 0.5 | 13 |
| 2 | 79 |
| 5 | 180 |
表4：蠕动泵的流速。
讨论
目前公认，人类肠道微生物组影响宿主的健康与疾病状态。尽管已有知识表明微生物组的重要性，尤其是在阿尔茨海默病或帕金森病等神经系统疾病中3,13，但肠道微生物组如何与肠神经系统相互作用，并进一步与大脑相互作用，仍 largely 未知。
迄今为止，尚无一种代表性模型可用于研究肠道微生物组与神经系统之间的相互作用。关于肠-脑轴的研究传统上一直采用小鼠模型进行。13小鼠与人类的基因组序列有85%相同14，但在将小鼠与人类进行比较时，存在一些重要的差异需要考虑。就肠道而言，需要注意的是，与人类相比，小鼠是严格的草食性动物。因此，其胃肠道在长度和特征上均有所不同，例如“胃排空”14小鼠大脑也表现出重要差异，小鼠与人类的整体脑结构有所不同15重要的是，人类神经前体细胞的细胞周期时间更长15因此，建立包含人源细胞（如肠细胞和神经元细胞）的代表性模型显得尤为重要5在此背景下，可重复性更高的研究的开发 体外 模型减少了对动物模型的需求，并提高了可重复性。
neuroHuMiX 是先前 HuMiX 模型的高级版本9HuMiX 是一种肠道芯片模型，可实现上皮细胞与细菌细胞的邻近且具有代表性的共培养。通过细胞间的邻近共培养以及分泌因子和代谢物的扩散，可实现细胞间通讯。 通过 半透膜。然而，为了扩展初始装置在研究人类肠道环境中的应用，需要引入另一种细胞类型。为此，通过引入由诱导性多能干细胞（iPSC）分化而来的肠神经元（ENs），开发出神经-人微生理系统（neuroHuMiX），实现了细菌、肠上皮细胞和肠神经元的近端共培养。由此产生的 体外 该模型使我们能够探究人类肠道微生物组与人类神经系统之间的关联。共培养不同类型的细胞，尤其是哺乳动物细胞与细菌的共培养，面临多种挑战，包括细胞活力下降、贴壁性差以及整体汇合度降低等问题。16在此，我们证明了在该装置内，能够在保持细胞高存活率的同时，在同一系统中实现三种不同细胞类型的共培养。
该实验方案中的一个关键步骤是在将神经元细胞接种到装置之前，确保细胞达到80%–90%的融合度且具有良好的活力。由于在实验运行过程中无法评估细胞生长情况，因此在将细胞引入模型前，确保其融合度良好且生长状态正常至关重要。尽管这可能是一个限制因素，但在装置内观察到的细胞总体活力和融合度通常较高。
该设备已连接 通过 将管路连接至蠕动泵。每个细胞室均有其专用的管路。管路包括用于蠕动泵灌注培养基的泵管，以及连接泵管与装置的管路和连接装置与流出/废液瓶的管路。装置前后设有取样口，以便接种和采集流出的培养基。每个腔室可连接不同的培养基，从而为每种细胞类型提供最佳培养条件。根据培养基供给的具体需求，可选择打开或关闭每个腔室。在实验过程中，神经元腔室通常保持关闭，而细菌和上皮细胞腔室则始终保持开放，意味着它们在整个实验过程中持续获得新鲜培养基。为确保培养基持续流动，管路、连接件及装置内部不得残留任何气泡。因此，在启动阶段，应先让装置运行数分钟，通常可解决此问题。若仍存在气泡，可暂时关闭其他正在滴液的管路出口三通阀，使培养基重新定向流入含气泡的管路，从而将气泡通过管路排出，消除堵塞。
对于任何细胞培养实验，培养基都是一个关键组分，每种细胞类型都有其相应的培养基。在共培养体系中，培养基不仅需要适合在其中生长的细胞类型，还必须兼容共培养体系中的其他细胞类型。该装置也不例外，它带来了额外的挑战，因为装置内包含三个不同的区室，分别培养着三种不同的细胞类型——细菌、上皮细胞和神经元细胞。然而，我们已经证明，通过改良细菌培养基——在含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基中添加5% MRS——可在系统内成功实现所有细胞类型（尤其是细菌和上皮细胞）的共培养。在该装置中，不同细胞类型虽处于邻近位置共培养，但彼此之间并不直接接触。尽管这并不能完全模拟人体肠道中细胞间的直接接触，因而构成一种局限性，但这种邻近且具有代表性的共培养条件有利于后续分析。不同腔室及细胞类型之间可进行可溶性因子的交换，因此细胞仍能相互作用。此外，不同细胞类型可被分别收集和分析，这使我们能够研究健康和/或疾病状态下微生物组对不同细胞类型（包括神经元细胞）的影响，从而获得特定细胞类型的检测结果。另一个局限性在于，实验过程中无法实时观察细胞形态的变化，因为该装置只能在每次实验结束时打开并检查细胞。
据我们所知，neuroHuMiX 是首个包含肠神经元（ENs）的肠芯片模型。这一进展有助于阐明肠道微生物群与肠神经系统之间的相互作用。该模型可用于研究一种细菌、一层上皮细胞以及肠神经元三者之间的相互作用。其设计使我们能够探究不同细胞类型分泌的可溶性因子之间的交换及其相互影响。未来，不仅需要使用诱导多能干细胞（iPSC）来源的肠神经元，还应在装置中引入 iPSC 来源的上皮细胞，从而将该装置发展为个性化模型。重要的是，这种个性化模型可用于测试前益生元、益生元和合生元10,11，并有望开发个性化的筛查和治疗策略17。个性化的 neuroHuMiX 最终可能揭示人类肠道微生物组中被称为“暗物质”的未知成分，以及其在肠-脑轴线上与神经系统的相互作用，为治疗评估和干预开辟新路径。
我们可以得出结论：构建包含肠神经系统在内的肠道芯片对于推进肠道微生物组-神经系统轴相互作用的研究和理解至关重要。NeuroHuMiX 使我们能够研究细菌种类对宿主细胞的影响，并为我们进一步改进模型提供了良好基础，使其在生理相关性方面更具代表性。
披露
P.W. 声明其为专利 PCT/EP2013/056607、PCT/EP2016/062024、PCT/US2017/061602 和 PCT/EP2019/081424 的发明人之一。P.W.、C.S. 和 L.G. 声明其为专利 LU503075 的发明人之一。
致谢
作者谨此感谢 Jared Sterneckert 博士为我们提供了 K7 细胞系的细胞。我们还要感谢亚利桑那大学的长期合作者 Frederic Zenhausern 博士和 Matthew W. Barret，感谢他们在工程学方面的协助。同时，我们感谢 Valentina Galata 博士在设计神经类器官微系统（neuroHuMiX）示意图过程中提供的帮助。本项目获得了欧洲研究理事会（ERC）在欧盟“地平线2020”研究与创新计划下的资助（资助协议编号 863664）。图1 部分使用 Biorender.com 制作。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-巯基乙醇 | Sigma Aldrich | 10712 | |
| 通气导管（长度：1.10，直径：30 mm） | VWR (B.Braun) | BRAU4190050 | |
| 琼脂 | 默克密理博 | 1.01614.1000 | |
| 铝压接 | 格拉斯格ätebau Ochs | 102050 | |
| 抗坏血酸 | Sigma Aldrich | A4544 | |
| B-27 补充剂（不含维生素 A）(50x) | Gibco | 12587-010 | |
| 细菌细胞膜，孔径大小：1 µm | VWR（沃特曼） | 515-2084 | |
| Caco-2 细胞 | DSMZ | ACC169 | |
| 细胞计数仪 & 分析仪 CASY | OMNI Life Science | ||
| CHIR | Axon Mechem BV | CT99021 | |
| I型胶原蛋白，大鼠尾部 | Invitrogen | A1048301 | |
| Corning 6孔透明平底超低吸附培养板 | 康宁 | 3471 | |
| Difco Lactobacilli MRS 肉汤 | BD 生物科学 | 288130 | |
| Discofix 三通旋塞阀 | B. Braun | BRAU40951111 | |
| DMEM/F12，无谷氨酰胺 | 赛默飞世尔科技 | 21331020 | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液，D-PBS | Sigma Aldrich | 14190-169 | |
| Essential 6 培养基 | 赛默飞世尔科技 | A1516401 | |
| Essential 8 培养基 | 赛默飞世尔科技 | A1517001 | |
| 雌性鲁尔锁扣式至鲁尔尖端连接器 | Qosina | 11733 | |
| FGF2 | R&D Systems | 233-FB | |
| 纤连蛋白 | Sigma Aldrich | F1141 | |
| 胎牛血清，FBS | 赛默飞世尔科技 | 10500-064 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| 人细胞膜，孔径：50 nm | Sigma Aldrich（GE Healthcare） | WHA111703 | |
| HuMiX 密封圈 胶原蛋白 | Auer Precision | 216891-003 | |
| HuMiX 密封垫三明治底座 | Auer Precision | 216891-002 | |
| HuMiX 密封垫三明治顶部 | Auer Precision | 216891-001 | |
| 诱导多能干细胞 | 马克斯·普朗克分子生物医学研究所 | K7 细胞系 | |
| L-谷氨酰胺（200 mM） | Gibco | 25030081 | |
| Engelbreth-Holmswarm 来源的层粘连蛋白 | Sigma Aldrich | L2020 | |
| LDN193189 | Sigma Aldrich | SML0559 | |
| Limosilactobacillus reuteri | ATCC | 23272 | |
| 活/死 BacLight 细菌活力检测试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | L7012 | |
| 带旋转锁的雄性鲁尔接头转接至倒钩 | Qosina | 11735 | |
| Marprene 管道（0.8 mm × 1.6 mm） | Watson-Marlow | 902.0008.J16 | |
| 基质胶 hESC-认证级基质 | 康宁 | 354277 | |
| 来自猪胃的黏蛋白 | Sigma Aldrich | T3924 | |
| N2 补充剂（100 倍） | Gibco | 17502048 | |
| 非必需氨基酸（NEAA） | 赛默飞世尔科技 | 11140050 | |
| 针头（长度：120 mm；直径：0.80 mm） | B.Braun（颜色代码：绿色） | 466 5643 | |
| 针头（长度：40 mm；直径：0.70 mm） | Henke Sass Wolf（颜色代码：黑色） | 4710007040 | |
| 针头（长度：80 mm；直径：0.60 mm） | B.Braun（颜色编码：蓝色） | 466 5635 | |
| Neurobasal 培养基 | Gibco | 21103049 | |
| PE/Cy7 抗人 CD49d 抗体 | Biolegend | 304314 | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma Aldrich | P0781 | |
| 蠕动泵 | Watson-Marlow | 205CA | |
| 聚-L-鸟氨酸氢溴化物 | Sigma Aldrich | P3655 | |
| 聚碳酸酯盖（HuMiX） | 亚利桑那大学 | HuMiX 1.0 / 2.0 | |
| 视黄酸 | Sigma Aldrich | R2625 | |
| RLT缓冲液（RNeasy Minikit） | Qiagen | 74104 | |
| RPMI 1640 培养基 | 赛默飞世尔科技 | 72400-021 | |
| SB431542，ALK抑制剂 | Abcam | ab120163 | |
| 血清瓶 | 格拉斯格ätebau Ochs | 102091 | |
| 注射器 | BD 生物科学 | 309110 | |
| 胰蛋白酶-EDTA 溶液 | Sigma Aldrich | T3924 | |
| Y-27632 二盐酸盐 | R&D Systems | 1254 |
参考文献
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