使用急性淋巴细胞白血病患者来源的异种移植小鼠模型评估嵌合抗原受体T细胞相关毒性

Summary

在这里，我们描述了一种方案，其中使用急性淋巴细胞白血病患者来源的异种移植模型作为评估和监测CD19靶向嵌合抗原受体T细胞相关毒性的策略。

Abstract

嵌合抗原受体T（CART）细胞疗法已成为治疗多种CD19⁺ 恶性肿瘤的有力工具，这导致FDA最近批准了几种CD19靶向CART（CART19）细胞疗法。然而，CART细胞疗法与一组独特的毒性有关，这些毒性具有自己的发病率和死亡率。这包括细胞因子释放综合征（CRS）和神经炎症（NI）。临床前小鼠模型的使用在CART技术的研究和开发中至关重要，用于评估CART功效和CART毒性。测试这种过继细胞免疫疗法的可用临床前模型包括同系、异种移植、转基因和人源化小鼠模型。没有单一的模型可以无缝地反映人体免疫系统，每个模型都有优点和缺点。本文旨在描述一种患者来源的异种移植模型，该模型使用急性淋巴细胞白血病患者的白血病原始细胞作为评估CART19相关毒性，CRS和NI的策略。该模型已被证明可以概括CART19相关的毒性以及临床上看到的治疗效果。

Introduction

嵌合抗原受体T（CART）细胞疗法彻底改变了癌症免疫治疗领域。它已被证明可成功治疗复发/难治性急性淋巴细胞白血病 （ALL）、大 B 细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和多发性骨髓瘤 1,2,3,4,5,6,7^，最近获得了 FDA 的批准。尽管在临床试验中取得了初步成功，但CART细胞疗法的毒性通常很严重，偶尔会致命。CART细胞治疗后最常见的毒性包括CRS和NI的发展，也称为免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）^8,9。CRS是由于CART细胞在体内的过度活化和大量扩增引起的，导致随后分泌多种炎性细胞因子，包括干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白细胞介素-6（IL-6）。这会导致低血压、高烧、毛细血管渗漏综合征、呼吸衰竭、多器官衰竭，在某些情况下会导致死亡

Protocol

本协议遵循妙佑医疗国际机构审查委员会 （IRB）、机构动物护理和使用委员会 （IACUC A00001767） 和机构生物安全委员会 （IBC， Bios00000006.04） 的指南。

注意:用于小鼠的所有材料必须是无菌的。

1.向NSG小鼠注射白消安

1. 获得雄性，8-12周龄，免疫功能低下，NOD-SCID IL2rγnull（NSG）小鼠，并在注射前称重。
   注意:为了统计显着性，建议每组至少使用五只小鼠，并至少对雌性小鼠重复该实验一次。
2. 准备用于腹膜内（ip.p.）注射的白消安。使用1mL胰岛素注射器，缓慢而小心地向注射器填充30mg / kg的白消安，然后腹腔注射到小鼠身上，并将它们放回笼子中。

2.向NSG小鼠注射所有患者来源的原始细胞（CD19 ⁺）

注意:本协议遵循妙佑医疗国际机构生物安全委员会（IBC，Bios00000006.04）的指南。

1. 从复发和难治性 ALL 患者的外周血中收集原发性白血病原始细胞。
2. 准备用于静脉（静脉注射）注射的靶细胞。
   1. 使用血细胞计数器计数CD19 ⁺

Results

该协议的目的是使用来自ALL患者肿瘤细胞的PDX小鼠模型评估CART细胞相关毒性（图1）。首先，NSG小鼠接受腹膜注射白消安（30mg / kg），目的是免疫抑制它们并促进CART细胞植入²⁸。第二天，他们收到了来自所有患者的~5×10⁶ 个PBMC（IV）。通过尾部出血测定 监测 小鼠的植入~13周。收集并裂解红细胞，然后进行流式细胞术制备以评估CD19 ⁺ 肿瘤细胞的表达（图2）。

一旦小鼠达到≥10个肿瘤细胞/ μL，它们被随机分配并准备接受4×10⁶个CART19细胞（IV）。为了评估CART19相关的毒性，每天称量小鼠一次（图3A）。体重减轻被选为CRS外观的症状，因为之前已经发现它与CART细胞相关的毒性有关^28,37

Discussion

在本报告中，描述了一种使用 ALL PDX 模型评估 CART 细胞相关毒性的方法。更具体地说，该模型试图模仿两种危及生命的毒性，CRS和NI，患者在输注CART细胞后经常经历。它概括了在临床上观察到的CART毒性的许多特征:体重减轻，运动功能障碍，神经炎症，炎性细胞因子和趋化因子产生，以及不同效应细胞浸润到中枢神经系统8,20,28。以前，该PDX模型已被用于模拟CRS和NI的初始发展（表1），并评估毒性预防和治疗的不同策略。该PDX模型中的一项研究使用了耗尽GM-CSF的CART19细胞。更具体地说，这些结果表明GM-CSF耗竭导致CRS连接的细胞因子和趋化因子的分泌减少，使用ALL PDX小鼠模型²⁹清楚地证明了这一点。该PDX模型还已成功用于评估使用碘化钠共转运体（NIS）作为成像平台²⁶输注CART19细胞后与CR.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC 抗人 CD19	Biolegend	302211
酒精制备垫	Wecol	6818
Analyze 14.0 软件	AnalyzeDirect Inc.	N/A	https://analyzedirect.com/analyze14/
人工泪液（矿物油和凡士林）	Akorn	17478-062-35	防止眼睛干涩的外用眼部凝胶
BD FACS 裂解液	BD	349202	红细胞裂解缓冲液
BD Micro-Fin IV 胰岛素注射器	BD	329461
Brillian Violet 421 抗人 CD45	Biolegend	304032
Bruker Avance II 7 Tesla	Bruker Biospin	N/A	MRI 机器
白消安 （NSC-750）	Selleckchem	S1692
CountBright 绝对计数珠	Invitrogen	C36950
CytoFLEX 系统 B4-R2-V2	Beckman Coulter	C10343	流式细胞仪
Dulbecco's 磷酸盐缓冲盐水	Gibco	14190-144
ERT 控制/门控模块	SA Instruments	1030 型	小动物监测呼吸和门控系统胎
牛血清	Millipore Sigma	F8067
血球计数板	Bright-Line	Z359629-1EA
人 AB 血清;男性捐献者;AB 型;美国	康宁	35-060-CI
异氟醚（液体）	Sigma-Aldrich	792632
LIVE/DEAD 可固定水死细胞染色试剂盒，用于 405 nm 激发	Invitrogen	L34966
Microvette 500 肝素锂	Sarstedt	20.1345.100	采血管
MILLIPLEX Huma/细胞因子/趋化因子磁珠检测组合	Millipore Sigma	HCYTMAG-60K-PX38	免疫学多重检测，用于鉴定细胞因子和趋化因子
Omniscan	Ge Healthcare Inc.	0407-0690-10	钆基抗
凝剂 Pd 抗小鼠 CD45	Biolegend	103106
青霉素-链霉素-谷氨酰胺 （100x），液体	Gibco	10378-016
圆底聚苯乙烯试管	康宁	352008
叠氮化钠，5% （w/v）Ricca	Chemical	7144.8-16
不锈钢外科Blade	Bard-Parker	371215
X-VIVO 15 无血清造血细胞培养基	Lonza	04-418Q