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红细胞沉降率：医学背景下的物理学驱动表征

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DOI：

10.3791/64502

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2023年3月24日

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1Experimental Physics, Saarland University, 2Department of Physics and Materials Science, University of Luxembourg, 3Theoretical Medicine and Biosciences, Saarland University

本文内容

摘要

红细胞沉降率（ESR）是一种物理参数，常用于常规健康检查和医学诊断。近年来，基于现代胶体科学知识，已开发出一种理论模型，可从完整的沉降曲线中提取具有物理意义的参数。本文介绍了一种自动采集随时间变化的红细胞沉降率数据的实验方案，并从该自动采集的数据中提取此新模型的参数。这些精细化的参数也有望提升其在医学诊断中的价值。

摘要

红细胞（或称红血球）沉降率（ESR）是血液的一种物理衍生参数，常用于常规健康检查和医学诊断。例如，在发生炎症时，由于纤维蛋白原及其他血浆蛋白水平升高，通常会观察到较高的ESR。人们曾认为这种升高是由于纤维蛋白原增加导致红细胞（RBCs）形成更大的聚集体所致。事实上，纤维蛋白原是一种促进红细胞聚集的因子，并且在假设血液中符合斯托克斯定律（Stokes regime）的情况下，较大的聚集体沉降速度更快。然而，所有基于该假设的ESR测量模型都需要引入一些特定的物理假设，而这些假设在其他体系中并不需要。此外，胶体悬浮液领域的现代研究表明，具有吸引力的粒子会形成贯穿整个容器的网状聚集体（即“渗流聚集体”）。这类胶体的沉降过程遵循所谓的"胶体凝胶塌缩"机制。最近的研究已证实，红细胞实际上也表现出相同的行为。该假说还能够以高效且解析的方式对红细胞的沉降曲线进行建模，从而提取出具有稳健性和明确物理意义的描述参数。本文详细描述了如何开展此类分析，并讨论了该方法的优势。

引言

红细胞沉降率（ESR）是一种医学检测指标 体外 临床工具，于二十世纪在循证医学中被正式引入1,2,3,4目前在全球范围内用作非特异性炎症检测指标，或用于监测某些特定疾病的进展5,6,7,8这主要归因于纤维蛋白原浓度的升高，但也与其他血浆成分（如IgM）的增加有关1,9,10,11根据目前的Westergren标准方案，红细胞沉降率（ESR）值报告为：将一支典型长度为20 cm的试管垂直静置后，在特定时间点（30分钟或1小时）所测得的无细胞血浆层高度。12然而，由于沉降过程中存在定性上不同的阶段，包括达到最大沉降速度前存在延迟现象，该测量方法已受到批评13这种延迟在大约一半的健康样本中持续超过1小时14此阶段的速度遵循与第二阶段（较快的沉降阶段）不同的标度关系。15将读数限制为第一小时内的平均沉降速度，即可比较不同个体间多种血液特性的不同组合。

此外，最近的研究表明，该实验方案背后的常规理论考虑存在错误16,17,18。在生理红细胞压积（约高于25%）条件下，红细胞（RBCs）并非以独立的聚集体形式沉降，而是形成一种连续的、所谓的渗透性红细胞网络结构17,18，其行为遵循与通常提及的斯托克斯沉降不同的物理方程16,17。已有研究表明，在某些新的医学背景下，基于时间分辨的沉降全过程曲线进行物理描述的方法更为稳健19,20。此外，这些测量可用于揭示在红细胞形态发生改变的病理状态下影响红细胞沉降率（ESR）的物理机制19,20。缓慢的ESR也可能具有重要的医学意义，这一点已在神经棘红细胞增多症患者队列的研究中得到体现19,20。本文综述了如何在实践中基于完整的ESR动力学曲线，测量具有明确物理意义的参数。更准确地说，本文所介绍的方法可提取最大沉降速度Um，其数值可进一步校正以考虑供体红细胞压积的影响16,17。该参数比传统测量方法更准确，因而也更可靠16,17,19,20。

此外，在某些基础研究中，与其监测特定患者的炎症状态，不如排除红细胞压积（hematocrit）对红细胞沉降率（ESR）21,22,23的影响，或研究不同供体之间经改良的ESR中红细胞（RBCs）所起的作用19,20,24,25。此时，比较并非直接来源于患者全血的样本可能更具意义。因此，将红细胞以可控的红细胞压积重新悬浮于自体血浆或血浆替代物中，可作为ESR测定的第一步。例如，在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制浓度为55 mg/mL的70 kDa右旋糖酐溶液，可使健康细胞的沉降速率处于正常对照范围内19。本文还阐述了如何实施这些操作步骤，并表明所介绍的分析方法在这些情况下同样适用。

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方案

血液样本采集和实验已获得萨尔州医学协会（“Ärztekammer des Saarlandes”）的伦理批准（伦理批件号：51/18），并依据《赫尔辛基宣言》在取得知情同意后进行。标准检测应使用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝全血（EDTA标准浓度为每毫升血液1.6 mg，符合欧洲标准NF EN ISO 6710），置于魏氏管中进行。所需填充魏氏管的血量依制造商而异（因部分管体下部可能具有较宽的储液腔）；通常所需全血量约为1 mL，而本文材料表中所列的试管则需800 µL。然而，下述方法在任何特定悬浮液和容器形状下均适用，前提是待测样本的红细胞压积高于25%16。因此，具体研究中的样本体积、容器、悬浮介质及添加剂应根据研究目的进行选择。

1. 实验与测量

注意：每分钟记录一次样品的沉降速率。

  1. 样品制备（如需要）：如果需要对照血细胞比容或悬浮液，首先洗涤细胞并制备样品（例如，我们展示通过混合自体血清和血浆来制备不同纤维蛋白原浓度样品的方法）。血清可近似视为无纤维蛋白原的血浆26,27，可在生理条件下用于减少红细胞（RBCs）的聚集。为制备多个样本，需将血液收集至标准的9 mL EDTA抗凝管中，血清则收集至标准的9 mL血清管（含硅胶颗粒作为凝血活化剂）中。
    1. 将血液样本（例如，所选示例中的9 mL标准EDTA抗凝管和血清管）在3,000 x g 至少7分钟，以实现红细胞的最佳压紧效果。若有足量试剂，可用PBS或所需的悬浮液替换上清液。若仅需在自体血浆中调节血细胞比容，则直接进入步骤1.1.3。否则，在加入上清液后轻轻混匀以进行洗涤。
    2. 重复三次。最后一次洗涤必须使用所需的悬浮液进行。
      1. 在选定的示例中，制备自体血浆与血清按确定比例混合的样本（例如，血浆/血清体积分数为25%/75%、50%/50%或75%/25%）。例如，配制2.5 mL的25%/75%血浆-血清混合液时，将0.625 mL血浆加入1.875 mL血清中。
    3. 吸取所需体积的压紧细胞，并将其悬浮于目标液体中。将压紧细胞视为高黏性液体进行操作（采用标准预润洗吸液和/或反向移液法，或使用正置换移液器）。28在选定的示例中，对于4 mL、红细胞压积为45%的样本，将1.8 mL压积细胞悬浮于2.2 mL血浆-血清混合液中。
  2. 如果样本的血细胞比容未加控制，则通过高速微量离心法测定（其他标准方法也可适用）。
    1. 吸取测定血细胞比容所需的样本量：将微量血细胞比容毛细管的下端浸入液体中，利用毛细作用使样本上升至管内。当样本上升至所需体积时，封闭管口上端以停止吸取。
    2. 用封蜡密封毛细管，将其放入微型血细胞比容离心机中，以15,000 x g（12,000 rpm）离心5分钟，或按照试剂盒说明书操作。
    3. 在毛细管上读取血细胞比容水平，并记录以供参考。
  3. 设置摄像机以记录样品的沉降过程。为避免内存过载或电池耗尽，应将设备连接至电源供电，并将图像直接保存至计算机或外接硬盘。
    1. 在放置血沉管的支架前方架设一台固定的摄像机。使用白色且均匀照明的背景（背景放置白纸效果极佳）。
    2. 使用无刻度的空韦氏血沉管，将相机的焦距和视野调整至样品放置区域达到最高分辨率。建议确保图像的边界在垂直和水平方向上对齐。
    3. 拍摄带有刻度的试管图像以提取像素分辨率。建议使用RGB图像。
    4. 将光源和相机曝光时间设置为呈现白色背景，但无过曝。示例见下图 图1 已使用佳能 EOS M50 拍摄，曝光时间为 1/15 秒，光圈为 F8.0，白平衡为钨丝灯，单次拍摄模式，手动对焦，ISO 感光度为 1,000。
  4. 准备并放置血沉管。
    1. 根据制造商说明书，向魏氏管的下部容器中加入相应体积的液体。按照制造商的指示，将魏氏管插入下部容器中。
    2. 第一个试管准备好后，立即将其放入支架中并开始摄像记录。通常每分钟记录一张图像，可获得良好的红细胞沉降率（ESR）动力学曲线分辨率。
    3. 准备并放置下一个样品。拍摄照片时，切勿站在任何样品前方。
    4. 让测量持续至少 2 小时，以便与 30 分钟、1 小时和 2 小时的标准测量结果进行比较。然而，观察沉降过程的饱和与停止更为理想。对于健康样本或炎症情况，记录样本过夜，即 12 至 24 小时之间，已完全足够，因为最快样本的曲线在 3 小时内即可显现。13,19然而，如果某种条件降低了沉降速度（例如纤维蛋白原浓度降低，即在所选示例中的高血清体积分数），则可能需要持续50小时或更长时间的记录，才能获得最准确的信息16,19.

2. 图像分析

注意：图像记录完成后，提取ESR曲线。Matlab代码示例如补充文件1（MatlabCodeImageAnalysisSampled.m）所示。

  1. 选择或确定一个感兴趣区域（ROI），该区域内仅可见一根管子，其下边界位于红细胞-无细胞血浆界面的最低位置之下，但仍处于样品范围内（参见图1A、B）。如有需要，可旋转图像，使垂直方向与图像的第一个主方向对齐。
  2. 将RGB图像的ROI转换为灰度图像或矩阵Gr。通常，将三个颜色通道（红[R]、绿[G]和蓝[B]）按Gr = 2 * R - B - G组合，在背景清晰的情况下效果良好（参见图1C及MatlabCodeImageAnalysisSampled.m第121–128行）。
  3. 对图像进行二值化处理。对于健康样本，通常采用Otsu阈值法29可获得一致结果（参见图1D及MatlabCodeImageAnalysisSampled.m第133行）。对于高血细胞比容或存在溶血的样本，根据管内各相之间获得的具体对比度，手动调整阈值或采用其他自动方法（如MatlabCodeImageAnalysisSampled.m第129–131行所示）可能更为合适。
  4. 沿水平方向对Gr的像素（或元素）值取平均。此步骤可有效降低噪声，并平均可能存在的界面不规则性（参见图1E及MatlabCodeImageAnalysisSampled.m第137行）。
  5. 在计算变化之前，使用移动平均法对曲线进行平滑处理，特别是当管壁带有水平刻度标记时（参见图1F）。在所提供的示例中，该过程采用约2.5 mm（50像素）的移动窗口（参见MatlabCodeImageAnalysisSampled.m第138行）。随后，将强度变化最大的点识别为界面位置（参见图1G）。
  6. 对每张图像和每个样本重复上述步骤。针对每个样本，以适当格式保存随时间变化的界面位置数据，以便使用合适的拟合软件与物理模型进行拟合。

3. 物理模型的拟合

  1. 使用任何合适的拟合软件，根据已知的血细胞比容和血液柱初始高度 h0，求出使物理模型残差平方和最小的延迟时间 t0、无量纲时间 γ 以及红细胞最终堆积体积分数 Φm 的值17。作为此类拟合方法的示例，提供了一个 MATLAB 代码（ShapeAnalyzerIntegrated.m），详见补充文件 2。进一步操作说明请参见补充文件 2。如其他文献所述16,17，在生理血细胞比容下，红细胞以软颗粒凝胶的形式沉降，其中关键的物理参数包括供体血浆与红细胞之间的密度差 Δρ、红细胞特征直径 rRBC、室温下血浆黏度 η 以及供体的血细胞比容 Φ。利用这些参数，并假设重力应力是延迟时间 t0 后血浆向上流过红细胞形成多孔网络的主要驱动力，可得到如下时间演化方程16,17：
    数学函数 \( h(t) \) 方程；探讨动态系统行为；科学分析。
    其中 含对数和多项式表达式的数学函数公式；方程分析。，流体动力学方程，G=Δρgr²/(ηϕh₀)，与流体力学原理相关。，以及 静态平衡公式，r²_RBC≈4μm；方程。 为红细胞的平均圆盘半径。附带提供的一个 MATLAB 代码示例（ShapeAnalyzerIntegrated.m）可执行此拟合（该代码拟合 SedimFit.m 中定义的函数，见补充文件 3）。或者，也可直接将 G/γ 作为具有 1/t 单位的拟合参数使用。
  2. 从图像中提取定量曲线后，保存样品的物理参数。仍可从该曲线上提取传统红细胞沉降率在 30 分钟、1 小时或 2 小时的数值以供参考（参见 ShapeAnalyzerIntegrated.m 第 123–132 行）。

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结果

正确采集的图像序列示例如下所示 补充视频 1 （MovieS1.avi）。在不同条件下，模型的一系列特征性拟合结果如图所示。 图2纤维蛋白原浓度根据血浆中的纤维蛋白原浓度确定 纤维0，假设血清中完全不含纤维蛋白原。因此， 纤维 = C纤维0，其中 C 是血浆-血清混合物中的血浆体积分数。在以往的研究中16, 纤维0 由德国萨尔兰大学医院（Homburg，德国）临床化学实验室采用标准方法测定。若需独立测量该指标，一种便捷的纤维蛋白原浓度测定方法包括使用（半）自动滚球法凝固仪，该方法可能还需从供体采集枸橼酸盐抗凝血样30这些研究产生的ESR曲线可用皮尔逊系数进行拟合。 R2

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讨论

为了使自动化方案高效运行，必须确保背景清晰且照明适当。过暗的背景可能导致无法获得有效的二值化阈值。对于存在一定程度溶血的样本（通常随时间推移而加重），重要的是首先验证所选的二值化阈值是否适用于初始和最终图像。

在图像二值化过程中，选择感兴趣区域（ROI）和二值化阈值是最为敏感的步骤。建议手动测试三张不同图像（分别对应沉降过程的开始、中间和结束阶段）上的多个阈值，以确保所选阈值在整个过程中均能提供有效的二值化结果。如果样品出现明显的溶血现象，可能需要将分析限制在过程初期，此时仍可观察到清晰的界面。与所有血沉（ESR）测量一样，必须避免管内存在气泡。然而，若在管子顶部观察到少量小气泡，仍可通过将ROI设置在气泡下方、紧邻初始界面的上方来获得有效测量。但在此情况下，重要的是在管子左右两侧保留一定背景区域，以便在确定Otsu阈值时始终包含足够数量的、具有背景灰度水平的像素。

该方法与所有ESR测定一样，依赖于能够观察到红细胞压积与无细胞血浆之间清晰界面的假设。如果样本发生明显溶血，或者样本的血细胞比容被过度稀释（低于25%

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披露

作者声明本文内容不存在相关利益冲突。

致谢

本工作得到了德国研究基金会研究单位FOR 2688 - Wa1336/12项目以及玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里基金协议No. 860436-EVIDENCE的资助。T. J. 和 C. W. 感谢法德大学（DFH/UFA）提供的经费支持。A. D. 感谢萨尔兰大学青年研究者基金的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗凝管（EDTA 或肝素）（用于血液样本）SARSTEDT267001 或 265用于表征的抗凝血液样本
EOS M50 相机CanonKit EF-M18-150 IS STM任何相机均可使用，前提是具备电源供应、可连接计算机实现自动拍摄，并配备合适的镜头
离心机HERMLE302.00 V03 - Z 36 HK要求：至少 3000 × g 离心 7 分钟
微量离心机MLWTH21或其他可用于测定红细胞压积的方法
微量红细胞压积毛细管Fisher scientific11884040或其他可用于红细胞压积测定的毛细管/容器
磷酸盐缓冲液（PBS）ThermoFisher100100231× PBS，pH 7.4，298 Osm
移液器（例如正置换移液器）GilsonFD10006用于操作血液和/或浓缩细胞的移液器。其他型号当然也可使用，但需注意将血液和浓缩细胞视为高黏性液体进行处理
封蜡板Hirschmann9120101用于密封微量红细胞压积毛细管的封蜡
魏氏管（Westergren 管）PraxindoA9244560其他标准的魏氏管也可使用
带照明的白色背景//在样本后方放置白色纸张，配合普通室内光线即完全足够

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