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方法文章

评估新热带无尾两栖类不同尺度生物标志物的生态毒理学方法

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DOI：

10.3791/64520

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2023年4月28日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Química de San Luis (INQUISAL), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas Y Técnicas (CONICET), Facultad de Ciencias de la Salud (FCS), Universidad Nacional de San Luis (UNSL), 2Departamento de Ciencias Ambientales y Producción, Universidad Nacional de Los Comechingones (UNLC), 3Laboratório de Patologia Experimental - LAPEx, Instituto de Biociências - INBIO Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, 4Cátedra de Citología, Facultad de Ciencias Naturales y Museo, Universidad Nacional de La Plata, 5Área de Biología, Departamento de Biología, Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional de San Luis (UNSL), 6Instituto de Recursos Biológicos, Centro de Investigaciones de Recursos Naturales (CIRN), Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), 7Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)

本文内容

摘要

本文介绍了用于评估新热带蛙类物种生物标志物的标准化生态毒理学方法。具体而言，本文详细阐述了在不同尺度上的多种生态毒理学评价方法，包括基因水平、细胞-组织学水平、生物化学水平、形态学水平以及个体水平。

摘要

生态毒理学中的新问题凸显了应用一系列生物标志物的重要性，因为这不仅能改进对环境胁迫因子对生物体影响的解释，还能提高对其潜在影响进行判定的能力。众所周知，在不同组织水平上使用生态毒理学生物标志物，可预测生物体对环境胁迫因子的生物学响应，这在环境风险评估中具有重要价值。

然而，有必要优化基本实验流程，建立对照组的历史数据，并采用特定的生物测定方法来评估器官和组织的反应，以阐明所观察效应的本质及其变异性。因此，本研究旨在描述在不同生态水平下应用于新热带无尾两栖类各个生活阶段的一系列生态毒理学方法，并验证这些方法作为生物标志物在野外和实验室条件下的适用性。在本研究中，这些生物标志物被应用于个体/有机体水平（体况指数）、组织学/生理学水平（组织病理学、组织形态测量学和色素分析）、生化水平（氧化应激相关酶）以及遗传水平（通过彗星实验检测DNA的直接损伤和氧化损伤）。

尽管这些方法因物种不同而存在细微差异或修改，但这些技术为评估外源性物质对无尾目动物的影响提供了有效的生物标志物。无尾目动物具有一些特定特征，使其成为水生和陆地生态系统的有用指示物种。总之，本研究中采用的一组生物标志物已被证明适用于评估新热带区无尾目动物的毒性反应，可进一步推荐作为生物指示物，用于识别污染物对区域水生生态系统的不利影响。最后，建议在特定区域内实现这些重要生物标志物的标准化，并可考虑将其纳入风险评估和决策过程之中。

引言

环境胁迫因子进入天然水体可能影响水生生态系统的健康1。这些环境胁迫因子可通过不同的毒性机制影响水生生物的存活或适应性，包括短期和长期的直接暴露2。因此，基于实验室的标准生物测定法评估与适应性和存活相关的毒理学终点，可能无法可靠地反映野外环境中胁迫所导致的多种间接效应。此外，生理水平的正常变化以及对个体的影响（例如捕食能力的变化）可能是评估生物体存活和繁殖适应性的更佳长期指标，并最终反映生态系统健康的状况1,3。基于已知的一组环境参数和污染物浓度，预测生态系统组成与功能以及生物体健康状况的变化，对于改进污染管理具有重要意义1。

生物标志物是指由于暴露于异源化学物质或受其影响而产生的生化、生理或组织学上的变化4,5。生物标志物已被证明可作为有效的早期预警信号4,5。生物标志物有助于回答的一个重要问题是：环境中某些应激因子的浓度是否已达到足以引发有害效应的水平。这些信息有助于评估是否值得进一步调查损害的性质与程度以及致因因子，或是否应在该情况下停止投入更多资源6,7,8。此外，由于将单一生物标志物作为生物指示剂进行评估的概念可能并不充分5,7,8,9,10，目前日益倾向于对多个生物标志物进行综合评估，以检测早期预警信号，从而防止对生态系统造成不可逆的影响。

必须注意，所有毒性效应均始于应激因子与生物分子的相互作用。从这一意义上讲，效应会逐级级联传递，贯穿生化、亚细胞、细胞、组织、器官、个体、种群、群落、生态系统、景观乃至生物圈等各个组织层次。细胞是环境应激因子与生物系统相互作用的主要场所。因此，理解分子与遗传效应有助于研究人员关联不同生态组织层次，并预测尚未经过测试的环境污染物对人类健康等可能产生的影响5。此外，由于细胞具有高度特异性，它们不仅可用于评估环境污染物，也可用于评估人类健康状况5,11。因此，理解应激因子在生化水平上的效应，可为揭示所观察到效应的成因提供线索，并将其与更高层次的效应相联系5。此外，通过了解应激因子的生化作用机制，还可基于新应激因子与已知污染物在功能上的相似性，预测尚未进行毒理学评估的新型应激因子可能产生的效应。在多种环境应激因子存在的情况下，遗传与生化生物标志物可为所观察到的特定效应提供有价值的信息。除此之外，与生化变化相关的组织化学评估还可提供有关毒物动力学的信息5。总之，必须对细胞、生化及组织学生物标志物进行综合分析10,12，而此类分析也应纳入针对本地物种的生物监测项目中5,13,14。

然而，在实验室条件下研究生物标志物可能会遇到一些困难，包括在污染物暴露后难以检测亚致死效应和慢性影响、所用方法的验证与标准化困难，以及复杂的时间或剂量依赖性反应、与适合度之间关系不明确或未确定，还缺乏整合的机制模型1,4。解决这些问题的方法并非增加所测定生物标志物的数量，而是应精心设计研究方案和可检验的假设，以阐明化学物质对完整生物体产生效应的机制基础4。

生态毒理学中的新问题凸显了应用一组生物标志物的重要性，以生成生态毒理学预测，从而更好地解释环境胁迫因子对生物体的影响，并支持关于其潜在影响的决策。此外，在环境风险评估和生物监测中结合使用生物标志物与生物指示物这两个概念的重要性在于，这将使研究人员能够判断特定关注环境中的生物体在生理上是否正常或处于应激状态。本研究采用的方法类似于对人体进行的生化分析。从这一角度而言，可分析一组生物标志物，以判断生物体在野外和实验室条件下是否健康6。最后，生物标志物将在两个方面有助于生态风险评估：（1）评估稀有和/或长寿命物种的暴露情况；（2）检验关于化学物质在不同生物组织水平上产生影响的机制假设4。

近十年来，生物标志物已被用于无尾目动物中监测其对细胞毒性和基因毒性污染物的暴露情况。其中，应用最为广泛的技术包括微核（MN）试验以及彗星试验，即通过单细胞凝胶电泳（SCGE）检测单链DNA断裂。此外，这些技术已成功用于评估多种新热带区无尾目动物在不同环境胁迫因子作用下所诱导的DNA损伤14,15,16,17,18,19。其他生物标志物还可用于检测暴露于环境污染物后生物体氧化状态的变化16,17,18,19。氧化应激是生物体暴露于不同外源性物质后产生的反应，可导致多种有害效应，包括影响暴露个体的抗氧化能力5,6,7,19,20。

在生态毒理学研究中，生物指示物种被用于识别环境胁迫因子在较高组织水平（如个体、种群、群落和生态系统水平）上的长期相互作用和有害效应10,20,21。通过整合生物标志物和生物指示物这两个概念，可以对物种进行筛选，以广泛界定与一个或多个生物组织水平上观测到的生物学效应相关或关联的生化、生理或生态结构及过程。最后，利用这两个概念以提高对胁迫因子毒性效应评估准确性的重大挑战，在于分析那些在生态风险评价中具有高实用价值的生物标志物和生物指示物20。在此意义上，学界普遍认为，将生物标志物和生物指示物作为早期预警信号具有重要意义，因为它们能够提供有关测试生物对环境胁迫因子响应的重要信息12,20,21。

两栖动物是全球最受威胁且数量下降最快的生物类群之一。导致其数量下降的主要原因之一是进入其栖息地的污染物，例如杀虫剂、重金属和新兴污染物22,23,24,25。无尾目动物具有多种使其可作为生物指示物种的特征，例如其皮肤具有通透性、与水环境关系密切，以及对环境污染高度敏感2,23,24。这些特征使两栖动物成为评估环境健康状况的有效生物指示剂7,8,22,23,24,26。

然而，不仅需要考虑基础操作流程的优化以及对照组历史数据的生成，还必须采用特定的生物测定方法来评估器官和组织的反应，以阐明在生物指示物中观察到的效应的性质和变化。基于此，本研究旨在描述一系列可在不同生态水平下应用于新热带无尾目动物各个生活阶段的生态毒理学方法，并验证这些方法作为在野外和实验室条件下均适用的有效生物标志物。本研究提出了一组可整合的生物标志物，这些标志物已在暴露于环境胁迫因子的无尾目动物的实验室和野外生物监测中得到验证。

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方案

以下技术涉及先前的动物牺牲操作，该操作是根据国际伦理标准46,47,48进行的，并包括后续的器官解剖与切除。动物捕获是在圣路易斯省环境、农业和生产部（第49-PMA2019号决议）授权下完成的。动物牺牲与安乐死的方法已获得圣路易斯国立大学机构动物护理与使用委员会（CICUA，协议编号 Q-322/19）批准的协议认可。对无尾目生物的操作均依照Garber等人46、CONICET47和INTA48中详述的指南进行。此外，本文所列所有方案均适用于新热带地区的无尾目物种，涵盖其幼体和成体生命阶段；这些方法已被当地研究人员广泛接受，并在各参与大学的"机构动物护理与使用委员会（CICUA）"严格协议及授权下实施。所用材料与溶液清单见材料表和表1。

1. 个体水平：体况及肝脏和性腺指数

  1. 体型状况指数：标准化质量指数
    注意：该指数可用于成体、幼体及幼虫。本方法基于 Peig 和 Green27，并根据 Brodeur 等人28,30 以及 MacCracken 和 Stebbings29 对无尾目动物所做的微小修改。
    1. 使用精密分析天平记录每个样本的体重。
    2. 将每个样本置于毫米纸上，在约 15 cm 的距离处拍摄照片。
      注意：务必始终在相同距离拍摄照片。
    3. 照片分析：
      注意：可使用免费在线获取的 ImageJ 软件（https://imagej.nih.gov/ij/index.html）或其他任何允许根据照片中包含的比例尺进行测量的图像分析软件对照片进行分析。
      1. 使用 ImageJ 软件中的测量工具，测量每个样本的吻肛长（SVL），并首先参照毫米纸上的已知尺寸进行校准。
        注意：对于蝌蚪，体长测量应至泄殖腔管为止，不包括尾鳍。
    4. 标准化质量指数（S）
      1. 根据所获得的每个无尾目动物的体重和 SVL 数据，建立体重（y 轴）对 SVL（x 轴）的非线性幂函数回归曲线。
      2. 利用所研究种群中所有个体的 SVL 数据计算平均长度。
      3. 最后，根据 Peig 和 Green27 以及 Brodeur 等人28 提出的公式（1）计算标准化质量指数（S）：
        S = Mi(L0/Li)b    (1)
        其中 Mi 和 Li 分别为个体 i 的体重和 SVL；b 为通过非线性幂函数回归估算的缩放指数28；L0 为所研究种群的平均长度；S 为当个体 i 的 SVL 标准化至 L0 时预测的体重。
        ​注意：需注意的是，b 是一个物种特异性的常数，在具有性二态性的物种中也可能具有性别特异性。
  2. 肝体指数：标准化肝脏指数
    注意：与体型状况指数类似，该指数可用于各个发育阶段的个体。本方法基于 Brodeur 等人28。
    1. 根据步骤 1.1.2 和 1.1.3 记录每个样本的 SVL。
    2. 根据无尾目两栖动物的伦理标准实施安乐死46,47,48。
    3. 完整取出肝脏，并使用精密分析天平精确至毫克记录其质量。
    4. 根据所获得的每个无尾目动物的肝脏质量和 SVL 数据，建立肝脏质量（y 轴）对 SVL（x 轴）的非线性幂函数回归曲线。
    5. 利用所研究种群中所有个体的 SVL 数据计算平均长度。
    6. 根据 Brodeur 等人28 提出的公式（2）计算标准化肝脏指数（SLI）：
      SLI = Lmi (L0/Li)b    (2)
      其中 Lmi 和 Li 分别为个体 i 的肝脏质量和 SVL；b 为通过非线性幂函数回归估算的缩放指数28；L0 为所研究种群的平均长度；SLI 为当个体 i 的 SVL 标准化至 L0 时预测的肝脏质量。
  3. 性腺指数：标准化性腺指数
    注意：本方法基于 Brodeur 等人30，仅适用于成体个体。需注意，雄性和雌性的指数必须分别分析，因其变化尺度不同。
    1. 根据步骤 1.1.2 和 1.1.3 记录每个样本的 SVL。
    2. 根据无尾目两栖动物的伦理标准实施安乐死46,47,48。
    3. 取出左右两侧性腺，并使用精密分析天平精确至毫克记录其质量。
    4. 根据所获得的每个无尾目动物的性腺质量和 SVL 数据，建立性腺质量（y 轴）对 SVL（x 轴）的非线性幂函数回归曲线，方法与步骤 1.1.4.1 和 1.2.3 类似。
    5. 利用所研究种群中所有个体的 SVL 数据计算平均长度。
    6. 根据 Brodeur 等人30 提出的公式（3）为每只动物估算标准化性腺指数（SGI）：
      SGI = Gmi(L0/Li)b    (3)
      其中 Gmi 和 Li 分别为个体 i 的性腺质量和 SVL，b 为 Brodeur 等人30 通过非线性幂函数回归估算的缩放指数，L0 为所研究种群的平均长度，SGI 为当个体 i 的 SVL 标准化至 L0 时预测的性腺质量。

2. 形态学-组织学水平

注意：本分析必须使用组织学切片。第一步是采集组织。

  1. 固定与脱水
    1. 使用固定液保存组织结构。对于无尾目动物组织，建议优先使用甲醇-醋酸-乙醇固定液（methacarn）或Bouin液，优于其他固定液（表1）。
      注意：所有试剂必须现用现配。
    2. 将蝌蚪或50–100 mg的组织碎片置于含有1–2 mL固定液的锥形管中，4 °C条件下固定3小时。随后用相同体积的70%乙醇洗涤组织30分钟。
    3. 将组织转移至新鲜的70%乙醇溶液中。
      注意：可在该步骤暂停数天，之后再继续进行脱水处理。
    4. 依次使用系列乙醇溶液进行脱水：80%乙醇（10分钟）、90%乙醇（10分钟）、100%乙醇（10分钟）和100%乙醇（10分钟）。
    5. 使用二甲苯进行透明（澄清）处理，每次10分钟，共2次。
    6. 将石蜡置于烧杯中熔化。将组织浸入熔化的石蜡中10分钟。取出组织，放入含有熔化石蜡的组织学包埋模具中，室温下静置使其凝固。
    7. 使用旋转式切片机切取3 µm厚的切片，并将其贴附于载玻片上。
  2. 组织形态计量分析
    1. 使用苏木精-伊红对组织切片进行染色31。
    2. 在光学显微镜下使用100倍物镜拍摄10–20张显微照片用于测量。每张照片中分析5–10个肝细胞。
      注意：此处以肝脏作为示例组织描述该技术，也可使用其他组织；需确保所用光学显微镜的物镜适用于目标组织类型，且能够清晰观察并识别待测细胞。
  3. 组织病理学分析
    1. 将组织切片经苏木精-伊红染色后32，在10倍、20倍、40倍和100倍物镜下观察5–10张组织切片。
    2. 观察组织变化，并根据Bernet等32所述方法计算组织变化程度（DTC）指数，公式如下（4）：
      DTC =Σalt.(a × w)    (4)
      其中，Σalt为所有病变的总和；a表示损伤程度（0，无；1，轻度；2，中度；3，重度）；w表示损伤可逆性程度（1，可逆；2，部分可逆；3，不可逆）。
      ​注意：此处以肝脏作为示例组织描述该技术，也可使用其他组织；需确保所用光学显微镜的物镜适用于目标组织类型。
  4. 色素系统分析
    1. 将切片经苏木精-伊红染色后，使用20倍物镜观察10–20张显微照片。
    2. 根据Santos等33的方法，利用Image Pro-Plus软件通过测定染色强度差异来量化黑色素所占面积。
    3. 打开Image Pro Plus 6.0®软件。
    4. 选择菜单和工具栏：生物学。
    5. 选择用于拍摄显微照片的空间放大倍数校准参数。
    6. 打开一张组织学图像。
    7. 选择工具计数 | 测量对象。
    8. 点击选择颜色按钮。
    9. 选择吸管工具，并在图像中标记待测着色区域。
    10. 关闭窗口，点击计数。
    11. 选择查看 | 统计信息以查看结果。

3. 生化水平：活性氧（ROS）与胆碱能酶

  1. 样品匀浆
    注意：实验结束后，若样品（组织或蝌蚪）不能立即处理，应将其保存在磷酸盐缓冲液（PBS）中，并于 −20 °C 冷冻保存（可保存 2 个月）或 −80 °C 冷冻保存（可保存 6 个月）。或者，也可根据以下建议立即进行匀浆处理。
    1. 蝌蚪
      1. 使用精密分析天平称取 1 g 蝌蚪或若干蝌蚪的混合样本。
      2. 将 1 g 蝌蚪放入含有 1 mL PBS 的 15 mL 锥形管中，并将其浸入冰浴（4 °C）中。
      3. 使用适配于锥形管的聚四氟乙烯头匀浆器在低温条件（4 °C）下进行匀浆。
        注意：避免使用过高转速，以免破坏蛋白质并导致温度升高。
      4. 将每份样本的液体匀浆液等体积转移至两个已标记的 2 mL 微量离心管中，并在低温条件（4 °C）下操作。
      5. 将含有液体匀浆液的样本在 4 °C、9,520 ×g 条件下离心 10 分钟。
      6. 最后，收集上清液，转移至微量离心管中，按 0.5 mL 至 1 mL 分装标记，并于 −80 °C（可保存 6 个月）或 −20 °C（可保存 2 个月）冷冻保存，直至进行酶活性测定。
    2. 成体
      1. 取出目标组织（如肝脏、肌肉、肾脏），使用精密分析天平称取 1 g 组织。
      2. 将组织放入含有 1 mL PBS 的 50 mL 锥形管中，并将其浸入冰浴（4 °C）中。
      3. 使用适配于锥形管的聚四氟乙烯头匀浆器在低温条件（4 °C）下进行匀浆。
        注意：避免使用过高转速（rpm），以免破坏蛋白质并导致温度升高。
      4. 将每份样本的液体匀浆液等体积转移至两个已标记的 2 mL 微量离心管中，并在低温条件（4 °C）下操作。
      5. 将含有液体匀浆液的离心管在 4 °C、9,520 ×g 条件下离心 10 分钟。
      6. 最后，收集上清液，转移至微量离心管中，按 0.5 mL 至 1 mL 分装标记，并于 −80 °C（可保存 6 个月）或 −20 °C（可保存 2 个月）冷冻保存，直至进行酶活性测定。
  2. 蛋白质浓度测定
    注意：测定蛋白质浓度是为了在酶活性分析中根据总蛋白量进行校正，以避免酶活性值的低估或高估。本方法基于 Bradford34 方法，并针对无尾目动物进行了轻微修改：
    1. 配制 Bradford 试剂（见表 1）。
    2. 将 100 mL 85%（p/v）的 H3PO4 加入 Coomassie G-250 + 乙醇中，用蒸馏水定容至 1 L。
    3. 使用牛血清白蛋白（BSA）作为已知蛋白标准品绘制标准曲线（表 1）。
    4. 为 3 mL 分光光度计比色皿配制浓度递增的白蛋白标准品溶液。标准曲线示例见表 2。
    5. 使用分光光度计在 590 nm 波长处测定吸光度（此为试剂与蛋白质形成复合物的特征波长）。
      注意：使用最大体积为 3 mL、光程为 1 cm 的玻璃比色皿进行 Bradford 反应，并用于分光光度计读数，有助于准确测定蛋白质浓度。
    6. 按以下顺序向比色皿中加入反应物：2,000 µL Bradford 试剂 + X µL 样品（X = 成年无尾目动物目标器官匀浆样本 20 µL，或蝌蚪匀浆样本 40 µL）。
    7. 最后，在分光光度计中于 590 nm 波长处测定吸光度。
      注意：无需在 4 °C 条件下操作。
  3. 过氧化氢酶（Catalase）
    注意：本方法基于 Aebi35 方法，并针对无尾目动物进行了轻微修改。
    1. 在 3 mL 石英比色皿（光程 1 cm）中孵育以下混合物：1,900 µL PBS + 40 µL 过氧化氢（H2O2）+ 20 µL 样品（蝌蚪样本使用原液，成体组织样本稀释 1/25）。
      注意：孵育过程中必须严格按照上述顺序添加试剂和样品。由于无尾目动物为生理变温动物，反应物可在室温（25 °C）下孵育。
    2. 在紫外分光光度计中于 240 nm 波长处连续读取 2 分钟的过氧化氢酶动力学曲线。
    3. 使用以下公式（5）35 计算酶活性：
      k（mmol∙min-1∙mg-1 Prt）=（Δ 吸光度 / 1,000）/ 蛋白质浓度   （5）
      ​注意：在纯化酶制剂的研究中，可通过将 k 除以摩尔消光系数（e = 43.6）得到比活性 k'0，即 k' =（k/e）。
  4. 谷胱甘肽 S-转移酶（GST）
    注意：本方法基于 Habig 等人36 方法，并针对无尾目动物进行了轻微修改。
    1. 在比色皿中孵育以下混合物：300 µL GST + 10 µL 1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）（0.1 M）+ 10 µL 样品（蝌蚪样本使用原液，成体组织样本稀释 1/25）。
      注意：孵育过程中必须严格按照上述顺序添加试剂和样品。由于无尾目动物为生理变温动物，反应物可在室温（25 °C）下孵育。
    2. 配制 GST 试剂（表 1）。
    3. 在分光光度计中于 340 nm 波长处连续读取 2 分钟的 GST 动力学曲线。
    4. 使用以下公式（6）计算酶活性：
      GST 活性速率（mmol/分钟/毫克蛋白）=（[Δ 吸光度 / 1,000] / 9.6 × 104）/ 蛋白质浓度   （6）
      ​其中 9.6 mM−1 cm−1 为摩尔消光系数。
  5. 脂质过氧化（TBARS）
    注意：本方法基于 Buege 和 Aust37 方法，并针对无尾目动物进行了轻微修改。
    1. 以丙二醛（MDA）为标准品、0.7% TBA 为显色剂绘制标准曲线（表 3）。
    2. 配制标准 MDA 溶液（10 mM）（表 1）。将溶液置于 50 °C 水浴中水解 1 小时，使 THP 转化为 MDA。
    3. 使用磁力加热搅拌器配制 0.7%（w/v）TBA 溶液（表 1）。
    4. 随后，将样品匀浆液在 4 °C、9,520 ×g 条件下离心 30 分钟。
    5. 吸取 500 µL 上清液，加入 100 µL 6 M NaOH，置于 60 °C 恒温水浴中反应 30 分钟。
    6. 水浴结束后，加入 250 µL 35% HClO4，然后置于冰浴（4 °C）中冷却 30 分钟。
    7. 冷却后，在 9,520 ×g 条件下离心 12 分钟，吸取 300 µL 上清液。
    8. 向该上清液（样品）中加入 300 µL 0.7% TBA，置于 97.5 °C 恒温水浴中反应 30 分钟。
    9. 在 532 nm 波长处测定样品与 TBA 反应生成的复合物的吸光度，并将吸光度值代入标准曲线方程，计算样品中 MDA 浓度（图 1）。
  6. 乙酰胆碱酯酶（AChE）
    注意：本方法基于 Ellman 等人38 提出的方法，并针对无尾目动物进行了轻微修改。
    1. 在测定前配制 DTNB 和碘化乙酰硫代胆碱（ATCh）试剂。
    2. 配制 DTNB 反应液（表 1）。
    3. 配制 AChE 反应液（表 1）。
    4. 在光程为 1 cm 的玻璃比色皿中，按以下顺序加入试剂以配制 AChE 反应体系：150 µL PBS 缓冲液（pH = 8）+ 150 µL DTNB + 50 µL ATCh + 10 µL 样品（蝌蚪样本使用原液，成年无尾目动物样本稀释 1/10）。
    5. 在室温下于 412 nm 波长处连续读取 2 分钟的 AChE 动力学曲线。
    6. 使用以下公式（7）计算 AChE 活性：
      AChE 活性速率（mmol∙min-1∙mg-1 蛋白）=（[Δ 吸光度 / 1,000] / 1.36）/ 蛋白质浓度   （7）

4. 遗传学与细胞水平：微核试验与彗星试验

  1. 微核（MN）试验
    注意：本方法依据 Fenech39 提出的方法，并针对新热带无尾目动物进行了轻微修改。
    1. 通过将标本浸入冰水（4 °C）中进行麻醉，并通过在蝌蚪的鳃盖后方切开或成体心脏穿刺采集血液样本。
    2. 将标本的外周血两滴涂抹于预先清洁的载玻片上。
    3. 随后，将载玻片在空气中干燥，用100%（v/v）冷甲醇（4 °C）固定20分钟，再用5%吉姆萨染液染色12分钟。
    4. 由一名研究人员在1000倍显微镜下对标本载玻片进行编码和盲法编码。
    5. 通过分析每个标本1000个成熟红细胞中的微核数量，确定微核频率，并以每1000个细胞中微核总数表示。
    6. 采用以下标准正确识别微核：
      1. 寻找直径小于主核1/3的微核。
      2. 确保微核的着色不具折光性，且染色强度与主核相同或更浅。
      3. 微核边界应与主核边界可区分，且不与主核相连或重叠。
      4. 确保每个细胞中与主核相关的微核数量不超过四个。
  2. 彗星试验或单细胞凝胶电泳（SCGE）
    1. 通过将标本浸入冰水中进行麻醉，并通过在蝌蚪的鳃盖后方切开或成体心脏穿刺采集血液样本。
    2. 用1 mL PBS稀释血液，离心（381 × g，9分钟），然后重悬于最终体积为50 mL的PBS中。
    3. 取30 µL血液样本与70 µL低熔点琼脂糖（LMPA）混合，琼脂糖终浓度为0.5%，形成第二层。随后，将50 µL第二层溶液加至已预先涂有第一层（含100 µL 0.5%正常熔点琼脂糖）的载玻片上。
    4. 用盖玻片覆盖载玻片，置于低温（4 °C）下10分钟，使第二层凝固。
    5. 第二层凝固后，移去盖玻片，再铺加100 µL 0.5% LMPA形成第三层。
    6. 第三层凝固后，移去盖玻片，将每张载玻片浸入含100 mL裂解液（表1）的Coplin染色缸中，裂解液需当天配制并保存于4 °C。将Coplin染色缸置于4 °C冷浴中避光孵育1小时，以完成细胞裂解。
      注意：实验可在此暂停并稍后继续。据报道，裂解时间可持续1小时至1个月。
    7. 裂解结束后，取出载玻片，将其浸入电泳缓冲液（表1）的电泳槽中。在4 °C避光条件下进行15分钟，使DNA解链。DNA解链后，在相同缓冲液中、4 °C下以25 V和250 mA进行电泳10分钟。
    8. 电泳结束后，加入2 mL Tris-HCl溶液（表1），对载玻片中的样品进行中和处理，每次5分钟，共3次。
    9. 彗星试验的最后一步，将载玻片置于含95%酒精的100 mL Coplin染色缸中（4 °C），使样品脱水。
    10. 最后，在载玻片中央加入10 µL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色，加盖盖玻片使染料均匀分布于样品中。使用WB滤光片在荧光显微镜下观察载玻片。
      注意：整个过程必须在避光条件下进行，以防止DNA光降解。
    11. 通过评估DNA从核样结构迁移的长度来量化DNA损伤。本实验中，随机选择100个无重叠的细胞进行目视评估。将DNA损伤分为四类：0-I类（无损伤）、II类（轻微损伤）、III类（中等损伤）和IV类（严重损伤）。数据以受损细胞的平均数量（II-IV类之和）和每组处理的平均彗星评分表示。根据以下公式（8）计算每个测试生物体的遗传损伤指数（GDI）：
      GDI = (1[I] + 2[II] + 3[III] + 4[IV])/N[I-IV])     (8)
      其中I-IV代表核样结构损伤类型，NI-NIV代表根据Pitarque等40统计的核样结构总数。

5. 相关生物标志物

注意：近年来，可采用 Beliaeff 和 Burgeot 提出的生物标志物响应指数（IBR）49，并将其适用于新热带区无尾目动物，从而在各个层面整合生物标志物信息。IBR 提供一个综合所有生物标志物响应的数值；IBR 值越高，表明应激水平越高49。针对某次调查中的特定样站或处理组进行 IBR 估算时，确定最终评分的连续数据处理步骤如下：

  1. 当个体结果可用时，计算平均估计值（X）；否则，使用每个采样站合并样本的值。
  2. 针对每个生物标志物，根据所有站点和/或调查的数据计算 X 的总体均值（m）和标准差（s），具体取决于拟进行的比较。
  3. 对 X 进行标准化以获得 Y。计算一个称为 Y 的值：Y = (X−m)/s。
  4. 按下式计算 Z 值：Z = Y 或 Z = −Y，分别对应于生物效应在应激源作用下表现为抑制或激活的情况。
  5. 最后，计算得分（S），其中 S = Z + |Min|，且 S ≥ 0，|Min| 为确定的最小绝对值。
  6. 在计算出每个生物标志物的 S 值（Si）并求和得到 IBR 后，绘制蜘蛛图或星形图。
    注：有关计算的任何细节，请参考原始论文49 。

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结果

本文介绍的所有生物标志物检测技术均为简单、快速、便捷、灵敏、低成本且准确的方法。对于每种生物标志物，需注意以下事项。

个体水平
标准化质量指数
在毫米尺度上拍摄照片非常重要，因为该数值将用于校准软件，从而在测量SVL变量时相比游标卡尺测量获得更高的客观性。此外，在实验室或野外研究中，个体处理过程中的采样时间往往至关重要，而使用照片进行后续分析可节省处理时间。为了进行标准化质量指数的分析，需进行非线性回归分析，以揭示SVL与体重之间的幂函数关系，进而确定缩放指数（b）（图2）。标准化质量指数适用于比较同一物种的成年或幼年群体。

标准化肝脏指数
标准化肝脏指数（SLI）反映了肝脏质量相对于标准体长（SVL）的相对大小。尽管该指数可用于成体个体和幼体，但由于幼体体型较小，对成体无尾目动物进行SLI研究更为方便。该参数的改变可能提示在较低水平（如组织学...

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讨论

个体水平的生物标志物非常易于测定且成本低廉，因为检测这些生物标志物仅需少量设备，而这些设备通常在任何科研实验室中都具备。此外，这些生物标志物可提供有关动物健康状况和适应性的总体信息。每个实验方案中所使用的动物数量对于获得可靠结果至关重要。由于数据存在变异性，每种处理组至少需要五只动物（N = 5）。具体而言，个体水平生物标志物测定中的一个关键步骤是测量SVL以计算体况指数，因为相机拍摄角度的变化可能导致SVL测量值的偏差。必须确保同一研究中所有个体的图像均以相同的方式拍摄，即采用相同的拍摄角度和相同的物距。然而，出于节省时间的考虑，通过图像分析法测量SVL优于使用卡尺进行测量。因此，采用这种图像分析方法将有可能增加被研究动物的数量，从而获得更稳健和可靠的结果。

肝体指数可用于比较同一物种的成体、幼体甚至幼虫群体，由于肝脏是主要的解毒器官，该指数的显著变化可能提示组织学和生物化学水平的改变。性腺指数适用于比较同一物种的成年无尾目动物群体，由于卵巢与睾丸在尺度上存在差异，雌性和雄性必须分别进行比较。该指数的显著变化可能提示性腺发生过程的改变，进而影响生物体的繁殖能力。

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

作者谨此致谢圣路易斯化学研究所（Instituto de Química de San Luis） "Dr. Roberto Olsina"- 感谢国家科学技术研究委员会（INQUISAL-CONICET）、圣路易斯国立大学（项目PROICO 2-1914）、南马托格罗索联邦大学生物科学研究所实验病理学实验室（LAPEx-INBIO-UFMS）、拉普拉塔国立大学细胞学讲席、国家科学促进署（FONCYT；PICT-2018-02570 和 PICT-2018-01067）提供的经费支持。我们还要感谢圣路易斯国立大学科学写作协助中心（GAECI-UNSL）以及母语为英语的Lidia Unger对稿件进行的校对工作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
分析级
电泳电源 耐力 E0203-250V 
伊红 默克
荧光显微镜 奥林巴斯 BX50配备合适的滤光片组合
哈里斯苏木精默克
高分辨率照相机  >1600万像素
匀浆器
水平电泳槽 Sigma
微型离心机丹佛仪器
显微镜LeicaDM4000 B配备 Leica DFC 280 图像采集系统
切片机Leica2265
ParaplastSigmaP3558
个人计算机 配备 Mac OS X、Lynux 或 Windows 系统
冷藏离心机
紫外–可见光分光光度计瑞利723G使用紫外灯

参考文献

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评估新热带无尾两栖类不同尺度生物标志物的生态毒理学方法
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