方法文章

由天然接合性质粒介导的水平基因转移检测 E. coli

DOI：

10.3791/64523

⸱

2023年3月24日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biological Sciences, University of California Irvine, 2Department of Microbiology & Environmental Toxicology, University of California Santa Cruz

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

接合作用通过在两个不同细胞之间转移质粒DNA介导水平基因转移，促进有益基因的传播。本研究描述了一种广泛使用的方法，用于高效检测接合性质粒的转移，该方法基于在接合性质粒、供体和受体中使用差异标记来检测转接合子。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

接合转移是促进革兰氏阴性菌水平基因转移的主要机制之一。本研究以两种天然存在的接合质粒为例，描述了研究天然接合质粒动员能力的方法。这些方案依赖于供体菌、受体菌和接合质粒之间可选择标记的差异分布。具体方法包括：1）天然接合质粒的鉴定；2）在固体培养基中定量测定接合频率；以及3）通过聚合酶链式反应（PCR）对转接合子受体中的抗生素抗性基因和质粒复制子类型进行诊断性检测。本文所述的实验方案是在研究水平基因转移的进化生态学背景下建立的，用于筛选环境中细菌所携带的带有抗生素抗性基因的接合质粒。实验中观察到接合质粒在培养条件下的高效转移，凸显了接合机制在促进水平基因转移、特别是抗生素抗性扩散方面的生物学重要性。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1946年，Lederberg 和 Tatum1描述了大肠杆菌（Escherichia coli）K-12中的一种有性过程，该过程现在被称为接合。细菌接合是指一个细菌细胞（供体）通过直接的细胞间接触，单向地将遗传物质转移给另一个细胞（受体）的过程。接合现象在细菌中广泛存在2,3，尽管表达接合机制的供体细胞比例通常非常小4。

质粒是能够自主复制的染色体外DNA元件。除了含有与质粒复制和维持相关的基因外，质粒通常还携带一系列与适应环境压力相关的基因，例如抵抗重金属或抗生素暴露的基因5。接合型质粒是一类具有特殊基因集合的质粒，能够实现向受体细胞的转移，并在转移后维持自身的稳定存在6。在假单胞菌门（Pseudomonadota，同义于变形菌门 Proteobacteria）的细菌中，接合型质粒的大小范围从21.8 kb到1.35 Mb不等，中位数约为100 kb5,7。这类质粒通常拷贝数较低，可能是为了尽量减少对宿主细胞的代谢负担8,9。

典型的接合装置包含四个组分：转移起始位点（oriT）、松弛酶、IV型耦联蛋白以及IV型分泌系统（一种称为菌毛的管状结构，可使供体细胞与受体细胞接触）6。仅有极小部分携带接合性质粒的细胞会表达接合装置4，但如果这些质粒提供了适应性优势，接合子便能在群体中迅速扩增。从不同生境中分离的E. coli菌株中，有35%至超过80%携带含有至少一种抗生素抗性基因的接合性质粒10,11；因此，由接合性质粒介导的水平基因转移是推动抗生素抗性基因全球传播的主要机制之一12。

在实验室培养中进行的交配实验表明，接合频率受多种因素影响，包括受体细胞的性质、生长阶段、细胞密度、供体与受体比例、接合反应在液体或固体培养基中进行、碳源、氧气、胆盐、金属离子浓度、哺乳动物细胞的存在、温度、pH值以及交配时间13,14,15。

本研究描述了检测特定宿主菌株中接合性质粒存在的方案，定量固体培养条件下接合转移频率的方案，以及验证其向受体细胞转移的确认方法。这些方案可作为鉴定适用于科研的天然接合性质粒的第一步。由于这些方法旨在大规模（数十至数百个供体菌株）筛选来自多种来源（环境、共生和致病菌）的细菌中接合性质粒的存在，因此采用了最少且简化的操作步骤。

此外，还展示了检测特定接合质粒的转移是否独立于用于检测的抗生素（即所选择的抗生素抗性基因的相关性）的实验方法，以及比较在不同环境分离株中发现的两种接合质粒的接合转移速率的实验方法。

根据相关接合质粒的遗传组成（质粒复制子和抗生素抗性基因的构成），本方案的每个步骤均可进行修改，以研究多种可能影响接合率的因素的作用。

通用实验设计：
进行接合实验所需的基本组分包括供体细胞、受体菌株，以及用于筛选供体（抗生素A）、受体（抗生素B）和接合子（抗生素A和B）的固体培养基。接合子是指稳定携带供体接合性质粒的受体细胞。

供体细胞对一种抗生素（抗生素A）具有抗性，而对用于筛选受体细胞的标记物或标记物（抗生素B）敏感。抗生素抗性基因的基因组位置（即.，无论其位于供体细胞的染色体还是质粒上）均无需知晓 先验的因为抗生素抗性标记物在供体与受体直接接触后转移到受体，表明供体提供的标记物位于质粒上。

受体菌株（已知能够接收接合质粒）必须具有供体菌株中不存在的稳定可筛选标记；该可筛选标记通常对染色体上携带的抗生素或杀菌剂具有抗性。在接合实验中，受体菌株的选择至关重要，因为不同 E. coli 菌株接收接合质粒的能力存在差异16。

一旦这些条件确立，在供体与受体细胞对接触后，能在同时含有两种抗生素（A 和 B）的培养基上生长的任何菌落均为潜在的接合转接子（图 1）。此结论的前提是：供体能在含抗生素 A 的培养基上生长，但不能在含抗生素 B 的培养基上生长；而受体能在含抗生素 B 的培养基上生长，却不能在含抗生素 A 的培养基上生长。接合转接事件可通过两种诊断试验加以确认。第一种试验是检测接合转接子菌落中是否存在接合性质粒所携带的基因（可通过聚合酶链式反应 [PCR] 扩增或其他方法进行）。第二种试验则利用基于乳糖代谢的菌落颜色差异标记。该颜色差异可通过使用麦康凯琼脂（MacConkey agar）显现：琼脂中的乳糖可被能够发酵乳糖（lac+）的微生物作为发酵底物利用。这些微生物产生有机酸（尤其是乳酸），从而降低环境 pH。中性红是一种添加于培养基中的 pH 指示剂，当 pH 降至 6.8 以下时，其颜色由浅白色变为鲜红色或粉红色17。因此，乳糖阳性的大肠杆菌（E. coli）菌株在麦康凯琼脂上形成较大且呈粉红色的菌落，而乳糖阴性菌株则形成较小、颜色浅黄的菌落。

接合质粒转移示意图；通过接合从供体转移到受体；抗生素抗性，PCR分析。
图1：用于检测供体菌株中接合质粒存在的实验设计。 在本示例中，供体携带一种含有抗生素抗性基因的接合质粒，该基因赋予其对抗生素A的抗性，但对抗生素B敏感。相反，受体具有染色体上的抗性决定因子，可抵抗抗生素B，但对抗生素A敏感。接合子对两种抗生素（A和B）均具有抗性，因为它们获得了供体的接合质粒（赋予对抗生素A的抗性）以及受体的染色体（赋予对抗生素B的抗性）。请点击此处查看该图的放大版本。

对于一对供体-受体菌株（在给定实验条件下），其接合转移率可通过将接合子数量除以供体数量或除以受体数量来计算；前者表示供体细胞中成功表达功能性接合装置的比例16,18，而第二个速率则表示受体菌接受接合质粒的能力19,20在本研究中，除非另有说明，接合率表示成为接合子的受体细胞所占的比例（即.，每位受者发生率。

本文报道了两个独立的接合实验，涉及一种 E. coli 受体菌和两种 E. coli 供体菌。此外，针对其中一种供体菌使用了不同的抗生素来筛选接合子，以证实单个多重耐药质粒可通过该接合性质粒中存在的任意抗生素抗性基因进行筛选。

本研究所用的供体和受体菌株均已进行全基因组测序，以明确该实验系统的所有组分；然而，这些实验方案的设计旨在筛选序列未知宿主中接合性质粒的存在，也可在此类实验背景下使用；但在这种情况下，需首先对相关基因进行测序。

本方案中使用的供体菌株和受体菌株如下：

供体1。E. coli SW4955 采自美国路易斯安那州巴吞鲁日市的一个湖泊。该菌株携带一个大小为134,797 bp的接合性质粒（p134797），含有IncFIC(FII)和IncFIB（AP001918）复制子。该接合性质粒携带赋予对第三代头孢菌素（blaCTX-M-55）、氨基糖苷类（aac(3)-IIa 和 aadA1）、苯酚类（catA2）、四环素类（tet(A)）、甲氧苄啶（dfrA14）以及磺胺类药物（sul3）耐药性的基因。p134797的完整图谱详见图2A。E. coli SW4955为乳糖阳性菌，在麦康凯琼脂培养基上形成粉红色菌落。

供体2。E. coli SW7037 采自美国俄亥俄州奥塔瓦县的伊利湖。该菌株携带一个101,718 bp的接合性质粒（p101718），其含有IncI1-I(Alpha)复制子。该接合性质粒携带一个赋予β-内酰胺类抗生素抗性的基因（blaCMY-2）。p101718的完整图谱见图2B。E. coli SW7037还能发酵乳糖，在麦康凯琼脂平板上形成粉红色菌落。

大肠杆菌质粒 p134797 和 p101718 的环状基因组图谱，突出显示耐药基因。
图2：本研究中所用接合质粒的遗传图谱。（A）质粒 p134797，来源于大肠杆菌（E. coli）菌株 SW4955 的接合质粒。（B）质粒 p101718，来源于大肠杆菌（E. coli）菌株 SW7037 的接合质粒。抗生素抗性基因以蓝色标出，属于接合装置的基因以红色标出。请点击此处查看该图的高清版本。

受体菌。使用 E. coli LMB100 作为受体菌。该菌株不含质粒，对利福平（100 mg/L）和链霉素（100 mg/L）具有抗性。对两种抗生素的抗性可降低供体菌产生抗性突变的可能性，从而避免干扰实验结果的解读。此外，E. coli LMB100 为乳糖阴性菌，在麦康凯琼脂培养基上形成的菌落呈淡黄色且较小（与之相对，供体菌株形成较大、粉红色的菌落），因此可据此与两种供体菌株相区分。

当供体菌为乳糖阴性时，我们建议使用乳糖阳性的受体菌（例如，E. coli J53）。LMB100 和 J53 菌株可供其他实验室使用。请将请求连同收件地址和联邦快递（FedEx）账号一并发送至 Gerardo Cortés-Cortés 博士。

用于筛选和计数供体、受体及接合子的固体培养基为直径100 mm的培养皿中的麦康凯琼脂。需添加以下抗生素：（i）培养基A：羧苄青霉素（100 mg/L），用于计数供体并确保受体无法在此抗生素条件下生长；（ii）培养基B：利福平（100 mg/L）+ 链霉素（100 mg/L），用于计数受体并确保供体无法在这两种抗生素条件下生长；（iii）培养基AB：羧苄青霉素（100 mg/L）+ 利福平（100 mg/L）+ 链霉素（100 mg/L），用于获得并计数接合子；（iv）培养基C：不含抗生素，用于划线接种所有被研究的分离株。

比较了E. coli SW4955 和 E. coli SW7037 中接合性质粒向 E. coli LMB100 的接合转移率。此外，在后续实验中，针对 p134797 接合性质粒（SW4955 菌株），将抗生素羧苄西林（100 mg/L）分别替换为庆大霉素（2 mg/L）、氯霉素（25 mg/L）、四环素（10 mg/L）、甲氧苄啶（20 mg/L）或磺胺甲噁唑（100 mg/L），以确定用于筛选的抗生素抗性标记是否对实验结果产生影响。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

方法1：偶联

  1. 第1天：划线接种供体菌和受体菌。分别从甘油菌种中取菌，在C培养基（无抗生素的麦康凯琼脂）上单独划线，于37 °C过夜培养。
    注意：此步骤旨在确保实验使用纯菌株，并通过菌落颜色确认乳糖发酵表型。
  2. 第2天：为每个供体菌和受体菌标记一个14.0 mL的培养管。分别挑取单个供体菌和受体菌菌落，接种于含有2 mL Mueller Hinton肉汤的14.0 mL培养管中，于37 °C、200 rpm振荡条件下过夜（18 h）培养。
    注意：本实验所用菌株在18 h过夜培养后达到稳定期。
  3. 第3天：使用生理盐水（900 µL）与过夜培养物（100 µL）进行1:10稀释，测定各供体菌和受体菌过夜培养物在600 nm处的光密度（OD600）（无需涡旋混匀）。
  4. 用灭菌生理盐水（0.85% NaCl水溶液）将各供体菌和受体菌的光密度调整至2.0（OD600 = 2.0）。
    注意：OD600 = 2.0的大肠杆菌（E. coli）过夜培养物，其菌浓度约为1.6 × 109 CFU/mL。
  5. 标记一个1.5 mL微量离心管为"接合管"，并注明供体菌和受体菌菌株。分别将500 µL已调整至OD600 = 2.0的供体菌和受体菌悬液转移至该接合管中（此时接合管中每种菌的浓度为0.8 × 109 CFU/mL）。轻轻颠倒混匀。
  6. 将接合管在室温下以500 × g离心10分钟。
  7. 小心移除上清液，避免扰动沉淀，用移液器吸出800 µL接合管中的液体，保留200 µL于管中。
    注意：将上清液弃入含10%次氯酸钠的容器中，以灭活悬浮液中的细菌。
  8. 将接合管置于37 °C培养箱中静置培养18 h（过夜）。接合过程在此期间发生。
    注意：此步骤必须静置培养，避免振荡，以防破坏接合菌毛。
  9. 作为阴性对照，将供体菌的过夜培养物划线接种于B培养基，受体菌划线接种于A培养基，于37 °C倒置过夜培养。
  10. 第4天：向接合管中加入800 µL生理盐水，涡旋振荡以重悬菌体（使接合混合物总体积恢复至1 mL）。
    注意：涡旋振荡可使接合中的细菌分离，并均质化培养物，以便准确测定CFU/mL。
  11. 对接合混合物进行1:10系列稀释（从1 × 100至1 × 10-7）。取10-5至10-7稀释度的菌液各100 µL，分别涂布于A培养基和B培养基；所有稀释度均涂布于AB培养基。
    注意：100 指未稀释的原液管。
  12. 待平板表面干燥后，倒置于37 °C培养箱中培养18 h（过夜）。
  13. 第5天：检查阴性对照，确认供体菌的纯过夜培养物未在B培养基上生长，受体菌的纯过夜培养物未在A培养基上生长。
  14. 记录可计数的菌落数及其对应的稀释度：
    1. 计数A培养基上的菌落，这些为供体菌。菌落应呈粉红色（图3A、B）。
    2. 计数B培养基上的菌落，这些为受体菌和接合子。菌落应呈淡黄色（图3C）。
    3. 计数AB培养基上的菌落，这些为接合子。菌落应呈淡黄色。
      注意：选择可计数的平板。可计数平板的菌落数应在30至300之间（超过300难以准确计数，少于30则样本量过小，无法准确反映原始样品情况）。
  15. 计算每供体菌或每受体菌的接合频率
    每供体菌的接合频率 = （接合子CFU/mL [AB培养基]）/（供体菌CFU/mL [A培养基]）× 100
    每受体菌的接合频率 = （接合子CFU/mL [AB培养基]）/（受体菌与接合子CFU/mL [B培养基]）× 100
    ​注意：本实验方案中接合频率的计算方式为接合子数除以受体菌数，再乘以100。根据文献，该数值可被称为接合子频率、基因转移频率、接合频率、重组子产量、质粒转移效率、基于总菌数的接合频率、接合子比例、受体菌群中接合子占比、接合子频率、接合频率、接合速率对数、转移速率常数、每对接合对的接合速率、接合系数或接合效率20。本方案采用“接合效率”这一术语。
  16. 将接合子以甘油菌种形式保存于-80 °C。按以下步骤制备甘油菌种：
    1. 挑取单个接合子菌落，接种于含羧苄青霉素（100 mg/L）的5.0 mL培养管中（含2 mL Mueller Hinton肉汤），于37 °C、200 rpm振荡条件下过夜（18 h）培养。
    2. 标记冻存管，注明接合子名称，格式如下：Tc + 供体菌名称 + A培养基中所用筛选抗生素（由于接合子继承了受体菌背景，已对链霉素和利福平耐药，并额外携带编码β-内酰胺类抗生素抗性基因的质粒）；例如：TcU1Carb。若同一供体菌产生多个接合子需分别保存，则添加连续编号（如TcU1Carb1、TcU1Carb2等）。
    3. 将1 mL过夜培养物转移至含1 mL 50%甘油（v/v）的冻存管中（终浓度为25%），轻轻颠倒混匀。将冻存管置于干冰上15分钟，随后于-80 °C保存，以备后续实验使用。
  17. 如需进行DNA提取，将甘油菌种中的接合子划线接种于添加羧苄青霉素（100 mg/L）的Mueller Hinton琼脂平板，37 °C过夜培养；随后按照步骤2.1的建议进行操作。

2. 方法2：聚合酶链式反应（PCR）扩增抗生素抗性基因和质粒复制子 E. coli 接合子

注意：聚合酶链式反应（PCR）由 Kary Mullis 博士于 1983 年开发。PCR 依赖于特异性引物（一段与特定 DNA 序列互补的短链 DNA，可作为 DNA 复制的起始点，通常长度为 20–40 个核苷酸，理想情况下鸟嘌呤-胞嘧啶含量为 40%–60%），这些引物与变性的双链 DNA 模板的两条互补链退火，并由耐热 DNA 聚合酶延伸，从而生成新的模板用于下一轮反应，最终实现原始模板的指数级扩增21。在本实验方案中，通过扩增接合质粒中存在的复制子和抗性基因，以确认其在接合子受体细胞中的转移。

  1. DNA 提取
    1. 为了检测接合性质粒携带的耐药基因转移情况，使用接合子 DNA 作为模板。采用简单的煮沸法提取以裂解细菌细胞壁。
      注意：简单的煮沸法提取是一种裂解细菌细胞壁的简便方法。该提取物中含有质粒 DNA 与基因组 DNA 的混合物，但由于引物是根据特定目标 DNA 序列设计的，因此该模板也可用于 PCR。质粒也可进行特异性纯化，但随着质粒尺寸增大，得率通常会下降22。此处可作为方便的暂停点。DNA 可在 -20 °C 下保存数月。
  2. PCR
    1. 由于实验设置了阴性对照和阳性对照，建议在 1.5 mL 离心管中将所有反应体系配制成一个总混合液（pool）。将一个 1.5 mL 管标记为 "pool"，并将所需的 PCR 管分别标记为基因名称和样本名称（例如 OXA-U1）。
    2. 按以下顺序将 PCR 试剂加入 1.5 mL 管中：无菌水、2× Master Mix、引物和聚合酶（模板 DNA 除外）（见 表 1）。通过移液上下吹打至少 10 次以充分混匀。整个过程保持在冰上进行。
      注意：佩戴手套以避免污染反应体系或试剂。尽量避免在同一区域打开、混合试剂和处理样本，以防试剂污染。将试剂置于冰桶中以抑制核酸酶活性和非特异性引物结合。在配制反应体系前确保试剂完全解冻。整个实验过程中始终保持试剂处于冰上。Taq 聚合酶在最后加入，因其对 pH 变化敏感，需缓冲环境以防止降解或错误折叠。引物序列列于 表 2—抗生素耐药基因—和 表 3—复制子23,24,25,26,27,28。
    3. 将模板 DNA 加入对应的 PCR 管中。避免产生气泡，并确保 PCR 管盖密封牢固。
    4. 将 PCR 管放入热循环仪中。
    5. 启动程序。参考 表 2（耐药基因）和 表 3（复制子）中列出的各基因对应的程序设置。
      注意：设置 PCR 程序时，运行结束后应将样品保持在 4 °C。
      1. 复制子的 PCR 条件：94 °C 变性 5 分钟，1 个循环；随后进行 30 个循环：94 °C 变性 1 分钟，60 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 1 分钟；最后 72 °C 延伸 5 分钟，1 个循环。
        注意：此条件由 Carattoli 等人标准化29。
    6. 程序结束后，将 PCR 管保存于 4 °C。
      注意：此处可作为方便的暂停点。PCR 产物可在 -20 °C 下保存数月。
    7. 配制 1% 琼脂糖凝胶：称取 0.6 g 琼脂糖加入 250 mL 锥形瓶中，加入 60 mL 1× Tris-乙酸-EDTA（TAE）缓冲液（若凝胶体积不同，请相应调整试剂用量）。在微波炉中小心缓慢加热使琼脂糖完全溶解，避免溢出，并冷却至约 55 °C（10–15 分钟）。
      1. 使用超纯去离子水和分析级试剂配制所有试剂：
      2. TAE 50× 缓冲液 （Tris 碱、乙酸和 EDTA）（1 L）：将 121.1 g Tris 碱 + 372.24 g EDTA 溶于 500 mL 蒸馏水中，磁力搅拌器搅拌溶解。加入 57.1 mL 乙酸，再用蒸馏水定容至 1,000 mL。
      3. 在 15 psi、121 °C 下高压灭菌 15 分钟，室温保存，可使用长达 6 个月。
      4. TAE 1× 缓冲液（1 L）：取 20 mL TAE 50× 缓冲液与 980 mL 蒸馏水混合均匀。
    8. 在通风橱内，向熔化的琼脂糖中加入 6 µL SYBR Green，混匀后倒入已用胶带密封边缘的制胶槽（含梳子）中，以防泄漏。静置 15–25 分钟，直至凝胶变浑浊即凝固完成。
      注意：也可使用其他替代染料30,31,32,33。
    9. 撕去胶带，将凝胶放入电泳槽中，并加入足够的 1× TAE 缓冲液，使液面刚好覆盖凝胶表面。
    10. 将 5 µL 6× DNA 上样缓冲液与每份反应产物 25 µL 混合，通过移液上下吹打至少 10 次以轻柔混匀。
      注意：无需将全部 PCR 产物上样即可观察到预期条带（可根据需要调整染料用量）。剩余的 PCR 样品可保存并在 -20 °C 下储存数月。
    11. 将混合液上样至加样孔中（避免产生气泡），盖上电泳槽盖。
      注意：第一个加样孔保留给 DNA 标准分子量标记（ladder），从第二个孔开始上样，优先上样阴性对照。
    12. 在第一个加样孔中加入 4 µL 1 kb DNA 标准分子量标记。
    13. 以 120 V、400 mA 恒定电流运行电泳 60 分钟。
    14. 在紫外光下（使用紫外成像仪）观察凝胶并记录图像。
      注意：若存在 PCR 产物，可通过标准紫外透射仪、可见光透射仪或激光扫描仪检测染色的 DNA 条带。
试剂 储存液加入50 μL反应体系的体积（1x）终浓度示例：加入1x体系的体积示例：加入3x（混合）体系的体积示例：每管加入体积（终体积50 μL）阳性对照加入体积阴性对照加入体积
终浓度加入1x体系的体积加入3x（混合）体系的体积
无菌水 - 21.5 μL（加至终体积50 μL） -21.5 μL 64.5 μL49 μL/管 49 μL/管49 μL/管
预混液 2x 25 μL1x25 μL75 μL
正向引物 25 μM 1 μL0.5 μM1 μL 3 μL
反向引物 25 μM 1 μL0.5 μM1 μL3 μL
模板DNA 可变（100–200 ng/μL） 可变（1 μL） 可变0.5 μL 1.5 μL
聚合酶5 Units/μL 0.5 μL2.5 Units- - 1 μL（接合子） 1 μL（供体）1 μL（受体）
注：q.s. 是拉丁文 quantum satis 的缩写，意为“所需量”。

表1：三次PCR反应的试剂和反应体系（示例）。 

引物（序列按 5' - 3' 方向列出）PCR 程序预期大小
(bp)参考文献
blaCTX-M group 194 oC  7 min(864)23
CTX-M: GGTTAAAAAATCACTGCGYC94 oC  50 s   (35 个循环)
CTX-M: TTGGTGACGATTTTAGCCGC50 oC  40 s  
68 oC  1 min
68 oC  5 min
blaCMY-295 oC  3 min(1855)24
CMY-2-F: GATTCCTTGGACTCTTCAG95 oC 30 s   (30 个循环)
CMY-2-R: TAAAACCAGGTTCCCAGATAGC53 oC  30 s
72 oC  30 s
72 oC  3 min
aac(3')-II94 oC  5 min(237)25
aac(3')-II-F: ACTGTGATGGGATACGCGTC94 oC  30 s    (32 个循环)
aac(3')-II-R: CTCCGTCAGCGTTTCAGCTA60 oC  45 s
72 oC  2 min
72 oC  8 min
aadA94 oC  5 min(283)26
aadA1: GCAGCGCAATGACATTCTTG94 oC  1 min (35 个循环)
aadA2: ATCCTTCGGCGCGATTTTG60 oC  1 min
72 oC  1 min
72 oC 8 min
sul-394 oC 5 min(799)27
sul-3-F: GAGCAAGATTTTTGGAATCG94 oC  1 min (30 个循环)
sul-3-R: CATCTGCAGCTAACCTAGGGCTTTGGA51 oC  1 min
72 oC  1 min
72 oC  5 min
tet(A)95 oC  5 min(957)28
TETA-1: GTAATTCTGAGCACTGTCGC95 oC  30 s    (23 个循环)
TETA-2: CTGCCTGGACAACATTGCTT62 oC  30 s
72 oC  45 s
72 oC  7 min
dfrA95 oC  5 min(302) 本研究
dfrA-F: CATACCCTGGTCCGCGAAAG95 oC 1 min (30 个循环)
55 oC  1 min
dfrA-R:  CGATGTCGATCGTCGATAAGTG72 oC  1 min
72 oC  7 min
catA295 oC  5 min
catA2-F: GACCCGGTCTTTACTGTCTTTC95 oC 1 min (25 个循环)(225) 本研究
catA2-R: TCCGGTGATATTCAGATTAAAT60 oC  1 min
72 oC  1 min
72 oC  7 min

表2：用于扩增诊断性耐药基因的引物及PCR程序。 

复制子引物（序列以 5' - 3' 方向列出）靶标PCR 程序预期大小（bp）
IncFIBF: TCTGTTTATTCTTTTACTGTCCACrepA94 oC 5 min683
R: CTCCCGTCGCTTCAGGGCATT94 oC 1 min（30 个循环）
60 oC 30 s
IncFICF: GTGAACTGGCAGATGAGGAAGGrepA272 oC 1 min262
R: TTCTCCTCGTCGCCAAACTAGAT72 oC 5 min
IncI1F: CGAAAGCCGGACGGCAGAARNAI139
R: TCGTCGTTCCGCCAAGTTCGT

表3：通过基于PCR的复制子分型对质粒p134797和p101718进行分类所用的引物及PCR程序29。 

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

由于供体菌株 SW4955 和 SW7037 已完成测序，预计这两个供体菌株具有与其基因组序列中鉴定出的耐药基因谱相对应的耐药表型。质粒 p134797（来自 SW4955）携带赋予对第三代头孢菌素（blaCTX-M-55）、氨基糖苷类（aac(3)-IIa 和 aadA1）、苯酚类（catA2）、四环素类（tet(A)）、甲氧苄啶（dfrA14）以及磺胺类（sul3）耐药的基因；在 SW4955 染色体中未发现抗生素耐药基因。质粒 p101718（来自 SW7037）仅携带一个抗生素耐药基因（blaCMY-2），预计可赋予对第三代头孢菌素（blaCTX-M-55）的耐药性。同样，在 SW7037 染色体中也未发现抗生素耐药基因。

接合交配后，预期可检测到携带上述所有耐药基因的两种接合性质粒的转移。阳性接合检测结果表明，被鉴定为接合子的受体菌应已获得这些接合性质粒。同时预期在接合子中通过PCR检测到用于鉴定接合性质粒的特异性耐药基因的存在。

为了说明此处描述的方法，对两种 E. coli 通过接合转移质粒DNA的能力在环境分离株中进行了测试。实验设置的示意图如下所示 图1两名供者（E. coli SW4955 和 SW7037）以及一个受体（E. coli LMB100）分别进行接合。在接合质粒中发现的基因图谱 E. coli SW4955 (p134797) 和 SW7037 (p101718) 如下所示 图2.

使用羧苄青霉素筛选接合质粒，并利用利福平和链霉素进行反向筛选，这两种抗生素的抗性决定因子位于受体菌的染色体上。采用麦康凯琼脂区分乳糖阳性供体菌（形成较大、粉红色菌落）与受体菌及接合子（均为乳糖阴性，形成较小、淡黄色菌落）（图3）。

细菌接合结果；平板培养物的菌落放大图；基因转移研究。
图 3：MacConkey 琼脂平板上供体与受体菌落的差异性颜色标记示意图。 供体菌落在 MacConkey 琼脂平板上呈粉红色，因其能够发酵乳糖（乳糖阳性），而受体菌落则呈浅黄色且较小（乳糖阴性），由此可区分供体与受体菌落。 请点击此处查看该图的放大版本。

检测到接合性质粒p134797的转移，每种抗生素对应质粒中发现的五类不同抗生素抗性基因。

以菌株SW4955为例说明接合效率（CE）的计算方法。在菌株SW4955的实验中，10-2稀释度的平板上计数得到172个转化子菌落形成单位（CFU）；相应稀释度（10-2）的受体菌计数为10,300,000 CFU/mL（表4）。

CE 的计算方法如下：

CE = (174 CFU/mL)/(10,300,000 CFU/mL)

CE = 1.67 × 10-5 接合子/受体菌

LMB100使用羧苄西林筛选的 SW4955 菌株接合子接合效率
稀释倍数菌落形成单位（可计数平板）约 CFU/mL菌落形成单位（可计数平板）
100菌苔状生长1.03E+09
10-1菌苔状生长1.03E+08
10-2菌苔状生长103000001721.67 x 10-5 接合子/受体菌
10-3菌苔状生长1030000
10-4菌苔状生长103000
10-5菌苔状生长10300
10-6菌苔状生长1030
10-7103103
用于计算接合效率（CE）的数值以粗体标出。

表4：以菌株SW4955为例说明如何计算偶联效率（CE）。

结果如表5所示，以每个受体细胞的接合效率表示。使用菌株SW4955作为供体获得的五个接合效率均处于同一数量级。这些结果表明，无论采用何种筛选方法来鉴定接合子，均可检测到接合质粒的转移能力。

以菌株SW7037作为供体时，接合效率降低了三个数量级；这些结果可用于比较不同供体和质粒类型在相同受体中的接合效率。

接合效率
菌株羧苄西林 (100 mg/L)庆大霉素 (2 mg/L)氯霉素 (25 mg/L)四环素 (10 mg/L)甲氧苄啶 (20 mg/L)
SW49551.67 × 10-55.67 × 10-52.17 × 10-57.62 × 10-51.36 × 10-5
SW70372.14 × 10-6

表5：偶联效率 E. coli 供体菌株 SW4955 和 SW7037，取决于 用于筛选的抗生素

在接合子中，通过PCR检测了两种被测接合质粒及其相应复制子所携带的所有复制子和耐药基因的存在情况。这些诊断性PCR反应所用的条件见表3。

诊断性凝胶电泳结果见 图4。这些凝胶证实了在接合子中存在预期的复制子（p1347975中的IncFIC和IncFIB，以及p101718中的IncI1）。同时也证实了预期的抗生素耐药基因的存在，即p1347975中含有blaCTX-M-55组（β-内酰胺类）、aac(3)-II和aadA（氨基糖苷类）、catA2（氯霉素类）、tet(A)（四环素类）、dfrA14（甲氧苄啶类）以及sul3（磺胺类）基因，而p101718中含有blaCMY-2 基因（图4）。

Agarose gel electrophoresis showing DNA ladder and band patterns for antibiotic resistance gene analysis.
图4诊断性电泳凝胶 供体细胞（菌株SW4955和SW7037，分别含有接合性质粒p134797和p101718）及相应LMB100转接合子中抗生素抗性基因和质粒复制子的PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析。使用羧苄西林进行质粒筛选。缩写：-：阴性对照（使用菌株LMB100的DNA作为阴性对照）；D：供体；T：转接合子。预期扩增片段大小： blaCTX-M-55：864 bp； aac(3)-IIa：237 bp； aadA1: 283 bp； catA2 225 bp; tet(A)：957 bp； dfrA14：302 bp； sul3：799 bp；IncFIC(FII)：262 bp；IncFIB：683 bp blaCMY-2：1,855 bp；IncI1-I：139 bp。凝胶含1%琼脂糖。 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

接合质粒通过重组和水平基因转移，使得细菌能够在特定环境条件下获取一个共有的基因库34。因此，接合质粒是一类具有进化能力的实体，可在数小时内获得并赋予细菌多种功能，使其适应多种环境条件（包括对抗生素的抗性、对金属的抗性、金属的获取、生物膜形成以及致病基因等）。

本研究提出了一种用于鉴定细菌中接合质粒的实验方案。该方案的成功实施依赖于所用标记能够有效区分供体菌株和受体菌株，如培养基A和B中的对照所示。这些标记还需能够有效筛选出携带质粒的细胞。接合反应至关重要，在此过程中，供体与受体必须通过菌毛进行长时间的细胞间接触，才能实现质粒的转移。任何可能破坏细胞间接触的因素，例如孵育时间不足，或对培养物进行振荡或搅拌，均会降低接合效率。受体菌株的选择同样关键，因为某些受体菌株对接合过程具有抗性35,36。LMB100被推荐为首选受体菌株，因其能够接收多种不相容性类型的质粒。

接合率因质粒-供体染色体组合、受体及环境条件的不同而异。已发现特定质粒的接合过程对多种变量敏感，包括生长阶段、细胞密度、供体与受体比例、接合是在液体还是固体培养基中进行、碳源、氧气、胆盐、金属离子浓度、哺乳动物细胞的存在与否、温度、pH值以及接合时间13,14,15。对这些相互作用的研究依赖于首先检测到可深入研究的接合性质粒。因此，本文所述方案也可修改用于探究不同实验变量的影响，尽管这会限制被筛选供体的数量。该方法还可用于鉴定携带辅助性质粒的宿主中的可移动质粒（即 能够通过反式提供可移动质粒所缺失的功能从而促进其接合的质粒in trans6）。

建议了解接合质粒的序列（但如上所述，检测接合现象并非必须）。当供体菌为乳糖阴性（在麦康凯琼脂上形成黄色菌落）时，可使用乳糖阳性受体菌（在麦康凯琼脂上形成粉红色菌落）来区分真正的接合子与能够在筛选接合子的培养基上生长的供体菌。此处描述的方案旨在检测肠杆菌科（Enterobacteriaceae）中环境来源、共生或致病成员的接合质粒；然而，该方案也可用于其他任何具有合适供体、受体、抗生素和颜色标记的细菌种类。在其他细菌中鉴定这些关键组分需要采用多个供体、受体和标记（抗生素和颜色）进行系统的研究所。本方案尚未在革兰氏阳性菌中进行测试。

文献中已报道了本方法的多种变体，近期已有综述20。定性结果也可用不同方式表述（例如，接合子频率和基因转移频率），接合效率可用无量纲单位（mL/CFU × h）表示20。

本文所述方案解决了现有方法此前未能解决的若干局限性16,18,19,20。首先，已确定了合适的受体菌株。其次，通过使用两种抗生素（利福平和链霉素）筛选真正的接合子，可最大限度地降低供体菌因自发突变而对用于筛选接合子的其中一种抗生素产生耐药性的可能性。此外，假阳性接合子也可能源于旁观者保护效应，即供体菌大量产生的酶（如β-内酰胺酶）水解用于筛选接合子的抗生素所致。第三，本方案包含多个实验对照，以确保接合反应的产物为真正的接合子（即已稳定整合供体接合质粒的受体细胞）。本文提供了两种独立的方法来验证接合子的真实性：一是利用麦康凯琼脂中的显色标记，二是通过PCR检测受体菌中接合质粒的复制子及抗生素抗性基因。此外，本文所述方案旨在从肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的环境菌、共生菌和致病菌成员（如大肠杆菌 Escherichia、克雷伯氏菌 Klebsiella、肠杆菌 Enterobacter、柠檬酸杆菌 Citrobacter、沙门氏菌 Salmonella、志贺氏菌 Shigella 及其他物种）中分离和鉴定接合质粒。

为了理解接合作用的机制，研究人员已通过计算机模拟对实验观察结果进行建模。这些预测模型可估算在给定的供体、受体和接合子生长密度条件下的质粒转移频率。一种称为终点模型（endpoint model）的模型发现了液体培养中质粒转移率的阈值，并得出结论：当超过该阈值后，质粒转移速率不受 细胞密度、供体与受体比例以及接合时间的影响19。荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）已被用作检测接合子中质粒的替代方法。FISH 通过 DNA 探针与靶 DNA 的杂交，利用荧光显微镜实现对质粒的可视化观察。因此，FISH 可实现对不同细胞群体间质粒流动的直观检测37，但如果通过肉眼筛选而非选择性培养来鉴定接合子，则其灵敏度不及本文所述方法。

迫切需要深入了解接合性质粒的生物学特性，这些质粒正在生态系统各个组成部分（临床环境、农业、污水、野生动物、家养动物、土壤、河流和湖泊）中传播抗生素抗性基因。总之，本文所述方案中提供的简化实验条件有助于大规模筛选供体菌，因此成为研究来源于多种来源接合性质粒的水平基因转移的关键工具。这些方法可用于调查来自不同来源和细菌的接合性质粒中抗生素抗性基因或其他临床相关基因的流行情况，也可被调整用于接合转移的研究。 体内 （例如在脊椎动物肠道中）研究调控接合效率的条件。这些研究将极大增进我们对接合型多药耐药质粒的移动性如何促进多药耐药性传播的理解。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LM-B、IMG、AT 和 IS 获得了由 NIH 基金 GM055246（授予 LM-B）的支持。GC-C 连续两年获得了加州大学墨西哥与中美洲研究中心（UC MEXUS）-墨西哥国家科学技术委员会（CONACYT）博士后奖学金：2017-18 学年和 2018-19 学年。我们衷心感谢由基因泰克基金会（Genentech Foundation）资助的学术启迪网络（GAIN）导师项目的学生 Sage Chavez 和 Pepper St. Clair 在实验中提供的技术支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 离心管架Thermo Fisher Scientific22-313630可替换为其他品牌
2.0 mL 冻存管Corning430659可替换为其他品牌
14 mL 锥形离心管FALCON149597可替换为其他品牌
14 mL 管架Thermo Fisher Scientific8850可替换为其他品牌
1 kb DNA MarkerNew England BiolabsN0552G 
250 mL 无菌烧瓶 PYREX5320可替换为其他永久性记号笔品牌
乙酸Fisher ScientificA38SI-212可替换为其他品牌
琼脂糖（分子生物学级，多用途）Fisher ScientificBP160-500可替换为其他品牌
羧苄青霉素GOLD BIOTECHNOLOGYC-103-50可替换为其他品牌
一次性接种环：1 µLFisherbrand22-363-595可替换为其他品牌
DNA 凝胶上样缓冲液 6x New England BiolabsB7024S可替换为其他品牌
EDTAFisher ScientificBP119-500可替换为其他品牌
电子天平Denver InstrumentAPX-2001可替换为其他品牌
Eppendorf 锥形离心管：1.5 mLEppendorf14-282-302可替换为其他品牌
琼脂糖凝胶电泳设备Fisher ScientificFP300可替换为其他品牌
耐乙醇记号笔Sharpie37001; 37002; 37003可替换为其他品牌
凝胶成像系统（UVP GelSolo）AnalytakjenaSP-1108; 849-97-0936-01; 95-0612-01可替换为其他品牌
手套X-GEN44-100M任何品牌的腈手套均可使用
冰桶Thermo Fisher Scientific432128可替换为其他品牌
麦康凯琼脂 BD DIFCO212123
Master Mix BioLabsM0496S 可替换为其他品牌
甲醇Fisher ScientificA452-4可替换为其他品牌
微量离心管：2.0 mLFisherbrand05-408-138可替换为其他品牌
穆勒-欣顿琼脂BD DIFCODF0479-17-3
穆勒-欣顿肉汤BD DIFCO275730
NucleoSpin 质粒小量提取试剂盒（用于质粒DNA）Takara Bio USA, Inc., MACHEREY-NAGEL740588. 250
PCR 管架AXYGEN  R96PCRFSP可替换为其他品牌
PCR 管（0.2 mL）AXYGEN PCR-02-C可替换为其他品牌
利福平Fisher Scientific50-164-7517
一套可分别移取 1 - 10 μL（P10）、2–20 μL（P20）、20–200 μL（P200）和 200–1000 μL（P1000）的移液器RAININ17008648; 17008650; 17008652; 17008653移液器应经过校准；可替换为其他品牌
氯化钠Fisher ScientificS671-3可替换为其他品牌
分光光度计Thermo Scientific335905P可替换为其他品牌
用于 10 μL、200 μL 和 1000 μL 的无菌吸头 Eclipse1011-260-000-9; 1018-260-000; 1019-260-000-9可替换为其他品牌
链霉素Fisher ScientificBP910-50
SYBR Safe DNA 凝胶染料 Thermo Fisher ScientificS33102
Taq DNA 聚合酶BioLabsM0273S
Thermal Cycler C1000 Touch Bio-Rad1851196可替换为其他品牌
Tris Fisher ScientificBP153-500可替换为其他品牌

参考文献

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