本文介绍了用于评估新热带蛙类物种生物标志物的标准化生态毒理学方法。具体而言，本文详细阐述了在不同尺度上的多种生态毒理学评价方法，包括基因水平、细胞-组织学水平、生物化学水平、形态学水平以及个体水平。
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本文内容
摘要
摘要
生态毒理学中的新问题凸显了应用一系列生物标志物的重要性，因为这不仅能改进对环境胁迫因子对生物体影响的解释，还能提高对其潜在影响进行判定的能力。众所周知，在不同组织水平上使用生态毒理学生物标志物，可预测生物体对环境胁迫因子的生物学响应，这在环境风险评估中具有重要价值。
然而，有必要优化基本实验流程，建立对照组的历史数据，并采用特定的生物测定方法来评估器官和组织的反应，以阐明所观察效应的本质及其变异性。因此，本研究旨在描述在不同生态水平下应用于新热带无尾两栖类各个生活阶段的一系列生态毒理学方法，并验证这些方法作为生物标志物在野外和实验室条件下的适用性。在本研究中，这些生物标志物被应用于个体/有机体水平（体况指数）、组织学/生理学水平（组织病理学、组织形态测量学和色素分析）、生化水平（氧化应激相关酶）以及遗传水平（通过彗星实验检测DNA的直接损伤和氧化损伤）。
尽管这些方法因物种不同而存在细微差异或修改，但这些技术为评估外源性物质对无尾目动物的影响提供了有效的生物标志物。无尾目动物具有一些特定特征，使其成为水生和陆地生态系统的有用指示物种。总之，本研究中采用的一组生物标志物已被证明适用于评估新热带区无尾目动物的毒性反应，可进一步推荐作为生物指示物，用于识别污染物对区域水生生态系统的不利影响。最后，建议在特定区域内实现这些重要生物标志物的标准化，并可考虑将其纳入风险评估和决策过程之中。
引言
环境胁迫因子进入天然水体可能影响水生生态系统的健康1。这些环境胁迫因子可通过不同的毒性机制影响水生生物的存活或适应性，包括短期和长期的直接暴露2。因此，基于实验室的标准生物测定法评估与适应性和存活相关的毒理学终点，可能无法可靠地反映野外环境中胁迫所导致的多种间接效应。此外，生理水平的正常变化以及对个体的影响（例如捕食能力的变化）可能是评估生物体存活和繁殖适应性的更佳长期指标，并最终反映生态系统健康的状况1,3。基于已知的一组环境参数和污染物浓度，预测生态系统组成与功能以及生物体健康状况的变化，对于改进污染管理具有重要意义1。
生物标志物是指由于暴露于异源化学物质或受其影响而产生的生化、生理或组织学上的变化4,5。生物标志物已被证明可作为有效的早期预警信号4,5。生物标志物有助于回答的一个重要问题是：环境中某些应激因子的浓度是否已达到足以引发有害效应的水平。这些信息有助于评估是否值得进一步....
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方案
以下技术涉及先前的动物牺牲操作，该操作是根据国际伦理标准46,47,48进行的，并包括后续的器官解剖与切除。动物捕获是在圣路易斯省环境、农业和生产部（第49-PMA2019号决议）授权下完成的。动物牺牲与安乐死的方法已获得圣路易斯国立大学机构动物护理与使用委员会（CICUA，协议编号 Q-322/19）批准的协议认可。对无尾目生物的操作均依照Garber等人46、CONICET47和INTA48中详述的指南进行。此外，本文所列所有方案均适用于新热带地区的无尾目物种，涵盖其幼体和成体生命阶段；这些方法已被当地研究人员广泛接受，并在各参与大学的"机构动物护理与使用委员会（CICUA）"严格协议及授权下实施。所用材料与溶液清单见材料表和表1。
1. 个体水平：体况及肝脏和性腺指数
- 体型状况指数：标准化质量指数
注意：该指数可用于成体、幼体及幼虫。本方法基于 Peig 和 Green
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结果
本文介绍的所有生物标志物检测技术均为简单、快速、便捷、灵敏、低成本且准确的方法。对于每种生物标志物，需注意以下事项。
个体水平
标准化质量指数
在毫米尺度上拍摄照片非常重要，因为该数值将用于校准软件，从而在测量SVL变量时相比游标卡尺测量获得更高的客观性。此外，在实验室或野外研究中，个体处理过程中的采样时间往往至关重要，而使用照片进行后续分析可节省处理时间。为了进行标准化质量指数的分析，需进行非线性回归分析，以揭示SVL与体重之间的幂函数关系，进而确定缩放指数（b）（图2）。标准化质量指数适用于比较同一物种的成年或幼年群体。
标准化肝脏指数
标准化肝脏指数（SLI）反映了肝脏质量相对于标准体长（SVL）的相对大小。尽管该指数可用于成体个体和幼体，但由于幼体体型较小，对成体无尾目动物进行SLI研究更为方便。该参数的改变可能提示在较低水平（如组织学.......
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讨论
个体水平的生物标志物非常易于测定且成本低廉，因为检测这些生物标志物仅需少量设备，而这些设备通常在任何科研实验室中都具备。此外，这些生物标志物可提供有关动物健康状况和适应性的总体信息。每个实验方案中所使用的动物数量对于获得可靠结果至关重要。由于数据存在变异性，每种处理组至少需要五只动物（N = 5）。具体而言，个体水平生物标志物测定中的一个关键步骤是测量SVL以计算体况指数，因为相机拍摄角度的变化可能导致SVL测量值的偏差。必须确保同一研究中所有个体的图像均以相同的方式拍摄，即采用相同的拍摄角度和相同的物距。然而，出于节省时间的考虑，通过图像分析法测量SVL优于使用卡尺进行测量。因此，采用这种图像分析方法将有可能增加被研究动物的数量，从而获得更稳健和可靠的结果。
肝体指数可用于比较同一物种的成体、幼体甚至幼虫群体，由于肝脏是主要的解毒器官，该指数的显著变化可能提示组织学和生物化学水平的改变。性腺指数适用于比较同一物种的成年无尾目动物群体，由于卵巢与睾丸在尺度上存在差异，雌性和雄性必须分别进行比较。该指数的显著变化可能提示性腺发生过程的改变，进而影响生物体的繁殖能力。
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
作者谨此致谢圣路易斯化学研究所（Instituto de Química de San Luis） "Dr. Roberto Olsina"- 感谢国家科学技术研究委员会（INQUISAL-CONICET）、圣路易斯国立大学（项目PROICO 2-1914）、南马托格罗索联邦大学生物科学研究所实验病理学实验室（LAPEx-INBIO-UFMS）、拉普拉塔国立大学细胞学讲席、国家科学促进署（FONCYT；PICT-2018-02570 和 PICT-2018-01067）提供的经费支持。我们还要感谢圣路易斯国立大学科学写作协助中心（GAECI-UNSL）以及母语为英语的Lidia Unger对稿件进行的校对工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 分析级 | |||
| 电泳电源 | 耐力 | E0203-250V | |
| 伊红 | 默克 | ||
| 荧光显微镜 | 奥林巴斯 | BX50 | 配备合适的滤光片组合 |
| 哈里斯苏木精 | 默克 | ||
| 高分辨率照相机 | >1600万像素 | ||
| 匀浆器 | |||
| 水平电泳槽 | Sigma | ||
| 微型离心机 | 丹佛仪器 | ||
| 显微镜 | Leica | DM4000 B | 配备 Leica DFC 280 图像采集系统 |
| 切片机 | Leica | 2265 | |
| Paraplast | Sigma | P3558 | |
| 个人计算机 | 配备 Mac OS X、Lynux 或 Windows 系统 | ||
| 冷藏离心机 | |||
| 紫外–可见光分光光度计 | 瑞利 | 723G | 使用紫外灯 |
参考文献
- Hook, S. E., Gallagher, E. P., Batley, G. E. The role of biomarkers in the assessment of aquatic ecosystem health. Integrated Environmental Assessment and Management. 10 (3), 327-341 (2014).
- Connon, R. E., et al.
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重印与许可
