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方法文章

红细胞沉降率：医学背景下的物理学驱动表征

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DOI：

10.3791/64502

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2023年3月24日

 ,  ,  , 
1Experimental Physics, Saarland University, 2Department of Physics and Materials Science, University of Luxembourg, 3Theoretical Medicine and Biosciences, Saarland University

本文内容

摘要

红细胞沉降率（ESR）是一种物理参数，常用于常规健康检查和医学诊断。近年来，基于现代胶体科学知识，已开发出一种理论模型，可从完整的沉降曲线中提取具有物理意义的参数。本文介绍了一种自动采集随时间变化的红细胞沉降率数据的实验方案，并从该自动采集的数据中提取此新模型的参数。这些精细化的参数也有望提升其在医学诊断中的价值。

摘要

红细胞（或称红血球）沉降率（ESR）是血液的一种物理衍生参数，常用于常规健康检查和医学诊断。例如，在发生炎症时，由于纤维蛋白原及其他血浆蛋白水平升高，通常会观察到较高的ESR。人们曾认为这种升高是由于纤维蛋白原增加导致红细胞（RBCs）形成更大的聚集体所致。事实上，纤维蛋白原是一种促进红细胞聚集的因子，并且在假设血液中符合斯托克斯定律（Stokes regime）的情况下，较大的聚集体沉降速度更快。然而，所有基于该假设的ESR测量模型都需要引入一些特定的物理假设，而这些假设在其他体系中并不需要。此外，胶体悬浮液领域的现代研究表明，具有吸引力的粒子会形成贯穿整个容器的网状聚集体（即“渗流聚集体”）。这类胶体的沉降过程遵循所谓的"胶体凝胶塌缩"机制。最近的研究已证实，红细胞实际上也表现出相同的行为。该假说还能够以高效且解析的方式对红细胞的沉降曲线进行建模，从而提取出具有稳健性和明确物理意义的描述参数。本文详细描述了如何开展此类分析，并讨论了该方法的优势。

引言

红细胞沉降率（ESR）是一种医学检测指标 体外 临床工具，于二十世纪在循证医学中被正式引入1,2,3,4目前在全球范围内用作非特异性炎症检测指标，或用于监测某些特定疾病的进展5,6,7,8这主要归因于纤维蛋白原浓度的升高，但也与其他血浆成分（如IgM）的增加有关1,9,10,11根据目前的Westergren标准方案，红细胞沉降率（ESR）值报告为：将一支典型长度为20 cm的试管垂直静置后，在特定时间点（30分钟或1小时）所测得的无细胞血浆层高度。12然而，由于沉降过程中存在定性上不同的阶段，包括达到最大沉降速度前存在延迟现象，该测量方法已受到批评13这种延迟在大约一半的健康样本中持续超过1小时14此阶段的速度遵循与第二阶段（较快的沉降阶段）不同的标度关系。15将读数限制为第一小时内的平均沉降速度，即可比较不同个体间多种血液特性的不同组合。

此外，最近的研究表明，该实验方案背后的常规理论考虑存在错误16,17,18。在生理红细胞压积（约高于25%）条件下，红细胞（RBCs）并非以独立的聚集体形式沉降，而是形成一种连续的、所谓的渗透性红细胞网络结构17,18，其行为遵循与通常提及的斯托克斯沉降不同的物理方程16,17。已有研究表明，在某些新的医学背景下，基于时间分辨的沉降全过程曲线进行物理描述的方法更为稳健19,20。此外，这些测量可用于揭示在红细胞形态发生改变的病理状态下影响红细胞沉降率（ESR）的物理机制19,20。缓慢的ESR也可能具有重要的医学意义，这一点已在神经棘红细胞增多症患者队列的研究中得到体现19,20。本文综述了如何在实践中基于完整的ESR动力学曲线，测量具有明确物理意义的参数。更准确地说，本文所介绍的方法可提取最大沉降速度Um，其数值可进一步校正以考虑供体红细胞压积的影响16,17。该参数比传统测量方法更准确，因而也更可靠16,17,19,20。

此外，在某些基础研究中，与其监测特定患者的炎症状态，不如排除红细胞压积（hematocrit）对红细胞沉降率（ESR）21,22,23的影响，或研究不同供体之间经改良的ESR中红细胞（RBCs）所起的作用19,20,24,25。此时，比较并非直接来源于患者全血的样本可能更具意义。因此，将红细胞以可控的红细胞压积重新悬浮于自体血浆或血浆替代物中，可作为ESR测定的第一步。例如，在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制浓度为55 mg/mL的70 kDa右旋糖酐溶液，可使健康细胞的沉降速率处于正常对照范围内19。本文还阐述了如何实施这些操作步骤，并表明所介绍的分析方法在这些情况下同样适用。

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方案

血样采集和实验已获得德国萨尔州医学协会（"Ärztekammer des Saarlandes"）的批准（伦理批件号：51/18），并依据《赫尔辛基宣言》在受试者签署知情同意书后进行。标准测量应使用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝全血（EDTA标准浓度为1.6 mg/mL血液，符合欧洲标准NF EN ISO 6710）并在魏氏血沉管（Westergren管）中进行。所需填充魏氏管的血量取决于制造商（因部分产品下部储液腔较宽）；通常全血量约为1 mL，而本文材料表中所列的血沉管则需800 µL。然而，下述方法对任何特定悬浮液和容器形状均适用，前提是待测样本的红细胞压积高于25%16。因此，应根据具体研究目的选择合适的体积、容器、悬浮介质及添加剂。

1. 实验与测量

注意：每分钟记录一次样品的沉降速率。

  1. 样本制备（如需要）：若需使用对照红细胞压积或悬浮液，首先洗涤细胞并制备样本（例如，我们展示如何通过混合自体血清与血浆来制备不同纤维蛋白原浓度的样本）。在生理条件下，血清可近似视为无纤维蛋白原的血浆26,27，可用于降低红细胞聚集。为制备多个样本，将血液收集于9 mL标准EDTA管中，血清收集于9 mL标准血清管中（含硅石珠作为凝血激活剂）。
    1. 将血液样本（即所选示例中的9 mL标准EDTA管和血清管）在3,000 x g条件下离心至少7分钟，以实现红细胞充分压紧。如有足够量，用PBS或所需悬浮液替换上清液。若仅需在自体血浆中调控红细胞压积，则直接进入步骤1.1.3。否则，在加入上清液后轻轻混匀以进行洗涤。
    2. 重复三次。最后一次洗涤必须使用所需的悬浮液。
      1. 在所选示例中，制备特定比例的自体血浆与血清混合液（例如，血浆-血清体积分数为25%/75%、50%/50%或75%/25%）。例如，制备2.5 mL的25%/75%血浆-血清混合液时，将0.625 mL血浆加入1.875 mL血清中。
    3. 吸取所需体积的压紧细胞，并将其悬浮于目标液体中。将压紧细胞作为高黏度液体处理（使用标准预吸液和/或反向移液或正置换移液器28）。在所选示例中，为制备4 mL、红细胞压积为45%的样本，将1.8 mL压紧细胞悬浮于2.2 mL血浆-血清混合液中。
  2. 若样本的红细胞压积未受控，则通过高速微量离心法测定（其他标准方法亦适用）。
    1. 取适量样本用于测定红细胞压积：将微量红细胞压积毛细管下端浸入液体中，利用毛细作用使样本上升至所需体积后，封住管口停止吸入。
    2. 用封蜡密封毛细管。将其放入微量红细胞压积离心机中，在15,000 x g（12,000 rpm）下离心5分钟，或按照制造商说明操作。
    3. 读取毛细管上的红细胞压积水平并记录以供参考。
  3. 设置相机以记录样本沉降过程。为避免内存溢出或电池耗尽，应将设备连接电源，并将图像直接保存至计算机或外接硬盘。
    1. 在放置ESR管的支架前方架设稳定的相机。使用白色、照明良好的背景（背景中放置白纸效果极佳）。
    2. 使用无刻度的空Westergren管，调整相机的焦距和视野，使样本放置区域获得最高分辨率。建议确保图像边界在垂直和水平方向对齐。
    3. 拍摄带有标尺的试管图像，以提取像素分辨率。推荐使用RGB图像。
    4. 调节相机的光照和曝光时间，使背景呈白色但无过曝。图 1 所示示例使用佳能EOS M50相机，曝光时间为1/15秒，光圈F8.0，钨丝灯白平衡，单次拍摄模式，手动对焦，ISO感光度为1,000。
  4. 准备并放置ESR管。
    1. 根据制造商说明，向Westergren管的底部容器中加入相应体积的液体。按制造商指示将Westergren管插入底部容器中。
    2. 一旦第一根管准备就绪，立即将其放入支架并开始相机记录。通常每分钟拍摄一张图像即可获得良好的ESR动力学曲线分辨率。
    3. 准备并放置后续样本。确保在拍摄图像时不要遮挡任何样本。
    4. 让测量持续至少2小时，以便与标准30分钟、1小时和2小时的测量结果进行比较。但观察沉降的饱和与停止过程更有意义。对于健康样本或炎症情况，过夜记录样本12至24小时已足够充分，因为最快样本的曲线变化在3小时内即可显现13,19。然而，若某种条件导致沉降速度降低（例如纤维蛋白原浓度下降，即所选示例中高血清体积分数），可能需要50小时或更长时间的记录才能获得最准确的信息16,19。

2. 图像分析

注意：图像记录完成后，提取电子自旋共振（ESR）曲线。Matlab 代码示例如下：补充文件 1（MatlabCodeImageAnalysisSampled.m）。

  1. 选择或确定一个感兴趣区域（ROI），该区域内仅显示一根试管，其下边界位于红细胞-无细胞血浆界面的最低位置之下，但仍处于样本范围内（参见图1A、B）。如有需要，可旋转图像，使垂直方向与图像的第一个主方向对齐。
  2. 将RGB图像的ROI转换为灰度图像或矩阵Gr。通常，将三个颜色通道（红[R]、绿[G]和蓝[B]）按公式Gr = 2 * R - B - G组合，在背景清晰的情况下效果良好（参见图1C及MatlabCodeImageAnalysisSampled.m第121–128行）。
  3. 对图像进行二值化处理。对于健康样本，通常采用Otsu阈值法29可获得一致结果（参见图1D及MatlabCodeImageAnalysisSampled.m第133行）。对于高血细胞比容或存在溶血的样本，根据管内各相之间实际获得的对比度，手动调整阈值或采用其他自动方法可能更为合适（如MatlabCodeImageAnalysisSampled.m第129–131行所示）。
  4. 沿水平方向对Gr的像素（或元素）值取平均。此步骤可有效降低噪声，并平均可能存在的界面不规则性（参见图1E及MatlabCodeImageAnalysisSampled.m第137行）。
  5. 在计算变化之前，使用移动平均法对曲线进行平滑处理，特别是当试管上存在某些横向标记时（参见图1F）。在所提供的示例中，该过程采用约2.5 mm（50像素）的移动窗口（参见MatlabCodeImageAnalysisSampled.m第138行）。随后，将强度变化最大的点确定为界面位置（参见图1G）。
  6. 对每张图像和每个样本重复上述步骤。针对每个样本，以适当格式保存界面位置随时间的变化数据，以便使用合适的拟合软件与物理模型进行拟合。

3. 物理模型的拟合

  1. 使用任何合适的拟合软件，根据已知的血细胞比容和血液柱初始高度 h0，求出使物理模型残差平方和最小的延迟时间 t0、无量纲时间 γ 以及红细胞最终堆积体积分数 Φm 的值17。提供了一个 MATLAB 代码（ShapeAnalyzerIntegrated.m）作为 补充文件 2，以示例如何进行此类拟合。进一步的操作说明见 补充文件 2。如其他文献所述16，17，生理血细胞比容下的红细胞沉降行为类似于软颗粒凝胶，其中关键的物理参数包括供体血浆与红细胞之间的密度差 Δρ、红细胞特征直径 rRBC、室温下血浆的黏度 η 以及供体的血细胞比容 Φ。利用这些参数，并假设在延迟时间 t0 后，重力应力是推动血浆通过红细胞形成的多孔网络向上流动的主要驱动力，可得到如下时间演化方程16，17：
    分段函数概念示意图；包含物理变量、示意图。
    其中 f(x) 的数学公式；对数方程分析；面向研究。，流体动力学方程，G=Δρgr²RBC/(ηϕh₀)，适用于黏度计算。，以及 静态平衡方程 \( r^2_{RBC} \approx 4 \, \mu \text{m} \)，适用于物理示意图。 为红细胞的平均圆盘半径。附带提供了一个执行该拟合的 MATLAB 代码示例（ShapeAnalyzerIntegrated.m 拟合由 SedimFit.m 定义的函数 [补充文件 3]）。或者，也可直接将 G/γ 作为具有 1/t 单位的拟合参数使用。
  2. 从图像中提取定量曲线后，保存样品的物理参数。仍可从该曲线上提取 30 分钟、1 小时或 2 小时的传统红细胞沉降率（ESR）值作为参考（参见 ShapeAnalyzerIntegrated.m 第 123–132 行）。

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结果

正确采集的图像序列示例如下所示 补充视频 1 (视频S1.avi)。在不同条件下展示了模型的一系列典型拟合结果 图2纤维蛋白原浓度根据血浆中的纤维蛋白原浓度确定 纤维0，假设血清中完全不含纤维蛋白原。因此， 纤维 = C纤维0，其中 C 是血浆-血清混合物中的血浆体积分数。在以往的研究中16, 纤维0 由德国萨尔兰大学医院（Homburg，德国）临床化学实验室采用标准方法测定。若需独立测量该指标，一种便捷的纤维蛋白原浓度测定方法包括使用（半）自动滚球法凝固仪，该方法可能还需从供体采集枸橼酸盐抗凝的血液样本30. 来自生成这些曲线的研究中的ESR曲线可用Pearson系数进行拟合 R2

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讨论

为了使自动化方案高效运行，获得清晰的背景和适当的照明非常重要。过暗的背景可能导致无法设定有效的二值化阈值。对于出现一定程度溶血的样本（这种情况通常随时间推移而加重），必须首先确认所选的二值化阈值对初始和最终图像均适用。

在图像二值化过程中，选择感兴趣区域（ROI）和二值化阈值是最为敏感的步骤。建议手动测试三张不同图像（分别对应沉降过程的开始、中间和结束阶段）上的多个阈值，以确保所选阈值在整个过程中均能提供有效的二值化结果。如果样品出现明显的溶血现象，可能需要将分析限制在过程初期，此时仍可观察到清晰的界面。与所有血沉（ESR）测量一样，必须避免试管中存在气泡。然而，若在试管顶部观察到少量小气泡，仍可通过将ROI设置在气泡下方且紧邻初始界面的上方来获得有效测量。但在此情况下，重要的是在试管左右两侧保留一定背景区域，以便在确定Otsu阈值时始终包含足够数量的、具有背景灰度水平的像素。

该方法与所有红细胞沉降率（ESR）测定一样，依赖于能够观察到红细胞压积层与无细胞血浆层之间清晰界面的假设。如果样本发生明显溶血，或样本的血细胞比容过低...

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披露

作者声明本文内容不存在相关利益冲突。

致谢

本工作得到了德国研究基金会研究单位FOR 2688 - Wa1336/12项目以及玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里基金协议No. 860436-EVIDENCE的资助。T. J. 和 C. W. 感谢法德大学（DFH/UFA）提供的经费支持。A. D. 感谢萨尔兰大学青年研究者基金的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗凝管（EDTA 或肝素）（用于血液样本）SARSTEDT267001 或 265用于表征的抗凝血液样本
EOS M50 相机CanonKit EF-M18-150 IS STM任何相机均可使用，前提是具备电源供应、可连接计算机实现自动拍摄，并配备合适的镜头
离心机HERMLE302.00 V03 - Z 36 HK要求：至少 3000 × g 离心 7 分钟
微量离心机MLWTH21或其他可用于测定红细胞压积的方法
微量红细胞压积毛细管Fisher scientific11884040或其他可用于红细胞压积测定的毛细管/容器
磷酸盐缓冲液（PBS）ThermoFisher100100231× PBS，pH 7.4，298 Osm
移液器（例如正置换移液器）GilsonFD10006用于操作血液和/或浓缩细胞的移液器。其他型号当然也可使用，但需注意将血液和浓缩细胞视为高黏性液体进行处理
封蜡板Hirschmann9120101用于密封微量红细胞压积毛细管的封蜡
魏氏管（Westergren 管）PraxindoA9244560其他标准的魏氏管也可使用
带照明的白色背景//在样本后方放置白色纸张，配合普通室内光线即完全足够

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