微创技术与简易实验装置通过减少对实验动物的手术损伤并维持解剖形态，提高了脊髓损伤模型的可重复性。该方法具有重要价值，因为可靠的结果和可重复的操作流程有助于深入研究疾病修复的机制。
本文内容
摘要
摘要
采用微创方法建立脊髓损伤（SCI）模型可以减少实验动物之间的行为学和组织学差异，从而提高实验的可重复性。
这些方法需要满足两个条件：手术解剖路径的清晰性，以及实验设备的简便性和易用性。对操作者而言，清晰的解剖路径至关重要，它可实现微创暴露，避免手术过程中对实验动物造成额外损伤，并确保动物在实验期间保持一致且稳定的解剖形态。
本研究探讨了一种名为SCI同轴平台的新型集成化装置在小型动物脊髓损伤模型中的应用，该装置可通过微创方式暴露小鼠T9节段脊髓，并利用椎体稳定器对小鼠椎体进行固定与稳定，最后采用同轴重力打击器对小鼠脊髓进行挫伤，以实现不同程度的T9脊髓损伤。最后，提供了组织学结果供读者参考。
引言
创伤性脊髓损伤（SCI）极易导致患者出现严重后果1；然而，目前尚无有效的治疗方法1,2。动物挫伤模型是研究脊髓损伤的主要方法之一3,4。
2004年至2014年间4，在407项研究中有289项（71%）使用大鼠作为模式生物，69项（16.9%）使用小鼠。事实上，由于小鼠在基因调控研究方面具有显著优势，近年来使用小鼠开展实验的比例逐渐增加3,4,5。因此，鉴于模型一致性的重要性，迫切需要开发更兼容的工具，以支持更多基于小鼠模型的研究6。以往研究中报道的常用装置基本基于Allen脊髓撞击原理，例如基础重物下落撞击器7,8、纽约大学（NYU）/多中心动物脊髓损伤研究（MASCIS）撞击器1,9以及Infinite Horizon（IH）撞击器10,11。重物下落撞击器与NYU/MASCIS撞击器均采用相同的原理，即对准目标脊髓部位，从不同高度释放固定重量的重物，以造成不同程度的损伤。而IH撞击器则是通过施加不同的撞击力来建立脊髓损伤模型。
为了方便在脊髓损伤（SCI）研究中使用小鼠模型，并为建立有效的治疗方法奠定基础，开发了一种集成式小鼠脊髓冲击损伤平台，称为脊髓损伤同轴平台（SCICP）。该平台由四个主要部分组成：（1）专为手术小鼠设计的动物手术台，可提供适宜的体位，结构紧凑，操作方便且不受体位限制；（2）两侧配备的微型牵开器，用于手术过程中固定椎旁肌；（3）脊柱稳定器，用于在SCI操作前固定椎体（另配有两款适用于大鼠等较大动物的脊柱稳定器）；（4）套管、撞击头、砝码和拉销。上述三个部分应组装成一个可拆卸的X-Y-Z调节臂。为实现精确定位，将撞击头置于脊髓表面，并借助撞击头与套管之间的标记，缓慢下降X-Y-Z臂至预定高度。撞击头由0.12 g的铝合金制成，以避免因术前重量过大压迫而损伤脊髓。拉销用于在套管顶部固定砝码，以准备进行落锤冲击（图1）。
在既往研究中，冲击力的划分依据IH装置记录的冲击力数据，分别为30 Kdyn、50 Kdyn和70 Kdyn6,10。在研究过程中，已证实可根据脊髓损伤分类标准（SCICP）建立一系列不同程度的脊髓损伤（SCI）模型，并可用于多种研究。因此，在正式开始实验前，使用峰值压力测试装置检测了不同质量重物所产生的冲击力。结果选取三种标准化的代表性SCI小鼠模型作为不同程度的损伤，分别对应轻度、中度和重度损伤组6,10，重物从相同高度下落，其中轻度损伤使用1.3 g重物，中度损伤使用2.0 g重物，重度损伤使用2.7 g重物。
作为确保可操作性和准确性的另一种方法，本文报道了一种新颖且微创的手术入路。通过研究正常小鼠的解剖结构，发现了一种定位T12-T13棘突间隙的新方法。该手术步骤中的椎体定位方法易于掌握且准确，可确保微创手术的精确定位。
希望这种挫伤损伤技术能够促进脊髓损伤的研究与理解，包括病理生理学机制的阐明、治疗方案的评估等。
方案
注意：所有实验均经山东大学齐鲁医学院实验动物伦理与福利委员会批准（批准编号：21L60），并依照美国国立卫生研究院（NIH 出版物 No. 85-23，1996 年修订版）发布的《实验动物护理和使用指南》进行。
1. 脊髓损伤同轴平台的机制与力学测试
- 组装平台，包括手术操作台、脊柱稳定器和撞击头（图1）。
注意：保持重物下落通道和排气槽清洁，以防止重物受到气流干扰；重物下落通道或套管上的任何污物都可能影响平台的精确性。 - 将用于精确定位脊髓的撞击头插入套管中。
- 根据实验需要选择合适的重物质量，轻度、中度和重度损伤组分别使用1.3 g、2.0 g和2.7 g的重物。
- 将拉销插入重物的孔中。
- 将带拉销的重物装配到套管顶部，并使拉销卡入X-Y-Z臂的凹槽内，以便在定位完成后释放重物，使其撞击撞击头，从而造成脊髓挫伤，并在显微镜下观察脊髓的变化。
- 调节可移动的0.1 mm精度X-Y-Z臂，以方便操作者获得足够的操作空间（图1D、E）。
注意：为确保研究结果的一致性，在实验开始前，应使用峰值压力检测装置测量重物在套管内下落时产生的冲击力；后续研究中无需重复此确认步骤。 - 打开设备，将金属压力感受器置于撞击头下方，对适配器调零，释放拉销，并记录实际的冲击力。
2. 第9节的定位与椎板切除术th 胸椎（T9）
注意：9-10周龄的雌性C57BL/6J小鼠购自济南朋悦实验动物有限公司（中国济南）。
- 将实验所需的一套手术器械进行高压灭菌，并在手术前用75%酒精对手术台进行消毒。
- 在进行损伤手术前30分钟，皮下注射布托啡诺（0.05–2.0 mg/kg，SQ）以进行镇痛。随后使用异氟烷对小鼠实施麻醉（诱导浓度：约3%–5%，维持浓度：约1.5%–2%）。通过尾部或脚趾夹捏反射判断动物是否已完全麻醉。确认麻醉生效后，将小鼠俯卧位固定于手术台指定位置，并在角膜上涂抹眼用软膏（将眼用软膏涂抹于角膜以防止术中眼睛干燥）。
- 从尾侧向头侧用电剃须刀剃除胸腰段脊柱区域的毛发。多次消毒皮肤 以碘伏环形擦拭30秒，随后 75% 酒精。铺无菌手术巾，使用手术刀片在皮肤上从约T6至T13水平做一长约1.5 cm的纵行切口。
注意：沿肋缘触诊至中线，此处为T12-T13棘突间隙。在头侧做一1.5 cm切口，切口位置大致与T6-T13椎体平齐。
- 从尾侧向头侧用电剃须刀剃除胸腰段脊柱区域的毛发。多次消毒皮肤 以碘伏环形擦拭30秒，随后 75% 酒精。铺无菌手术巾，使用手术刀片在皮肤上从约T6至T13水平做一长约1.5 cm的纵行切口。
- 从骨性部分开始，在手术显微镜下探查一侧的第13肋。通过轻触肋椎角区域并朝头侧移动，探查中线处的棘突，以定位T12-T13棘间间隙。从T12-T13间隙向头侧探查，找到T9-T10棘间间隙。图2A，3A)
- 沿T9棘突使用显微剪刀解剖双侧前方和后方小关节的椎旁肌图3B用微型牵开器牵开椎旁肌，使用显微剪清除T8-T9和T9-T10椎板及棘突间隙中的软组织。
- 进行T9椎板切除术，用显微手术镊夹住T9棘突，轻轻抬起，将显微剪刀沿右侧背外侧椎板平行插入，避免损伤脊髓，用显微剪刀剪除椎板。同法操作左侧，即可暴露脊髓。图2B，3C).
- 在固定椎骨之前，先松开万向臂，然后缓慢夹紧第9至第10椎骨 用脊柱稳定器上的微型蚊式钳夹住椎骨两侧的关节突关节。拧紧微型蚊式钳上的螺丝，从而稳定椎骨。调整脊髓至水平面，拧紧万向臂，椎骨即被固定。图3D).
3. T9 挫伤损伤
- 暴露T9水平脊髓并固定椎骨后，在手术显微镜下将套管内的撞击头尖端对准脊髓（图3E）。
- 从脊髓的后方和侧方观察，检查撞击头尖端表面是否与脊髓平行，因为在显微镜下易于观察脊髓与尖端之间的关系，且手术台可轻松旋转调整。
- 在切除椎板后、撞击头接触脊髓前，检查其尖端表面是否与保留的椎板双侧边缘平行，因该结构提供了一个自然的参考平面，与脊髓平行。
- 定位T12-T13棘突间隙后，缓慢下放套管，直至撞击器末端与观察窗上的标记对齐，并达到设定高度22 mm。拔出拉销以释放坠落砝码（根据实验分组使用1.3 g、2.0 g或2.7 g砝码，每组3只小鼠，每个时间点各1只）。
注意：脊髓应与地面平行，并与撞击头垂直；由于设备结构紧凑，需移动手术台以确保显微镜视野清晰。 - 挫伤完成后移除撞击器，并在手术显微镜下观察脊髓损伤程度。轻度损伤组可见轻微的淡红色改变；中度损伤组在3–4秒内出现暗红色表现，可能伴有轻微隆起；重度损伤组则立即呈现明显暗红色，硬膜出现显著隆起，但整体形态仍保持完整（图3F）。
- 使用缝线（聚丙烯不可吸收缝线，规格：6-0）缝合浅筋膜和皮肤。
- 缝合完成后对手术区域进行消毒，将小鼠置于温控垫上直至完全清醒，随后转移至小鼠饲养笼中。
4. 动物护理
- 将动物放置于加热垫上以恢复，并观察双侧后肢的运动情况。
注意：接受手术的动物在完全恢复前不应放回与其他动物同笼饲养。 - 将高水分饮食置于笼底，以便动物能轻松取食。或者，使用带有较低饲喂台的笼具。
- 术后每天两次排空小鼠膀胱，因为中度和重度损伤组的动物膀胱功能恢复较为困难。术后3天内，每日8–12小时皮下注射布托啡诺进行镇痛（0.05–2.0 mg/kg，SQ）。
5. 经心灌注、染色和免疫染色
- 在损伤后的第1、28和56天，分别通过灌注法处死每组一只小鼠。
- 用过量麻醉剂（4%–6% 异氟烷）麻醉小鼠后，依次灌注 60 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）和 20 mL 4% 多聚甲醛。
- 用显微剪刀采集病灶中心头侧和尾侧各延伸1厘米的脊柱组织。
- 切除多余肌肉，保留带有部分肋骨的完整脊柱节段，以便在步骤5.1.4中用于器械夹持，并将其浸泡于4%多聚甲醛中固定24小时。
- 使用止血钳夹住肋骨以固定，并在显微镜下根据已切除的椎板及脊髓病变中心的颜色改变确定病变中心位置。
- 从尾侧使用显微剪刀切除所有椎板和关节突。
- 用显微剪刀剪断神经根并取出脊髓。
- 用显微剪刀分别从损伤中心向尾侧和头侧各取0.5 cm的脊髓组织。
- 将脊髓置于4 ˚C的30%蔗糖溶液中48小时。
- 根据组织学检查类型，将组织冷冻后切成6 µm厚的切片。
- 进行苏木精-伊红（H&E）染色&E) 染色。
- 将切片复温至室温，然后将6 µm厚的切片浸入4%多聚甲醛中固定约15分钟，随后用1x PBS浸泡1分钟，重复四次，以去除残留的OCT包埋剂。
- 用苏木精染色90秒，然后用双蒸水冲洗。
- 然后，用流水冲洗切片3分钟。
- 用伊红染色4分钟，然后用95%乙醇浸泡30秒，重复两次以洗去多余的伊红。
- 最后，用梯度酒精（依次为95%酒精和50%酒精各一次）脱水30秒，再浸入二甲苯中透明2分钟。然后用树脂胶封片（冠状面切片： 图4；矢状面切片： 图5).
- 进行免疫荧光染色。
- 将切片复温至室温，并将6 µm厚的切片浸入4%甲醛中约2分钟。
- 用 TBST 洗涤切片，每次 5 分钟，共洗三次。
- 用封闭液（PBS 中含 10% 正常山羊血清）孵育切片，室温封闭 1 小时，以阻断免疫球蛋白的非特异性结合。
- 在 4 ˚C 下，将脊髓切片与小鼠抗胶质纤维酸性蛋白抗体（GFAP，活化星形胶质细胞的标记物），多克隆抗体（1:600），以及兔抗 NF200 抗体（1:2000，神经丝蛋白的标记物）共同孵育过夜，孵育体积为 0.4 mL 阻断液。
- 用 PBS 清洗切片，然后加入 0.4 mL 封闭液，其中含山羊抗兔 Alexa 594 标记的 IgG（1:1,000）和山羊抗小鼠 Alexa 488 标记的 IgG（1:1,000）二抗，室温孵育 1 小时。
- 使用荧光显微镜在10倍放大倍数下，分别于594 nm和488 nm波长处通过自动全景扫描拍摄图像（图6).
- 打开荧光显微镜，将玻片放置在显微镜载物台上，切换至荧光通道，使用定位键在组织上定位三到四个点，并调焦以完成拍摄。拍摄完成后，以所需格式保存各通道的图像，然后保存合并后的图像。
结果
为测试该装置的精确性，使用峰值压力测试仪测量了从相同高度下落的三种不同质量砝码所产生的力。共进行了24次测试，使用不同组的砝码，测得结果分别为（均值 ± 标准差）：1.3 g 砝码为 0.323 N ± 0.02 N，2.0 g 砝码为 0.543 N ± 0.15 N，2.7 g 砝码为 0.723 N ± 0.26 N（图7）。以往研究采用达因（dyn）或千达因（Kdyn）作为单位来测量挫伤强度。为了便于与以往研究进行比较，列出了牛顿（N）与达因/千达因之间的换算关系（1 N = 1 kg × 1 m/s2 = 1 × 103 g × 1 × 100 cm/s2 = 1 × 105 dyn；0.323 N = 32.3 Kdyn；0.543 N = 54.3 Kdyn；0.723 N = 72.3 Kdyn）。
表1 和 图4 展示了轻度、中度和重度组在冠状切面上病灶的数据。从 图4 可以看出，伤后第28天，轻度、中度和重度组可辨别的灰质与白质边界连续性依次降低，瘢痕组织面积逐渐增大，在病灶中心横截面上所占比例也逐渐增加。所有实验组与正常组相比均存在明显的形态学差异。这证明了实验组损伤程度划分的合理性。
表2 和 图5 描述了损伤后第1天和第56天矢状切面上脊髓的损伤情况。可以看出，在损伤后第1天，从轻度到重度组，病灶面积逐渐显著增大。同时，轻度组脊髓两侧白质的连续性较好，可见少量圆形空泡，为空隙性水肿的特征。中度组白质连续性较差，腹侧白质结构排列紊乱。重度组腹侧白质破坏更为严重，损伤中心出现较大范围的空腔。此外，周围组织可见明显的红细胞填充，靠近中央管的红细胞呈条带状聚集。损伤后第56天，三组损伤中心均可见瘢痕形成，其面积随损伤严重程度增加而增大。
损伤后第56天，脊髓神经丝的完整性也可通过免疫荧光染色结果的分析得出（图6）。该图还显示，在所有三组损伤的中心区域均可见重叠的成瘢星形胶质细胞，损伤区域的长度随损伤严重程度增加而增加，而瘢痕直径则减小。这提示存在瘢痕收缩现象，可能导致脊髓直径减小。
图1：脊髓损伤同轴平台的整体结构及部件展示。（A）X-Y-Z机械臂与手术台可分离，为暴露小动物脊髓的手术操作提供了充足空间。术中可自由移动手术台，减少因位置受限带来的操作困难。椎体稳定器本体配备三节万向臂以辅助方向调节，提高了灵活性。（B）将撞击头插入套管中，并将套管组装至X-Y-Z机械臂上。将拉销插入配重块的孔中以防止其下落，随后将配重块置入套管内。完成部件组装后，在显微镜下定位目标损伤区域。然后降低X-Y-Z机械臂，直至撞击头末端与观察窗下缘齐平，表明已达到统一的挫伤高度（下落开始时，配重块与撞击头之间的高度为22 mm）。拔出拉销，即可完成撞击。（C）暴露损伤区域后，使用夹具夹紧并固定小鼠脊柱，并用紧固螺栓稳定椎体稳定器。（D）手术台上沟槽的推荐功能布局：实验动物应置于中央沟槽中，头部朝向前端，胸部位于斜坡上。X-Y-Z机械臂与手术台分离。（E）组装完成的脊髓损伤同轴平台（SCICP）示意图。箭头指示各部件位置。当撞击头对准目标挫伤区域后，抽出拉销，配重块即下落至撞击头，从而对脊髓造成挫伤。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：T13 肋椎关节定位方法的影像示意图。（A）第13肋和T13是相对恒定的解剖结构。T13肋椎角可在显微镜下轻松识别，操作者可由此向棘突方向探查，找到T12-T13棘突间隙。随后依次向头侧探查，以确定目标损伤椎体（例如T9）。（B）微创第9胸椎椎板切除术可保留相邻椎体间足够的椎板和关节突关节。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：小鼠T9节段脊髓的暴露与挫伤。（A）探查T13肋椎角。（B）使用微型牵开器牵开椎旁肌，为手术操作提供足够空间，暴露T9节段。（C）使用显微剪刀进行T9椎板切除术。（D）使用脊柱稳定器的夹具固定椎体。（E）将撞击器尖端对准目标挫伤区域。（F）挫伤后，损伤区域出现水肿和充血。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：小鼠不同程度脊髓损伤后第28天的代表性切片（冠状切面）。（A）小鼠正常的胸段脊髓。比例尺 = 500 µm。（B）轻度损伤组中，脊髓背侧可见轻微损伤，但保留的白质和灰质形态基本完好。（C）中度损伤组中，脊髓内可见明显瘢痕组织（红色星号标示），白质与灰质之间的分化特征几乎无法分辨。（D）相比之下，重度损伤组的脊髓几乎丧失原有形态，大部分区域已被瘢痕组织取代。绿色虚线表示损伤区域，黑色虚线表示可观察到的灰质边界。随着损伤程度加重，小鼠脊髓内的病灶范围增大，保留结构减少，灰质边界几乎难以分辨。请点击此处查看该图的放大版本。
图5：小鼠脊髓损伤后第1天和第56天的代表性切片（矢状切面）。（A）正常小鼠胸段脊髓。（B）B1-B3 分别代表轻度、中度和重度损伤组在损伤后第1天的脊髓情况。可见随着损伤程度加重，损伤中心区域的组织破坏或液化范围更大。腹侧脊髓白质的连续性因损伤强度不同而存在差异。B1 显示腹侧脊髓白质连续性较好，仅有轻微水肿；B2 显示腹侧脊髓白质连续性较差，且水肿更严重；B3 的脊髓损伤中心组织几乎完全丧失连续性，损伤中心区域外也出现广泛水肿。（C）C1-C3 分别代表轻度、中度和重度损伤组在损伤后第56天的脊髓情况。不同组别在损伤中心表现出不同程度的瘢痕收缩，损伤区域的直径存在显著差异。比例尺 = 500 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：小鼠脊髓损伤后第56天的代表性切片（矢状面切片）。（A）轻度组代表性切片。NF200标记神经丝蛋白，GFAP标记星形胶质细胞。在损伤中心可见星形胶质细胞重叠分布，而脊髓腹侧的神经丝蛋白结构保持良好连续性。（B）中度组代表性切片。除重叠的星形胶质细胞外，可见两个瘢痕中心（红色星号标示），脊髓腹侧的神经丝蛋白仍具有一定连续性。（C）重度组代表性切片，显示较大的损伤范围和大量形成瘢痕的星形胶质细胞。未见明显的瘢痕中心，神经丝蛋白连续性差。比例尺= 500 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图7：从相同高度下落但重量不同时产生的冲击力。 实验前，使用峰值压力检测装置检测了从相同高度释放的不同质量砝码所产生的冲击力。每组完成24次检测后，获得了更可靠的重力数据，用于参考冲击力的大小。数据采用统计软件SPSS 19.0进行分析。数据以均值±标准差（mean ± SD）表示，每组n = 24。多组间的比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）检验差异；p < 0.05被认为具有统计学意义。请点击此处查看该图的放大版本。
| 28 天后感染 | |||
| 组别 | GMR (%) | WMR (%) | DR (%) |
| 正常 | 35.44 | 64.57 | 0 |
| 轻度 | 11.59 | 64.88 | 23.53 |
| 中度 | 0 | 41.14 | 58.86 |
| 重度 | 0 | 0 | 100 |
表1：损伤后第28天白质、灰质及损伤区域的比率。 缩写：dpi = 损伤后天数，DA = 损伤区域；GMR = 灰质比率；WMR = 白质比率；DR = 损伤比率。
| 组别 | 1 dpi 时的 DA（μm2） | 56 dpi 时的 DA（μm2） |
| 正常 | 0 | 0 |
| 轻度 | 2391250 | 666091 |
| 中度 | 4383381 | 1263191 |
| 重度 | 5118833 | 1943962 |
表2：损伤后第1天与第56天矢状切面病灶的比较。
讨论
通过标准化操作流程，可以获得稳定的数据，尤其是在小动物实验中 体内 实验可最大限度地减少因动物个体差异导致的结果偏差。基于上述条件和便捷的应用仪器，可建立标准化、微创、精确且可重复的脊髓损伤（SCI）模型。
由于其实用性和便利性，以往主要使用落锤式冲击器3。本研究中引入的冲击器与Allen模型12具有相同的原理。幸运的是，得益于现代加工技术在精确制造方面的优势， 研究团队设计出一种落锤式冲击器，具有操作简便、稳定性强、误差小的优点。采用峰值压力检测装置测量不同重物的重力。以往关于Infinite Horizons冲击器的研究6,10表明，在30 Kdyn、50 Kdyn和70 Kdyn组中，作用力偏离目标力±5 Kdyn的范围是可接受的，这为本研究在分组和挫伤程度选择方面提供了参考依据。在本研究中，预先测量了各组可能的作用力，获得了更为准确的数据。
在动物模型实验中，相较于实验设备，更重要的是对小鼠解剖结构的理解与利用。合理利用解剖结构可使操作达到微创。微创手术直接影响实验动物功能状态的稳定性以及后续小鼠恢复的一致性。既往研究表明，在大鼠中采用微创方式建立脊髓损伤（SCI）模型可增加椎体结构的稳定性，并避免恢复期间因脊柱不稳定造成的额外损伤1。微创手术的前提是合理利用自然解剖结构。因此，应依据小鼠的解剖结构快速、精准地定位脊髓节段。有研究报道采用影像学方法定位椎体13，尽管其准确性较高，但在实际实验操作过程中，影像学定位方法存在操作不便、耗时较长、设备获取复杂以及对设备精度要求高等缺点。McDonough 等人描述了通过肩胛骨下角定位胸椎第7节（T7）的方法14，然而小鼠处于俯卧位时，所述“下角”实为后角。此外，利用肩胛骨下端定位T7是基于人体解剖学特定位置的方法15，并不适用于小鼠。最终，Micro-CT数据也验证了无论小鼠处于自然体位还是特定体位，肩胛骨后角均不与T7平齐的假设。McDonough 等人14还提到，当小鼠背部拱起时，可定位背部最高点，并将其定义为T12。相比之下，本研究中通过T12-T13棘突间隙辅助定位T9，该方法不依赖也不受小鼠体位影响。此外，使用该方法可方便地定位目标椎体并进行操作。操作时应在显微镜下探查第13肋，轻触肋椎角区域，沿其向棘突方向画线，然后向前（头侧）探查T12-T13棘突之间的间隙。研究团队在12只小鼠中利用T12-T13棘突间隙定位T9。最后，12只雌性C57BL/6J小鼠在完成T9定位及椎板切除术后接受了Micro-CT扫描。Micro-CT扫描结果显示，所有12只小鼠切除的椎板均为T9。Micro-CT结果表明，所有T9均被准确识别，定位准确率显著高于肩胛骨定位法。该方法为我们提供了一种快速且准确的定位方式，有助于提高损伤模型的一致性。
本方案的微创性主要体现在以下三个方面。首先，在定位后，仅使用微型牵开器牵开T9水平的椎旁肌肉，而不损伤T8或T10水平的肌肉；此外，微型牵开器暴露椎板的同时并不影响术野。其次，术中出血量极低，主要出血来源为椎板切除过程中松质骨可能引起的血液流出，其量几乎不超过浸染一块2 mm × 2 mm × 3 mm三角形棉片所需的体积。第三，椎板切除范围被最大限度地限制在必要区域，保留了椎板外侧部分的连续性，显著减轻了脊椎的不稳定性。与既往方案相比16,17，本方案显著减少了不必要的损伤。
为了评估不同程度的脊髓损伤（SCI），将各组在组织病理学方面的结果与既往研究已报道的结果进行了比较9,11,18。这些结果足以完成对不同损伤程度及不同时期变化的观察性研究。苏木精-伊红染色（HE）和免疫荧光结果显示，随着SCI严重程度的增加，脊髓组织中出现更多的异常形态，损伤程度的加重也导致脊髓结构紊乱程度增加。从组织形态学观察的角度来看，本研究中各实验组的组织形态变化程度及其规律性与既往研究高度一致。
根据目前的组织学检测结果，不同程度创伤性脊髓损伤后各项指标均显示出明显变化，进一步证实了本研究建立的模型的可靠性。
尽管该技术准确有效，但其方法仍可能存在一些局限性。在进行椎板切除术时，操作者应熟练掌握显微镜下的手术操作，以避免误伤脊髓。此外，整个平台的搭建依赖于机械结构，相较于自动化设备，对操作者的技术要求更高。实际上，上述所有问题均可通过反复的操作训练得到改善。
可以看出，微创且标准化的建模有助于使结果更加均一、稳定和可重复，准确评估各种治疗方案的疗效，并优化创伤性脊髓损伤的研究方案。
披露
冯世清教授拥有脊髓损伤同轴平台的所有权。
致谢
本工作得到中国国家自然科学基金重点项目（81930070）的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4% 固定液 | Solarbio | P1110 | 4% |
| 抗神经丝重链多肽抗体 | abcam | ab8135 | 稀释比例 (1: 2000) |
| 伊红染色液（水溶性） | biosharp | BL727B | |
| 乙醇 | 富宇试剂 | 64-17-5 | |
| 荧光显微镜 | KEYENCE | BZ-X800 | |
| 冷冻切片机 | leica | CM3050 S | |
| GFAP (GA5) 小鼠单克隆抗体 | Cell Signaling TECHNOLOGY | #3670 | 稀释比例 (1: 600) |
| 山羊抗小鼠 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32723TR | 稀释比例 (1: 1000) |
| 山羊抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32740 | 稀释比例 (1: 1000) |
| 苏木精染色液 | biosharp | BL702A | |
| 小鼠 | 济南朋悦实验动物有限公司 | C57BL/6J | |
| 显微外科器械 | 山东优莱特生物科技有限公司 | 所有手术器械均为定制 | 眼科剪、微型蚊式钳、显微外科镊、微型剪刀 |
| 正常羊血清封闭液（工作液） | 中杉金桥 | ZLI-9022 | 工作液 |
| O.C.T. 包埋剂 | SAKURA | 4583 | |
| PBS（磷酸盐缓冲液） | Solarbio | P1020 | pH 7.2–7.4 |
| RWD 实验动物吸入麻醉工作站 | 瑞沃德生命科技有限公司 | R550 | |
| 小动物活体显微CT成像系统 | PerkinElmer | Quantum GX2 | |
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参考文献
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