方法文章

评估新热带 Anurans 不同尺度生物标志物的生态毒理学方法

DOI：

10.3791/64520

⸱

2023年4月28日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Química de San Luis (INQUISAL), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas Y Técnicas (CONICET), Facultad de Ciencias de la Salud (FCS), Universidad Nacional de San Luis (UNSL), 2Departamento de Ciencias Ambientales y Producción, Universidad Nacional de Los Comechingones (UNLC), 3Laboratório de Patologia Experimental - LAPEx, Instituto de Biociências - INBIO Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, 4Cátedra de Citología, Facultad de Ciencias Naturales y Museo, Universidad Nacional de La Plata, 5Área de Biología, Departamento de Biología, Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional de San Luis (UNSL), 6Instituto de Recursos Biológicos, Centro de Investigaciones de Recursos Naturales (CIRN), Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), 7Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在本文中，提出了用于评估新热带 anuran 物种生物标志物的标准化生态毒理学方法。具体来说，本文详细介绍了不同尺度生态毒理学评价的几种方法，例如遗传、细胞组织学、生化、形态学和个体水平。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

生态毒理学中的新问题强调了应用一系列生物标志物的重要性，因为这导致生态毒理学预测不仅改善了对环境压力源对生物体影响的解释，还改善了对其可能影响的确定。众所周知，在不同组织层面使用生态毒理学生物标志物可以预测生物体对环境压力源的生物反应，这在环境风险评估中很有用。

然而，有必要考虑优化基本程序，在对照组中生成历史数据，并采用特定的生物测定来评估器官和组织的反应，以阐明观察到的效果的性质和变化。因此，这项工作旨在描述在不同生态水平上新热带 anurans 各个阶段采用的几种生态毒理学方法，并验证它们作为可用于野生动物和实验室条件的有用生物标志物。在这项工作中，这些生物标志物应用于个体/生物体水平（身体状况指数）、组织学/生理水平（组织病理学、组织学和色素分析）、生化水平（氧化应激酶）和遗传水平（通过彗星测定 DNA 中的直接和氧化损伤）。

尽管这些方法根据物种的不同而有微小的变化或修改，但这些技术为评估外源性物质对 anurans 的影响提供了有效的生物标志物，anurans 具有某些特性，使其成为水生和陆地生态系统的有用指示物种。总之，本研究中采用的一系列生物标志物已被证明足以估计新热带无尾动物的毒性反应，并且可以进一步推荐作为确定污染物对该地区水生生态系统影响的生物指标。最后，建议在特定地区实现这些重要的 anurans 生物标志物的标准化，并可能将它们纳入风险评估和决策中。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

环境压力源输入自然水体会影响水生生态系统的健康1。暴露于这些环境压力源会通过不同的毒性机制影响水生生物的生存或健康状况，包括直接暴露（短期和长期）2。因此，用于评估与健康和生存相关的毒理学终点的标准化实验室生物测定可能是对现场压力的许多间接影响的不可靠估计。此外，正常生理水平的改变和对个体的影响，例如猎物捕获，可能是对生物体生存和生殖适应性影响以及最终对生态系统健康影响的更好的长期指标 1,3。根据一组已知的环境参数和污染物浓度预测生态系统组成和功能以及生物体健康的变化，对于改善污染管理非常重要1。

生物标志物被定义为由于暴露于外源性化学物质或外源性化学物质的影响而导致的生化、生理或组织学变化 4,5。生物标志物已被证明作为早期预警信号非常有用 4,5。生物标志物有助于回答的一个重要问题是，某些压力源在环境中是否以足够高的浓度存在以造成不利影响。这些信息有助于评估是否值得调查损害的性质和程度以及病原体，或者是否应该在这种情况下投入更多资源 6,7,8。此外，由于将单一生物标志物作为生物指标进行评估的概念可能不够 5,7,8,9,10，因此越来越倾向于对多种生物标志物进行全面评估，以检测早期预警信号，从而防止对生态系统产生不可逆转的影响。

需要注意的是，所有毒性作用都始于压力源与生物分子的相互作用。从这个意义上说，影响可以通过组织的生化、亚细胞、细胞、组织、器官、个体、种群、群落、生态系统、景观和生物圈组织层面进行级联。细胞是环境压力源和生物系统之间相互作用的主要场所。因此，了解分子和遗传效应使研究人员能够将低水平和高水平的生态组织联系起来，并帮助他们预测尚未经过测试的环境污染物的影响，例如对人类健康的影响5。此外，由于细胞的高度特异性，它们不仅可用于评估环境污染物，还可用于评估人类健康 5,11。因此，了解压力源在生化水平上的影响可能有助于深入了解观察到的影响的原因，并使它们与下一个更高层次的影响联系起来5。此外，通过了解压力源的生化机制，可以根据它们的功能相似性，预测尚未进行毒理学评估的新压力源对其他已知污染物的影响。在存在各种环境压力源的情况下，遗传和生化生物标志物可能会提供有关观察到的特定影响的宝贵信息。除此之外，与生化变化相关的组织化学评估可以提供有关毒理动力学的信息5。简而言之，对细胞、生化和组织学生物标志物的全面分析是必要的10,12，反过来，这种类型的分析应包含在当地物种的生物监测计划中 5,13,14。

尽管如此，在实验室条件下对生物标志物的研究可能存在一些困难，包括难以检测暴露于污染物后的亚致死效应和慢性影响，以及所采用方法的验证和标准化，以及复杂的时间或剂量依赖性反应，与适应性的联系不明确或未确定，以及缺乏综合机制模型1，4.为了解决这些问题，解决方案不是增加测量的生物标志物的数量，而是仔细设计研究和可检验的假设，这有助于解释化学作用对整个生物体的机制基础4。

生态毒理学中的新问题强调了应用一系列生物标志物来生成生态毒理学预测的重要性，这些预测可以改善对环境压力源对生物体影响的解释，以及关于其可能影响的决策。此外，在环境风险评估和生物监测中结合生物标志物和生物指标概念的重要性在于，这将使研究人员能够确定特定感兴趣环境中的生物体是生理正常还是压力大。本研究采用的方法类似于在人类中进行的生化分析。从这个意义上说，可以分析一系列生物标志物，以查看生物体在野外和实验室中是否健康6。最后，生物标志物将以两种方式促进生态风险评估:（1） 评估稀有和/或长寿物种的暴露，以及 （2） 测试关于生物组织不同层面的化学影响机制的假设4.

在过去的十年中，生物标志物已被用于 anurans 中，用于生物监测细胞毒性和遗传毒性污染物的暴露情况。其中，最常用的技术是微核 （MN） 测定和彗星测定或通过单细胞凝胶电泳 （SCGE） 测定诱导单链 DNA 断裂。此外，这些技术已成功用于估计几种新热带无尾动物中各种环境压力源诱导的 DNA 损伤 14,15,16,17,18,19。其他生物标志物可用于检查暴露于环境污染物的生物体氧化状态的变化 16,17,18,19。氧化应激是对暴露于不同外源性物质的反应，导致多种有害影响，包括对暴露个体的抗氧化能力 5,6,7,19,20。

在生态毒理学研究中，使用生物指示剂物种是因为它们是在较高组织层面（例如，生物体、种群、群落和生态系统层面）识别环境压力源的长期相互作用和不利影响的生物体10,20,21。通过整合生物标志物和生物指示剂这两个概念，可以筛选物种以广泛定义与生物组织一个或多个层次上测量的生物效应相关或相关的生化、生理或生态结构或过程。最后，利用这两个概念来改进对压力源毒性的估计的巨大挑战与分析在生态风险评估中具有高度效用的生物标志物和生物指标有关20。从这个意义上说，对于使用生物标志物和生物指标作为早期预警信号的相关性存在共识，因为它们提供了有关测试生物体对环境压力源反应的相关信息 12,20,21。

两栖动物是全世界受威胁最大且数量迅速下降的生物群体之一。这种下降的主要原因之一是进入其栖息地的污染物，例如杀虫剂、金属和新出现的污染物 22,23,24,25。Anurans 具有几个特性，使它们可用作生物指示剂物种，例如它们的皮肤可渗透、与水的密切关系以及对环境污染的敏感性 2,23,24。这些特征使两栖动物成为环境健康的有效生物指标 7,8,22,23,24,26。

然而，不仅需要考虑基本程序的优化和在对照组中生成历史数据，而且还需要采用特定的生物测定来评估器官和组织的反应，以阐明在生物指示剂中观察到的效果的性质和变化。从这个意义上说，本研究旨在描述在不同生态水平上新热带 anurans 的所有阶段采用的几种生态毒理学方法，并验证它们作为可用于野生动物和实验室条件的有用生物标志物。这项工作提出了一系列可以整合的生物标志物，这些生物标志物已被证明可用于暴露于环境压力源的 anurans 的实验室和野生动物生物监测。

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方案

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以下技术包括根据国际道德标准 46,47,48 进行的先前动物祭祀，以及随后的器官解剖和消融。这些动物是在圣路易斯省环境、农业和生产部（第 49-PMA2019 号决议）的授权下捕获的。动物的牺牲和安乐死方法得到了圣路易斯国立大学机构动物护理和使用委员会（CICUA，协议 Q-322/19）协议的正式批准。根据 Garber 等人 46、CONICET47 和 INTA48 中详述的指南对 anuran 生物体的程序进行。此外，此处介绍的所有协议均适用于处于幼虫和成虫生命阶段的新热带 anuran 物种;它们已经被当地研究人员广泛接受，并在严格的协议下进行，并得到了每所相关大学的 "Cuidado y Uso de Animales 委员会 （CICUA）" 的授权。材料表和表 1 中列出了所使用的材料和解决方案。

1. 个人层面:身体状况和肝脏和性腺指标

  1. 体况指数:缩放质量指数
    注意:该指数既可用于成虫，也可用于幼虫和幼虫。该方法基于 Peig 和 Green27，根据 Brodeur 等人 28,30 和 MacCracken 和 Stebbings29 对 anurans 进行了细微修改。
    1. 使用精密分析秤记录每个标本的体重。
    2. 将每个标本放在毫米片上，并在 ~15 cm 的距离处拍照。
      注意:始终从相同的距离拍摄照片很重要。
    3. 照片分析:
      注意:可以使用在线免费提供的 ImageJ 程序 （https://imagej.nih.gov/ij/index.html） 或允许从照片中包含的比例进行测量的任何其他图像分析程序来分析照片。
      1. 使用 ImageJ 程序中的 测量工具 测量每个样品的鼻子-通风口长度 （SVL），并首先参考毫米片中的已知测量值。
        注意:在蝌蚪中，体长的测量值必须根据泄殖腔管进行，而不考虑尾鳍。
    4. 缩放质量指数 （S）
      1. 使用从每个 anuran 的体重和 SVL 获得的数据，构建体重（y 轴）与 SVL（x 轴）的非线性幂函数回归线。
      2. 使用从研究人群中测量的所有个体的 SVL 数据计算平均长度。
      3. 最后，根据 Peig 和 Green27 以及 Brodeur 等人 28 使用等式 （1） 计算缩放质量指数 （S）:
        S = Mi（L0/Li）b （1）
        其中 Mi 和 Li 分别是个体 i 的体重和 SVL;b 是由非线性幂函数回归28 估计的缩放指数;L0 是研究群体的平均长度;S 是个体 i 的 SVL 标准化为 L0 值时的预测体重。
        注意:重要的是要注意 b 是一个物种特异性常数，在性二态性物种中也可能是性别特异性的。
  2. 肝体指数:缩放的肝脏指数
    注意:至于身体状况指数，该指数可用于处于所有发育阶段的个体。该方法基于 Brodeur 等人 28。
    1. 根据步骤 1.1.2 和步骤 1.1.3 记录每个样品的 SVL。
    2. 根据 anuran 两栖动物的道德标准 46,47,48 对个体实施安乐死。
    3. 取出整个肝脏，并在精密分析刻度上记录其质量，精确到毫克。
    4. 使用从每个 anuran 的肝脏质量和 SVL 获得的数据，构建肝脏质量（y 轴）与 SVL（x 轴）的非线性幂函数回归线。
    5. 使用从研究人群中测量的所有个体的 SVL 数据计算平均长度。
    6. 根据 Brodeur 等人 28 使用等式 （2） 计算缩放的肝脏指数 （SLI）:
      SLI = Lmi （L0/Li）b （2）
      其中 Lmi 和 Li 分别是个体 i 的肝脏质量和 SVL;b 是由非线性幂函数回归28 估计的缩放指数;L0 是研究群体的平均长度;SLI 是个体 i 的 SVL 标准化为 L0 时的预测肝脏质量。
  3. 性腺指数:缩放的性腺指数
    注意:该方法基于 Brodeur 等人 30 ，仅对成年人有用。需要注意的是，男性和女性指数必须分别分析，因为它们在不同的尺度上有所不同。
    1. 根据步骤 1.1.2 和步骤 1.1.3 记录每个样品的 SVL。
    2. 根据 anuran 两栖动物的道德标准 46,47,48 对个体实施安乐死。
    3. 去除左右性腺，并在精密分析刻度上记录质量，精确到最接近的毫克。
    4. 利用从每个 anuran 的性腺质量和 SVL 获得的数据，构建一条性腺质量（y 轴）相对于 SVL（x 轴）的非线性幂函数回归线，类似于步骤 1.1.4.1 和步骤 1.2.3。
    5. 使用从研究人群中测量的所有个体的 SVL 数据计算平均长度。
    6. 根据 Brodeur 等人 30 使用等式 （3） 估计每只动物的缩放性腺指数 （SGI）:
      SGI = 克i（L0/Li）b （3）
      其中 Gmi 和 Li 分别是个体 i 的性腺质量和 SVL，b 是 Brodeur 等人30 通过非线性幂函数回归估计的缩放指数，L0 是研究人群的平均长度，SGI 是个体 i 的预测性腺质量当其 SVL 标准化为 L0 时。

2. 形态学-组织学水平

注意:对于此分析，有必要使用组织学切片。第一步是收集组织。

  1. 固定和脱水
    1. 使用固定液来保留结构。对于无尿酸组织，最好使用 methacarn 或 Bouin 溶液，推荐使用其余固定溶液（表 1）。
      注意:使用时必须混合所有物质。
    2. 将 50-100 mg 的蝌蚪或组织碎片放入装有 1-2 mL 固定液的锥形管中，在 4 °C 下放置 3 小时。在相同体积的 70% 乙醇中洗涤组织 30 分钟。
    3. 将组织放入新鲜的 70% 乙醇溶液中。
      注意:在继续脱水之前，此时可以停止该程序几天。
    4. 在一系列酒精溶液中脱水组织:乙醇 80%（10 分钟）、酒精 90%（10 分钟）、乙醇 100%（10 分钟）和乙醇 100%（10 分钟）。
    5. 在二甲苯中进行 2 x 10 分钟的淀粉化（透明化）。
    6. 在烧杯中融化石蜡。将组织浸泡 10 分钟。取出组织，放入含有熔化石蜡的组织学模具中。等待它在室温下凝固。
    7. 将旋转切片机上制备的 3 μm 切片放在载玻片上。
  2. 组织学分析
    1. 用苏木精-伊红31 对组织切片进行染色。
    2. 在光学显微镜中使用 10-20 张显微照片进行 100 倍物镜测量。在每个显微照片中分析 5-10 个肝细胞。
      注意:在这里，肝脏被用作描述该技术的模型。可以使用其他组织;确保要使用的光学显微镜物镜适合组织类型。有必要能够看到和识别要测量的细胞。
  3. 组织病理学
    1. 在苏木精-伊红32 中对组织切片进行染色后，在 10 倍、20 倍、40 倍和 100 倍物镜下检查 5-10 个组织学切片。
    2. 寻找组织变化并估计组织变化程度 （DTC） 指数，如 Bernet 等人 32 使用等式 （4） 所述:
      DTC =Σalt.（一× w）   （4）
      其中 Σalt 是变化的总和;a 表示损害阶段（0，不存在;1，低;2，中等;3，高）;w 表示损坏的可逆程度（1，可逆;2，部分可逆;3，不可逆）。
      注意:在这里，肝脏被用作描述该技术的模型。可以使用其他组织;确保要使用的光学显微镜物镜适合组织类型。
  4. 色素系统
    1. 在苏木精 - 伊红中对载玻片染色后，用 20 倍物镜检查 10-20 张显微照片。
    2. 根据 Santos 等人 33，使用 Image Pro-Plus 软件测量染色强度的差异，量化黑色素占据的面积。
    3. 打开软件 Image Pro Plus 6.0®。
    4. 选择 Menu and Toolbar: Biological（菜单和工具栏:生物）。
    5. 选择用于拍摄显微照片 的放大倍率的空间校准 。
    6. 打开组织学图像。
    7. 选择 工具计数 |测量对象。
    8. 点击 Select colors 按钮。
    9. 选择 吸管工具，并在图像中标记要测量的颜色。
    10. 关闭窗口，然后单击 Count （计数）。
    11. 选择 View |Statistics 查看结果。

3. 生化水平:活性氧 （ROS） 和胆碱能酶

  1. 样品均质化
    注意:实验结束后，如果当时不打算处理样品（组织或蝌蚪），请在 -20 °C（2 个月）或 -80 °C（6 个月）下冷冻，将样品（组织或蝌蚪）保存在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中。或者，可以根据下面提出的建议在当时对它们进行均质化。
    1. 蝌蚪
      1. 在精密分析天平上称取 1 g 蝌蚪或蝌蚪池。
      2. 将 1 g 蝌蚪放入含有 1 mL PBS 的 15 mL 锥形管中，并将其浸入冰浴 （4 °C） 中。
      3. 使用适用于锥形管的特氟龙尖端均质器进行均质化，并在寒冷条件下 （4 °C） 工作。
        注意:避免使用高转数，因为这可能会破坏蛋白质并提高温度。
      4. 将每个样品的相同体积的液体匀浆转移到两个标记的 2 mL 微量离心管中，并在低温条件下 （4 °C） 工作。
      5. 将装有液体匀浆的样品在 4 °C 和 9,520 × g 下离心 10 分钟。
      6. 最后，提取上清液，将其置于微量离心管中，以 0.5 mL 至 1 mL 的等分试样标记，并在 -80 °C（6 个月）或 -20 °C（2 个月）的冰箱中保存，直至酶测定。
    2. 成年人
      1. 取出感兴趣的组织（例如肝脏、肌肉、肾脏），并在精密分析天平上称取 1 g。
      2. 将组织放入含有 1 mL PBS 的 50 mL 锥形管中，并将其浸入冰浴 （4 °C） 中。
      3. 使用适用于锥形管的特氟龙尖均质器进行均质化，并在低温 （4 °C） 下工作。
        注意:避免使用高转速，因为这可能会破坏蛋白质并提高温度。
      4. 将每个样品的相同体积的液体匀浆转移到两个标记的 2 mL 微量离心管中，并在低温 （4 °C） 下工作。
      5. 将装有液体匀浆的试管在 4 °C 和 9,520 × g 下离心 10 分钟。
      6. 最后，提取上清液，将其置于微量离心管中，以 0.5 mL 至 1 mL 的等分试样标记，并在 -80 °C（6 个月）或 -20 °C（2 个月）的冰箱中保存，直至酶测定。
  2. 蛋白质测定
    注:获得蛋白质值是为了估计与蛋白质总量相关的酶活性，同时避免低估或高估酶活性值。该方法基于 Bradford34 ，对 anurans 进行了细微修改:
    1. 准备 Bradford 试剂（见 表 1）。
    2. 将 100 mL 85% （p/v） 的 H3PO4 加入考马斯 G-250 + 乙醇中，并用蒸馏水加热至 1 L 的体积。
    3. 用牛血清白蛋白 （BSA） 作为已知蛋白质标准品制备校准曲线（表 1）。
    4. 为 3 mL 分光光度计比色皿制备浓度递增的白蛋白标准品。有关标准曲线的示例，请参见 表 2。
    5. 使用分光光度计在 590 nm 处测量吸光度（这是形成试剂和蛋白质复合物的波长）。
      注:使用最大体积为 3 mL、光程为 1 cm 的玻璃比色皿对样品进行 Bradford 反应以在分光光度计中读取有助于蛋白质测定。
    6. 按以下顺序将以下反应物放入比色皿中:2,000 μL Bradford 试剂 + X μL 样品（X = 20 μL 来自成年 anuran 的感兴趣器官的匀浆样品，或 40 μL 来自蝌蚪的匀浆样品）。
    7. 最后，在分光光度计中测量 590 nm 处的吸光度。
      注意: 没有必要在 4 °C 下工作。
  3. 过氧化氢酶
    注意:该方法基于 Aebi35 ，对 anurans 进行了细微修改。
    1. 将 1,900 μL PBS + 40 μL 过氧化氢 （H2， 0，2） + 20 μL 样品（蝌蚪纯，成人组织稀释 1/25）在光程为 1 cm 的 3 mL 石英比色皿中孵育。
      注意:在孵育过程中，请按照上述顺序添加试剂和样品。反应物可以在室温 （25 °C） 下孵育，因为 anurans 在生理上是变温的。
    2. 在紫外分光光度计中读取 240 nm 处的过氧化氢酶动力学 2 分钟。
    3. 用以下公式 （5）35 计算酶活性:
      k （mmol∙min-1∙mg-1 Prt） = （Δ 吸光度/1,000）/蛋白质浓度 （5）
      注:在使用纯化酶制剂的研究中，比活性 k'0 是通过将 k 除以摩尔消光系数 （e = 43,6） 获得的; k' = （k/e） 的
  4. 谷胱甘肽 S-转移酶 （GST）
    注意:该方法基于 Habig 等人 36 ，对 anurans 进行了细微修改。
    1. 在比色皿中孵育 300 μL GST + 10 μL 1-choro-2,4-二硝基苯并 （CDNB） （0.1 M） + 10 μL 样品（蝌蚪纯净，成人组织稀释 1/25）。
      注意:在孵育过程中，请遵循上述试剂和样品的添加顺序。试剂可以在室温 （25 °C） 下孵育，因为 anurans 在生理上是变温的。
    2. 准备 GST（表 1）。
    3. 在分光光度计中读取 340 nm 处的 GST 动力学 2 分钟。
    4. 使用以下公式 （6） 计算酶活性:
      GST 活性率（mmol/每分钟/mg 蛋白质）= （[Δ 吸光度/1,000]/9.6 × 104）/蛋白质浓度 （6）
      其中 9.6 mM-1 cm-1 = 摩尔消光系数。
  5. 脂质过氧化 （TBARS）
    注意:该方法基于 Buege 和 Aust37 ，对 anuran 进行了细微修改。
    1. 以 MDA 为标准品和 0.7% TBA 构建校准曲线（表 3）。
    2. 准备标准 MDA 溶液 （10 mM）（表 1）。通过将溶液置于 50 °C 水浴中 1 小时，进行 THP 水解成 MDA。
    3. 使用磁性热板搅拌器制备 0.7% （w/v） 的 TBA 溶液（表 1）。
    4. 然后，将样品匀浆在 9,520 × g 和 4 °C 下离心 30 分钟。
    5. 提取 500 μL 上清液，加入 100 μL 6 M NaOH，置于 60 °C 的热浴中 30 分钟。
    6. 热浴后，加入 250 μL 35% HClO4，然后放入冰浴 （4 °C） 中 30 分钟。
    7. 之后，以 9,520 × g 离心 12 分钟，并提取 300 μL 上清液。
    8. 向上清液（样品）中加入 300 μL 0.7% TBA，置于热浴 （97.5 °C） 中 30 分钟。
    9. 读取样品和 TBA 在 532 nm 处形成的复合物的吸光度，并通过代入曲线方程中的吸光度值来确定样品中的 MDA 浓度（图 1）。
  6. 乙酰胆碱酯酶 （AChE）
    注意:该方法基于 Ellman 等人提出的方法38 ，对 anurans 进行了细微修改。
    1. 在测量时，设置 DTNB 和乙酰硫代胆碱碘化物 （ATCh） 试剂。
    2. 准备 DTNB 反应（表 1）。
    3. 准备 AChE 反应（表 1）。
    4. 在光程为 1 cm 的玻璃池中，按以下顺序放置这些试剂来制备 AChE 反应:150 μL PBS 缓冲液 （pH = 8） + 150 μL DTNB + 50 μL ATCh + 10 μL 样品（在蝌蚪中纯净，在成年无尾蝌中稀释 1/10）。
    5. 在室温下读取 412 nm 处 2 分钟的 AChE 动力学。
    6. 使用以下公式 （7） 获得 AChE 活性的值:
      AChE（mmol∙min-1∙mg-1 蛋白）的活性率 = （[Δ 吸光度/1,000]/1.36）/蛋白质浓度 （7）

4. 遗传和细胞水平:微核和彗星测定

  1. 微核 （MN） 测定
    注意:该方法与 Fenech39 提出的方法一致，但对新热带无毛动物有轻微修改。
    1. 通过浸入冰水 （4 °C） 麻醉标本，并通过在蝌蚪中鳃盖后面切片或成人心脏穿刺来获取血液样本。
    2. 将标本中的两滴外周血涂抹在预先清洁的载玻片上。
    3. 然后，风干载玻片，用 100% （v/v） 冷甲醇 （4 °C） 固定 20 分钟，然后用 5% Giemsa 溶液染色 12 分钟。
    4. 有一个研究人员代码，并以 1,000 倍放大倍率对载玻片进行盲编码。
    5. 通过分析每个标本中的 1,000 个成熟红细胞来确定 MN 的频率，并表示为每 1,000 个细胞的 MN 总数。
    6. 使用以下标准正确识别 MN:
      1. 寻找直径小于主核直径 1/3 的 MN。
      2. 确保 MN 的着色是不可折射的，但具有与主核相同或更轻的染色强度。
      3. 寻找与主核边界区分开来的 MN 边界，该边界与核心没有任何连接或与主核重叠。
      4. 确保细胞中的 MN 数量不超过 4 个与细胞核关联的 MN。
  2. 彗星测定或单细胞凝胶电泳 （SCGE）
    1. 通过浸入冰水中麻醉标本，并通过在蝌蚪的鳃盖后面切片或成人的心脏穿刺来获取血液样本。
    2. 用 1 mL PBS 稀释血液，离心（381 × g，9 分钟），然后重悬于终体积为 50 mL PBS 中。
    3. 将 30 μL 血液样品与 70 μL 低熔点琼脂糖 （LMPA） 混合，以 0.5% 浓度的琼脂糖形成第 2 层。随后，将 50 μL 第 2 层放在先前涂有第 1 层的载玻片上，该载玻片含有 100 μL 0.5% 正常熔点琼脂糖。
    4. 用盖玻片盖住载玻片，并在寒冷 （4 °C） 中放置 10 分钟以固化第 2 层。
    5. 凝固后，取下盖玻片，并放置 100 μL 0.5% LMPA 形成第三层。
    6. 当第三层凝固时，取下盖玻片，将每张载玻片浸入含有裂解液（表 1）的 100 mL Coplin 罐中，该裂解液已在同一天制备并保持在 4 °C 下。 将 Coplin 罐子在黑暗 （4 °C） 中冷水浴中 1 小时以进行裂解。
      注意:实验可以暂停，稍后再重新启动。据报道，裂解期持续 1 小时至 1 个月。
    7. 裂解结束时，取出载玻片，浸入电泳槽中的电泳缓冲液（表 1）中。在 4 °C 下在黑暗中执行此步骤 15 分钟，以使 DNA 解旋。核 DNA 解旋后，在 4 °C 的温度下以 25 V 和 250 mA 在同一缓冲液上进行电泳 10 分钟。
    8. 在电泳结束时，加入 2 mL Tris-HCl 溶液，在 3 x 5 分钟内中和载玻片中包含的样品（表 1）。
    9. 在彗星测定技术的最后一步中，将样品放入 4 °C 下含酒精 （95%） 的 100 mL Coplin 罐中，使样品脱水。
    10. 最后，将 10 μL 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚 （DAPI） 置于载玻片中心对样品进行染色，并放置盖玻片，将染料散布在整个样品中。在带有 WB 滤光片的荧光光显微镜下检查载玻片。
      注意:整个过程必须在黑暗中进行，以避免 DNA 光降解。
    11. 通过评估 DNA 从类核迁移的长度来量化 DNA 损伤。在这种情况下，在 100 个随机选择的单元格上直观地确定它，没有重叠。将 DNA 损伤分为四类:0-I（无损伤）、II（最小损伤）、III（中等损伤）和 IV（最大损伤）。将数据表示为每个治疗组的平均受损细胞数（II-IV 类的总和）和平均彗星评分。根据这些数据，使用以下公式 （8） 计算每个测试生物体的遗传损伤指数 （GDI）:
      GDI = （1[I] + 2[II] + 3[III] + 4[IV]）/N[I-IV]） （8）
      其中 I-IV 代表类核损伤的类型，NI-NIV 代表根据 Pitarque 等人40 评分的类核细胞总数。

5. 相关生物标志物

注意:最近，通过使用 Beliaeff 和 Burgeot49 提出的生物标志物反应 （IBR） 指数，可以在各个层面整合生物标志物，并适用于新热带无尿虫。IBR 提供了一个整合所有生物标志物响应的数值;较高的 IBR 值表示较高的压力水平49。就给定站点的 IBR 估计或给定调查的处理而言，确定最终分数的连续数据处理步骤如下:

  1. 当单个结果可用时，计算平均估计值 （X）;否则，请使用每个采样站的混合样本中的值。
  2. 对于每个生物标志物，计算所有站点和/或调查的 X 的一般平均值 （m） 和标准差 （s），具体取决于要进行的比较。
  3. 标准化 X 以获得 Y。 计算一个名为 Y 的值: Y = （X- m）/s。
  4. 按如下方式计算 Z 值: Z = Y 或 Z = −Y，在生物效应的情况下，分别对应于响应压力源的抑制或激活。
  5. 最后，计算分数 （S），其中 S = Z + |Min|，其中 S ≥ 0 和 |敏|是确定的最小绝对值。
  6. 在计算每个生物标志物 （Si） 的 S 值并进行总结以获得 IBR 后，绘制蜘蛛图或星形图。
    注意:有关计算的任何详细信息，请参阅原始论文49。

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结果

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这里介绍的所有生物标志物技术都是简单、快速、方便、灵敏、低成本和准确的方法。对于每个生物标志物，重要的是要注意以下内容。

个人级别
缩放质量指数
在毫米尺度上拍摄照片非常重要，因为该值将用于校准软件，这会导致在获取 SVL 变量时卡尺测量具有更好的客观性。此外，使用照片进行后续分析可以节省处理个体的处理时间，无论是在实验室还是现场研究中，采样时间始终至关重要。为了进行缩放质量指数的分析，重要的是进行非线性回归分析，以证明物种的 SVL 和体重之间的幂函数关系，以确定缩放指数 （b）（图 2）。缩放质量指数可用于比较来自同一物种的成鱼或幼鱼组。

肝脏指数标尺
SLI 给出了肝脏相对于 SVL 的相对质量的概念。虽然它既可用于成虫个体，也可用于幼虫，但由于幼虫的体积较小，用成虫研究 SLI 更方便。该参数的改变表明在较低水平 （组织学、生化） 可能产生的...

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讨论

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个体层面的生物标志物非常易于确定且成本非常低，因为检查这些生物标志物只需要任何研究实验室通常可用的几件设备。此外，这些生物标志物提供有关动物健康和健康状况的一般信息。每个方案中使用的动物数量对于获得可靠的结果至关重要。由于数据的可变性，每次处理至少需要五只动物 （N = 5）。详细来说，个人层面生物标志物的一个关键步骤是测量身体状况指数的 SVL，因为相机位置角度的变化可能会导致 SVL 测量的变化。同一研究中所有个体的图像必须以相同的方式、相同的角度和与要拍摄的对象相同的距离拍摄。然而，为了节省时间，通过图像分析方法测量 SVL 比卡尺测量更可取。因此，使用这种图像分析方法可以增加研究动物的数量，从而获得更稳健和可靠的结果。

肝脏指数可用于比较来自同一物种的成虫、幼虫甚至幼虫组，并且由于肝脏是主要的解毒器官，显着变化将表明组织学和生化水平的变化。性腺指数可用于比较来自同一物种的成年无尾动物组，并且正如预期的那样，由于卵巢和睾丸之间的规模差异，必须分别进行女性和男性比较。该指数的显着变化可能表明性腺发生的变化，这...

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披露

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作者声明没有利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者非常感谢圣路易斯 Química "Dr. Roberto Olsina" - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas （INQUISAL-CONICET）、圣路易斯国立大学 （Project PROICO 2-1914）、实验父学实验室 （LAPEx） - 生物研究所 （INBIO） - 南马托格罗索联邦大学 （UFMS）、Cátedra de Citología - 拉普拉塔国立大学 （UNLP） 和 Agencia Nacional de Promoción Científica （FONCYT;PICT-2018-02570 和 PICT-2018-01067） 寻求财务支持。我们还要感谢母语人士 Lidia Unger 和圣路易斯国立大学的 GAECI-UNSL（科学写作辅助中心）对手稿的校对。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
分析级
电泳电源 耐力赛 E0203-250V 
伊红 默克
荧光显微相机 奥林巴斯 BX50配备适当的过滤器组合
哈里斯默克
高分辨率照片相机  >16 MP
均质器
水平电泳室 
微量离心机丹佛仪器
显微镜LeicaDM4000 B配备图像捕捉系统 Leica DFC 280
切片机Leica2265
ParaplastSigmaP3558
个人电脑 与 Mac OS X、Lynux 或 Windows
冷冻离心
UV 配合使用–可见分光光度计Rayleigh723G带紫外灯
苏木精Sigma机

参考文献

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