基于CRISPR-Cas系统与抗CRISPR蛋白的基因数字电路

摘要

在Saccharomyces cerevisiae中，CRISPR-Cas系统与抗CRISPR蛋白被整合到布尔逻辑门的体系中。这些新型的小型逻辑电路表现出良好的性能，加深了对基于dCas9/dCas12a的转录因子以及抗CRISPR蛋白特性的理解。

摘要

合成基因布尔门与数字电路在医学诊断到环境护理等多个领域具有广泛应用。CRISPR-Cas 系统及其天然抑制因子——抗 CRISPR 蛋白（Acrs）的发现，为设计和实现 体内 基因数字电路。本文描述了一种遵循“设计-构建-测试-学习”生物工程循环理念的实验方案，该方案利用dCas9/dCas12a及其相应的Acr蛋白，在细胞内构建小型转录调控网络，其中部分网络可表现出布尔逻辑门的行为， 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）这些结果揭示了dCas9/dCas12a作为转录因子的特性。具体而言，为实现基因表达的最大程度激活，dSpCas9需要与一种经过工程改造的支架RNA相互作用，该RNA可募集多个VP64激活结构域（AD）拷贝；相比之下，dCas12a则需在其C末端融合强效的VP64-p65-Rta（VPR）激活结构域。此外，增加细胞内sgRNA/crRNA的量并不能增强这两种Cas蛋白的活性。本文还阐述了如何基于CRISPR-dCas-Acr相互作用构建布尔逻辑门。其中，与人雌激素受体激素结合结构域融合的AcrIIA4是响应β-雌二醇的非门（NOT gate）的核心元件，而由可诱导系统合成的AcrVA蛋白则用于其他逻辑门的设计。 GAL1 启动子能够以半乳糖作为输入，模拟YES和NOT逻辑门。在后一类电路中，AcrVA5与dLbCas12a共同表现出最佳的逻辑行为。

引言

2011年，研究人员提出了一种计算方法，并开发了相应的软件，用于自动设计数字合成基因电路¹。用户需要指定输入数量（三个或四个），并填写电路的真值表；这提供了利用电子学技术推导电路结构所需的全部信息。通过卡诺图方法²，真值表被转换为两个布尔表达式。via 每个布尔表达式由若干子句构成，这些子句描述了电路输入（或部分输入）及其否定（即文字）之间的逻辑运算（加法或乘法）。子句本身则通过相加（OR）或相乘（AND）来计算电路的输出。每个电路均可根据其对应的两个表达式之一来实现：一个为POS形式（乘积之和），另一个为SOP形式（和之乘积）。前者由多个子句（即布尔门）相乘构成，每个子句包含文字的逻辑加和；而后者则是多个子句相加，其中文字被相乘。

通过在面包板上将不同的门电路进行物理连接，可以实现电子电路。电流允许门电路之间交换信号，从而计算出输出结果。

在生物学中，情况更为复杂。布尔门可以通过转录单元（TU；即真核细胞内“启动子-编码区-终止子”序列）来实现，其中转录或翻译（或两者）受到调控。因此，至少有两类分子构成了生物线路：转录因子蛋白和非编码的反义RNA¹。

基因数字电路分为两层或三层门结构，即：1）输入层，由YES（缓冲）门和NOT门组成，将输入的化学物质转化为配线分子；2）内部层，包含的转录单元（TUs）数量与相应布尔表达式中的子句数量相同。如果电路按照积之和（SOP）公式设计，则内部层中的每个子句都会在所谓的分布式输出架构中产生电路输出（例如荧光）。如果采用和之积（POS）公式，则需要第3）输出层，该层包含一个单一的乘法门，用于收集来自内部层的配线分子。

总体而言，在合成生物学中，针对同一电路可以设计出多种不同的方案。这些方案在转录单元（TUs）的数量与类型以及连接分子的种类和数量上各不相同。为了选择最适合在酵母细胞中实现的最简便方案，每种电路设计都对应一个复杂度评分 S，其定义为

其中 A 表示激活因子的数量， R 代表阻遏蛋白的数量，以及 a 是反义RNA分子的数量。如果电路中缺少激活因子或抑制因子，则它们对S的贡献为零。因此，当电路设计需要大量正交转录因子时（S值较高），在实验室中实现该电路方案的难度更大。这意味着需要设计新的激活因子和抑制因子。 从头合成 为了实现数字电路内部的完整布线。原则上，可以通过使用锌指蛋白来组装新型DNA结合蛋白³ 和TAL效应子⁴ 作为模板。然而，此方法显得过于繁琐且耗时；因此，应主要依赖小RNA和翻译调控来完成复杂基因线路的构建。

最初，该方法被开发用于在细菌中构建数字电路。实际上，在真核细胞中，相较于反义RNA，更合适的说法是微小RNA（miRNA）或小干扰RNA（siRNA）⁵。然而，RNAi通路并不存在于酵母S. cerevisiae中。因此，应选择完全基于转录的调控网络。假设一个电路需要5个激活因子和5个抑制因子，则其复杂度评分为S = 32。通过用单个dCas9⁶（核酸酶缺陷型Cas9）融合激活结构域（AD）来替代这10个转录因子，可降低电路的复杂度。如文献⁷所示，当dCas9-AD结合在TATA框与转录起始位点（TSS）之间时，在酵母中起抑制作用；而当其结合在TATA框上游较远位置时，则起激活作用。因此，可用单个dCas9-AD融合蛋白和10条sgRNA（单导向RNA）替代原有的10个转录因子，使总复杂度评分降至S = 11。合成10条sgRNA快速且简便，而正如前文所述，组装10种蛋白质则需要更长时间且操作更为复杂。

或者，可以使用两种正交的dCas蛋白（例如dCas9和dCas12a）：一种与激活结构域（AD）融合，另一种保持无修饰状态，或与抑制结构域联用。该方案的复杂度评分仅增加一个单位（S = 12）。因此，CRISPR-dCas系统是构建酿酒酵母（S. cerevisiae）中高度复杂基因数字电路的关键。

本文深入表征了基于dCas9和dCas12a的抑制子与激活子在酵母中的效率。结果表明，这些系统无需大量sgRNA即可优化其活性，因此应优先避免使用附加体质粒。此外，当使用能够招募多个VP64激活结构域（AD）的支架RNA（scRNA）时，基于dCas9的激活子效果显著增强。相比之下，dCas12a则在直接融合强效VPR激活结构域时表现良好。进一步发现，合成激活型启动子所需的靶位点数量可变，具体取决于激活子的构型（例如，使用dCas12a-VPR时需要三个靶位点，dCas9-VP64需要六个，而dCas9结合scRNA时仅需一个）。作为抑制子，dCas12a在结合编码区时比结合启动子区域表现出更强的抑制效果。

然而，CRISPR-dCas9/dCas12a 的缺点在于其无法直接与化学物质相互作用，因此在输入层中可能无法发挥作用。为此，研究人员已探索了包含抗CRISPR蛋白（Acrs）的替代型布尔逻辑门设计。Acrs可作用于（d）Cas蛋白并抑制其功能⁸，因而成为调控CRISPR-(d)Cas系统活性的一种手段。本文系统分析了II型Acrs与（d）Cas9以及V型Acrs与（d）Cas12a在S. cerevisiae中的相互作用。由于Acrs的分子量远小于Cas蛋白，研究人员通过将人雌激素受体的激素结合域⁹-HBD（hER）与AcrIIA4融合，构建了一个可响应雌激素β-雌二醇的非门（NOT gate）。此外，还实现了若干在半乳糖诱导下表达AcrVAs、同时组成型表达dCas12a(-AD)的是门（YES gate）和非门（NOT gate）。目前，这些逻辑门仅作为概念验证。然而，它们也代表了深入重构算法以实现酵母细胞中合成基因数字电路自动计算设计的第一步。

方案

1. sgRNA/crRNA 表达盒的设计与构建

注意：sgRNA/crRNA 表达盒有两种类型：一种称为 SNR52¹⁰，由依赖于 RNA 聚合酶 III 的 SNR52 启动子、sgRNA/crRNA 序列以及 SUP4 终止子组成；另一种简称为 RGR¹¹，由依赖于 RNA 聚合酶 II 的 ADH1 启动子、包含两个核酶（锤头状核酶-HH 和乙型肝炎 delta 病毒核酶-HDV）及位于其间的 sgRNA/crRNA 序列所组成的 RGR（核酶-向导 RNA-核酶）结构，以及 ADH1 终止子构成。引导 Cas9 同源蛋白的 sgRNA 由间隔序列和特征性的直接重复序列¹² 组成，而用于 Cas12a 蛋白的 crRNA 则由直接重复序列后接间隔序列构成^13,14（本研究中使用的所有 DNA 序列见补充表 1）。

1. 设计用于Cas9/Cas12a介导的转录激活的间隔序列。
   1. 利用细菌 lex 操纵子序列（称为 lexOp）作为靶位点^15,16 并将其插入到 CYC1 驱动酵母增强型绿色荧光蛋白（yEGFP）表达的启动子¹⁷因此，间隔序列由插入的lexOp定义，并与其互补。
2. 检测间隔序列的正交性 通过 CRISPRDIRECT 工具¹⁸.
   1. 在文本框中粘贴两侧带有PAM序列的lexOp序列，将dCas9的PAM序列定义为NRG，dCas12a的PAM序列定义为TTTV，并从下拉列表中指定物种 芽殖酵母（酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）S288C 基因组. 点击 设计确保在20核苷酸序列加PAM和12核苷酸序列加PAM的搜索中均无匹配的靶位点。
3. 构建sgRNA/crRNA表达盒。
   1. 使用降落PCR扩增标准生物元件的DNA序列，如启动子、编码序列和终止子。
      1. 配制反应体系，包含：20–40 ng DNA模板、1 µL 10 µM正向引物（如ot25，用于sgRNA/crRNA表达质粒构建）、1 µL 10 µM反向引物（如ot26，用于sgRNA/crRNA表达质粒构建）、5 µL 2.5 mM dNTP混合物、0.5 µL DNA聚合酶、10 µL 5× DNA聚合酶反应缓冲液，以及双蒸水（ddH₂O）补足至总体积。₂O）加至终体积 50 µL。
         注意：请参阅 补充表 2 有关本研究中所用引物的列表。
      2. 在热循环仪上运行降落PCR程序：
         第1步：98 °C，30秒。
         第二阶段，10个循环：98 °C 变性10秒，68 °C 退火20秒，72 °C 延伸15秒。
         第3阶段，25个循环：98 °C 变性10 s，59 °C 退火20 s，72 °C 延伸15 s。
         第4步：72 °C 下反应2分钟。
         最后，将样品置于 4 °C 保存，直至开始后续实验。
         ​注意：第二阶段的68 °C和第三阶段的59 °C取决于正向与反向引物的熔解温度，不同引物对的熔解温度可能有所不同。第二和第三阶段在72 °C的保持时间由PCR产物的长度以及DNA聚合酶的扩增速度决定。
   2. 分离PCR产物 通过 凝胶电泳（100 V，30 分钟）。从琼脂糖凝胶中洗脱DNA序列 通过 DNA凝胶回收试剂盒（参见 材料表).
      注意：长度超过500 nt的片段需使用0.8%琼脂糖凝胶，100 nt至500 nt之间的片段需使用1.5%琼脂糖凝胶，短于100 nt的片段需使用2%琼脂糖凝胶。
   3. 将表达sgRNA/crRNA的TU插入pRSII404/424穿梭载体中¹⁹，包含氨苄青霉素抗性基因和酵母可选择的营养缺陷型标记基因 TRP1。
      1. 在37 °C下用限制性内切酶SacI和Acc65I对穿梭载体进行双酶切消化，反应时间为1小时。反应体系中加入5 µg穿梭载体、适量的酶、消化缓冲液（根据酶说明书推荐）以及ddH₂O。₂加水至终体积为 30 µL。
      2. 验证穿梭载体的消化 通过 凝胶电泳（参见子步骤1.3.2）。然后，在65 °C下孵育20分钟以灭活两种酶。
      3. 使用吉布森组装方法²⁰ 将纯化的PCR产物与等摩尔的DNA混合物在50 °C下孵育1小时，插入至切开的穿梭载体中。
      4. 转化 大肠杆菌 上述Gibson反应混合物的DH5α感受态细胞 通过 热激转化法²¹. 转移转化后的 E. coli 将细胞接种至含有氨苄青霉素（0.1 g/L）的LB（Luria-Bertani）琼脂平板上。将平板置于37 °C培养箱中，过夜培养。
      5. 从LB琼脂平板上挑取四个菌落，分别接种于含氨苄青霉素（0.1 g/L）的LB液体培养基中，37 °C过夜培养。随后，采用质粒小提步骤提取质粒 E. coli 细胞²².
      6. 使用引物 ot18 和 ot19（参见 补充表 2 用于测序并确认插入的转录单元的寡核苷酸序列 通过 桑格法²³.
         ​注意：在后续实验中，已构建并验证的质粒将被插入酵母基因组中 通过 PEG/LiAc 法²⁴.

2. 支架RNA表达盒的设计与构建

注意：支架向导RNA（scRNA）由sgRNA序列和MS2发夹结构²⁵组成。本研究中使用了两种MS2发夹结构：野生型MS2发夹-wt和f6 MS2外壳蛋白（MCP）适配体-f6。

1. 合成一种能够容纳不同间隔序列的scRNA模板（例如pSNR52-spacer_DR(SpCas9)-2×MS2(wt+f6)-SUP4t）。
   ​注意：本研究中，scRNA模板由基因合成公司合成（见材料表）。
2. 设计合适的引物（见补充表2），对所需的间隔序列进行PCR扩增。
3. 按照步骤1.3中的操作流程构建scRNA表达盒。

3. dSpCas9 的改造与表达质粒构建

1. 获取质粒 pTPGI_dSpCas9_VP64（参见 材料表).
2. 基于穿梭载体 pRSII406 构建受体载体 pRSII406-pGPD-ATG-XbaI-XhoI-CYC1t， 通过 降落PCR和Gibson组装法（参见步骤1.3）。该质粒含有强组成型启动子pGPD和终止子CYC1t。
3. 用XbaI和XhoI在37 °C下消化pTPGI_dCas9_VP64质粒和新构建的受体载体（5 µg消化1小时，或10 µg过夜消化——可参考步骤1.3.3.1）。按照步骤1.3.2的方法分离并纯化插入片段和受体载体。
4. 使用T4 DNA连接酶在16 °C下孵育8小时，将纯化的插入片段与受体载体连接。配制连接反应体系：加入50–100 ng纯化的受体载体、与受体载体等摩尔量的纯化目标片段、1.5 µL T4缓冲液、0.5 µL T4连接酶以及ddH₂O₂O 至终体积 15 µL。
5. 按照步骤 1.3.3.3 和 1.3.3.4 操作。然后，用 XbaI 和 Xhol 酶切（37 °C，1 h）并进行凝胶电泳（见步骤 1.3.2），以确认新构建的质粒是否正确。

4. dCas12a 的改造与质粒构建

1. 构建表达 dCas12a-AD 的质粒。
   1. 合成两侧带有 BamHI 和 Xhol 限制性酶切位点的两种酵母密码子优化的 dCas12a 蛋白（denAsCas12a 和 dLbCas12a）。
      注意：在本研究中，两种酵母密码子优化的dCas12a蛋白由基因合成公司合成（参见 材料清单).
   2. 构建受体载体 pRSII406-启动子-ATG-NLS-GS-His标签-GS-BamHI-sp-XhoI-AD-NLS-TAA-mTGUO1 通过 降落PCR和Gibson组装方法（见步骤1.3），其中 "启动子" 是 pGPD 或 pGAL1 "sp" 代表一段短的随机序列，且 "阿尔茨海默病" 是 VPR 或 VP64。
   3. 将每个 dCas12a 蛋白插入新构建的两个受体载体中 通过 用BamHI和XhoI进行消化，并用T4 DNA连接酶进行连接（参见步骤3.3和3.4）。
2. 构建表达裸dCas12a的质粒。
   1. 使用降落PCR和Gibson组装方法构建dCas12a的半乳糖诱导型表达盒的受体载体pRSII406-Acc651-pGAL1-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-sp-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t（见步骤1.3）。
   2. 用BamHI和XhoI酶切含有dCas12a蛋白的质粒和上述受体质粒，然后用T4 DNA连接酶连接，获得质粒pRSII406-pGAL1-Acc651-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-dCas12a-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t（参见步骤3.3和3.4）。
   3. 用 Acc65I 和 BamHI 酶切第 4.2.2 步获得的质粒，然后将 pGAL1 替换为 pGPD 通过 降落PCR和Gibson组装法构建pRSII406-pGPD-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-dCas12a-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t

5. 抗CRISPR蛋白工程与质粒构建

注意：已采用三种类型的启动子驱动Acrs的表达：一种可诱导启动子pGAL1，四种酵母组成型启动子pGPD、pACT1、pTEF1和pTEF2，以及一种合成组成型启动子genCYC1t_pCYC1noTATA²⁶。

1. 获取含有 II 型 Acr 序列（AcrIIA2、AcrIIA4）的质粒²⁷和 AcrIIA5²⁸以及V-A型Acrs（AcrVA1、AcrVA4和AcrVA5）²⁹由基因合成公司合成。
2. 基于pRSII403穿梭载体构建表达Acrs的质粒。
   1. 构建 AcrIIA 表达盒。
      注意：使用降落PCR扩增四个不同的启动子（即pGPD、pACT1、pTEF2和genCYC1t_pCYC1noTATA）、三种AcrIIA基因以及两个终止子（ADH1t和CYC1t）。构建一系列在不同启动子驱动下表达AcrIIA的表达单元（TUs）。 通过 Gibson 组装方法（参见步骤 1.3）。
   2. 构建 AcrVA 表达盒。
      1. 合成受体序列：ATG-FLAGtag-GS-BamHI-sp-XhoI-NLS-GS-NLS-TAA-Tsynth6，其中 "sp" 是一段随机序列，后续将被 AcrVA 取代。
         注意：在本研究中，受体序列由一家基因合成公司合成（材料表).
      2. 组装受体载体 pRSII403-启动子-ATG-FLAG标签-GS-BamHI-sp-XhoI-NLS-GS-NLS-TAA-Tsynth6，其中 "启动子" 是：pGAL1、pTEF1 和 genCYC1t_pCYC1noTATA。采用 Gibson 组装法（参见步骤 1.3）。
      3. 将三种AcrVA分别插入第5.2.2.2步所述的受体载体中。通过 降落PCR和Gibson组装法[见步骤1.3]构建一组表达AcrVA的质粒。
3. 通过将 AcrIIA4 的序列与 GS linker 和 HBD(hER) 的序列进行融合，进一步改造 AcrIIA4，从而构建出响应β-雌二醇的调控回路。
   1. 使用降落PCR分别扩增GS-HBD和AcrIIA4片段（见步骤1.3.1）。
   2. 将 AcrIIA4、GS-HBD 和穿梭载体加入 Gibson 反应体系中，构建完整的质粒 通过 Gibson 法（见步骤 1.3.3）。

6. crRNA 检测：RT-qPCR 及引物设计

注意：crRNA 的检测已实现 通过 RT-qPCR，分为三个步骤。

1. 从酵母细胞中进行RNA提取与纯化 通过 一种RNA试剂盒
   1. 在24孔板中，使用2 mL合成完全定义培养基（SDC，1 L体积：20 g葡萄糖、2 g氨基酸混合物、6.7 g YNB、396 mg亮氨酸、79.2 mg色氨酸、79.2 mg组氨酸和79.2 mg尿嘧啶），于30 °C、240 rpm条件下过夜培养酵母细胞。
   2. 早上将细胞培养物用2 mL新鲜SDC培养基按1:100稀释，于30 °C、240 rpm条件下继续培养酵母细胞4小时。
   3. 收集全部2 mL细胞溶液，于20,238 x g离心 g 孵育2分钟。小心吸去上清液，因为细胞沉淀量较少。
   4. 使用RNA试剂盒从酵母细胞中提取RNA。
   5. 检测RNA质量。
      1. 制备1%琼脂糖凝胶。取每份RNA样品5 µL，与1 µL DNA上样染料混合，将混合物上样至凝胶中并进行电泳。
      2. 确保凝胶上出现两条清晰条带，大小分别约为 4,000 nt 和 2,000 nt，对应于核糖体 RNA（25S/18S）。此外，在约 80 nt 处可见一条模糊条带，对应于 tRNA。
   6. 立即使用RNA样品进行cDNA合成，或于-80 °C保存以备后续使用。
2. 逆转录：采用茎环法³⁰ 合成与crRNA（40 nt）对应的cDNA第一链。对于sgRNA（近100 nt）的逆转录，其操作步骤与参考基因的cDNA合成相同。 ACT1.
   注意：crRNA 的逆转录方法与 sgRNA 所用方法不同 ACT1 mRNA。由于crRNA非常短，因此将其视为microRNA，并采用microRNA逆转录方法（茎环法）获得相应的cDNA。两种cDNA合成试剂盒（一种用于crRNA的茎环法试剂盒和一种用于常规逆转录的试剂盒） ACT1 基因）用于crRNA定量。两种试剂盒中使用的RNA量相同（参见 材料表) 以使实验结果具有可比性。与茎环试剂盒配套使用的引物是根据茎环序列及crRNA 3'端最后六个核苷酸设计的（茎环序列和引物序列见 补充表 2).
   1. 用于crRNA逆转录的茎环法
      1. 将RNA模板、引物和缓冲液从冷冻保存状态取出，置于冰上融化。
      2. 基因组DNA去除：首先，根据试剂盒说明书配制10 µL反应体系。将反应体系置于42 °C热循环仪中孵育2分钟。最后，立即置于冰上。
      3. 第一链cDNA的合成：加入10 µL步骤6.2.1.2中的混合物、1 µL茎环引物（2 µM浓度）、2 µL 10x RT反应缓冲液、2 µL逆转录酶混合物（含逆转录酶）以及5 µL无RNase的H₂O，配制总体积为20 µL的反应体系。₂O.
      4. 将反应混合物置于热循环仪中，运行以下程序：25 °C 反应 5 分钟，50 °C 反应 15 分钟，85 °C 反应 5 分钟。产物可立即用于 qPCR 反应，或保存于 -80 °C。
   2. sgRNA 和 ACT1 mRNA 逆转录
      1. 第一反应：根据试剂盒说明书，配制13 µL反应体系，包含引物混合物、dNTP混合物、RNA模板（50 pg–5 µg）和无RN酶水（除RNA模板外，其余组分均由试剂盒提供）。使用1 µg的RNA模板。将混合物置于热循环仪中，70 °C孵育10分钟。
      2. 第二步反应（cDNA合成）：根据试剂盒说明书，将相应试剂加入13 µL的第一步反应液中，总体积调整至20 µL，配制反应混合液。将混合液置于PCR仪中，50 °C孵育15分钟，随后85 °C继续孵育5分钟。所得产物应立即用于qPCR反应，或保存于-80 °C。
3. 用于qPCR的SYBR试剂盒：Ct值检测
   注意：在crRNA的qPCR中所使用的反向引物是固定的，因为它对应于茎环序列的反向互补序列（参见 补充表 2）。相比之下，上游引物具有可变性，取决于crRNA的序列。用于sgRNA的上游和下游引物以及 ACT1 mRNA 的 qPCR 引物设计在 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ 进行。 当两个引物的熔解温度差异不超过 2 °C 时，选择这两个引物（参见 补充表 2每个样本均测量三个重复。
   1. 根据SYBR试剂盒的制造商说明书配制qPCR反应体系。
   2. 在实时荧光定量PCR仪中设置以下qPCR程序。
      预孵育：95 °C 下 10 分钟。
      PCR阶段：95 °C下15秒，随后55 °C下34秒。将PCR阶段的循环次数设为45次。熔解阶段：95 °C下10秒，随后65 °C下60秒，最后97 °C下1秒。
   3. 计算相对mRNA表达量 通过 Pfaffl 公式³¹.

7. 免疫荧光检测 Cas 蛋白

注意：Cas 蛋白（CasP）与 His 标签融合。

1. 酵母细胞准备
   1. 使用无菌接种环挑取少量酵母细胞，接种于5 mL YPD丰富培养基中，于30 °C、240 rpm条件下过夜培养。次日早晨，取500 µL菌液加入20 mL新鲜YPD培养基中，于30 °C、240 rpm继续培养，直至OD₆₀₀达到0.6。
   2. 取5 mL培养液，加入500 µL 37%甲醛溶液，室温（RT）静置10分钟。在1,500 × g条件下离心5分钟，收集细胞。
   3. 弃去上清液，用1 mL固定缓冲液（0.1 M KH₂PO₄、0.5 M MgCl₂、3.7%甲醛，pH = 6.5）重悬细胞，室温孵育20分钟。
   4. 在1,500 × g条件下离心5分钟，弃去上清液，将细胞重悬于1 mL洗涤缓冲液（0.1 M KH₂PO₄、1.2 M山梨醇，pH = 6.5）中，并加入4 µL β-巯基乙醇和4 µL裂解液（5 mg/mL）。将细胞悬液置于37 °C孵育箱中孵育20分钟。
   5. 在1,500 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。用1 mL PBS洗涤细胞沉淀两次，每次离心条件为1,500 × g，5分钟。
   6. 将细胞重悬于100 µL PBS（含0.05% Tween 20）中，并加入4 µL BSA溶液（10 mg/mL）。室温孵育20分钟。
2. 一抗孵育
   1. 将Anti-His标签一抗以1:400稀释比例加入步骤7.1.6所得细胞悬液中，室温孵育2小时。
   2. 在1,500 × g条件下离心步骤7.2.1中的混合液5分钟，弃去上清液。加入1 mL PBST缓冲液，于1,500 × g离心5分钟，洗涤细胞沉淀。重复此操作两次。最后，弃去上清液，将细胞重悬于100 µL 1× PBST中。
3. 显微镜细胞检测
   1. 制片：取步骤7.2.2中的细胞悬液2 µL滴加至载玻片上，盖上盖玻片。
   2. 在荧光显微镜下观察细胞。打开荧光光源、显微镜和计算机。记录荧光光源编号，并在计算机上启动显微镜软件。
   3. 将载玻片置于显微镜载物台上，选择40倍物镜，在绿光（550 nm）下观察细胞。调节粗调焦旋钮，直至酵母细胞轮廓清晰，再使用细调焦旋钮使图像聚焦清晰。
   4. 使用显微镜软件进行图像采集。关闭显微镜视野光路，切换至计算机屏幕。点击Live，等待3–5秒后，点击Capture拍摄图像，并保存图片。
   5. 关闭计算机、显微镜和荧光光源。

8. 数据采集：流式细胞术

注意：可检测到绿色荧光 通过 流式细胞术（即荧光激活细胞分选 [FACS] 检测）。通常在 30 °C、240 rpm 条件下培养酵母细胞，以进行 FACS 实验。然而，根据细胞的遗传背景，可能需要采取特定的预防措施。含有特定遗传成分的细胞 dCas12a-VPR 基因（由...控制的） GPD 组成型启动子）必须在SDC溶液中培养24小时。随后，将细胞按1:100的比例稀释至新鲜SDC培养基中，继续培养12小时，然后测定荧光强度。经修饰的细胞 AcrIIA4-HBD(hER) 基因需求也会被稀释。此外，OD₆₀₀ 需要加以控制。首先，让细胞在SDC培养基中过夜培养（超过14小时）。第二天早晨，测定OD₆₀₀ 测定后，将培养物用 SDC 稀释，并添加不同浓度的 β-雌二醇，稀释至 OD₆₀₀ = 0.1。在进行FACS实验前，细胞需继续培养7小时，使OD₆₀₀ OD600达到0.8–1.0时，将表达dCas9-VP64或dCas12a-VP64的细胞在SDC培养基中继续培养20–24小时，期间不稀释也不进行额外扩增，随后直接用于流式细胞仪检测。

1. 在测量前20分钟打开流式细胞仪，以预热激光器。
2. 准备样品（稀释）：将20 µL细胞培养液与300 µL ddH₂O混合。
3. 在连接流式细胞仪的计算机上运行FACS软件，并创建新实验。设置测量参数（即FSC(SSC)-A/H/W和直方图）。
4. 根据样品的激发和发射波长选择滤光片。例如，此处目标蛋白为yEGFP，其激发波长为488 nm，发射波长为507 nm。因此，选择FITC或GFP滤光片（激发波长：488 nm；发射波长：527/32 nm）。将采集细胞数设置为10,000。
5. 通过测量荧光微球的强度来调整FITC滤光片电压。确保连续两次实验中微球强度的相对差异不超过5%。
6. 用ddH₂O清洗仪器数秒，以去除可能残留的过量微球。
7. 测量样品荧光强度。点击预览，等待3-5秒以确保样品注入稳定。最后，点击采集。
8. 实验结束时再次测量微球。所用电压应与初始微球测量时相同（见步骤8.4，438-441 V）。检查两次微球测量之间的相对差异是否超过5%。
9. 将FACS数据导出为FCS文件。
10. 使用R Studio软件分析FCS文件。

9. 数据分析

注意：在 R studio 中使用 Flowcore R Bioconductor 软件包³²。FCS 文件采用 R 语言编写的脚本进行分析。

1. 打开 R Studio 并加载脚本 Bdverse 分析。 用于分析 FCS 文件。
2. 设置实验名称（ename），目录（路径）其中包含FCS文件
   储存的（dir_d），以及结果文件将被创建的位置（dir_r).
3. 设置荧光通道。例如，select_ch = "GPA-A" 如果检测到绿色荧光。
4. 设置已测量的样本数量（s_num).
5. 设置每个点图的尺寸（sxlim, sylim）。为柱状图和箱线图设置 x 轴和 y 轴的最大长度（xlimit, ylimitxlimit 必须大于或等于 s_num。
6. 选择去门控方法，通过移除 # 来自相应的谱线。
   注意：morphGate 是一种由脚本执行的自动设门方法（即程序可识别并选择散点图中细胞密度较高的区域）。polygonGate 和 rectangleGate 则需要观察散点图，并分别定义一个多边形的顶点或一个矩形的边，以圈定大多数细胞所在的区域。
7. 选择 flowSet 对象 门控，对应于所选的设门方法。选择点图分辨率（res；应至少等于 256。
8. 取消注释 flt_low <- 低通滤波(sp) 去除荧光值为负的测量数据。取消注释 flt_sp <- 滤波器（flt_lw） 以排除因其他实验导致的异常值。
9. 按压 源 并运行脚本。分析结果的所有文件将被生成于 dir_r.

结果

由RNA聚合酶III型启动子驱动的sgRNA/crRNA表达
首先，本研究针对转录激活回路（回路1）的构建进行了研究，如图所示 图1A包含三个基本组分：1）编码yEGFP（报告基因）的基因，其上游连接一系列不同的合成启动子，这些启动子提供dCas9/dCas12a-AD的靶向位点；2）经酵母密码子优化的dCas9或dCas12a，分别与激活结构域（VP64和VPR）融合，并含有一段或两段核定位序列（NLSs）；两种dCas蛋白均由强组成型启动子pGPD驱动表达；3）sgRNA/crRNA序列，用于引导dCas9/dCas12a-AD至靶位点。基于dCas9/dCas12a的激活系统的激活效率通过报告基因的荧光强度（测定）进行可视化和反映 通过 FACS 实验。

测试了一种dCas9蛋白（dSpCas9）和两种dCas12a蛋白（denAsCas12a和dLbCas12a）。当dSpCas9在其C末端延伸并融合VP64激活结构域（AD），且结合于合成启动子上游时，实...

讨论

本方案展示了一种合成基因数字电路的完整工作流程，遵循"设计-构建-测试-学习"（DBTL）生物工程循环，并涵盖干实验与湿实验两方面。本文重点研究CRISPR-Cas系统，主要包括dSpCas9、denAsCas12a、dLbCas12a以及相应的抗CRISPR蛋白，通过在S. cerevisiae中设计和构建小型转录调控网络来实现。其中部分网络模拟了布尔逻辑门，即数字电路的基本组成单元。本文所描述的所有电路均有助于揭示CRISPR相关蛋白及抗CRISPR蛋白在S. cerevisiae中的特性与功能。这些结果对于将上述蛋白纳入基因数字电路体系具有重要意义。

DBTL 概念为合成生物学提供了一个框架，但在测试新构建物后还需进行大量优化和改进。例如，在电路1中，最初合成启动子上游的 yEGFP 仅含有一个靶位点（一个 lexOp 拷贝），供 dCas9/dCas12a-AD 结合。在测试该电路构型后，我们发现其激活效果不超过两倍^15,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.1 mL PCR 8联管	NEST	403112
0.2 mL PCR管	Axygen	PCR-02-C
1.5 mL 微量离心管	Axygen	MCT-150-C
15 mL 离心管	BIOFIL	CFT011150
2 mL 微量离心管	Axygen	MCT-200-C
50 mL 离心管	BIOFIL	CFT011500
琼脂糖（分子生物学级）	Invitrogen	75510-019
氨苄青霉素钠盐	Solarbio	69-52-3
Applied Biosystems Veriti 96孔梯度PCR仪	Thermo Fisher Scientific	4375786
AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒	Axygen	AP-GX-250
BD FACSuite CS&T 研究用荧光微球	BD	650621	荧光微球
BD FACSVerse 流式细胞仪	BD	-
离心机	Eppendorf	5424
Sorvall ST 16R 离心机	Thermo Fisher Scientific	75004380
E. coli 感受态细胞（DH5α菌株）	Life Technologies	18263-012
ECL Select 蛋白印迹检测试剂	GE Healthcare	RPN2235
电泳仪	北京君意电泳设备有限公司	JY300C
平盖8联管盖	NEST	406012
基因合成公司	Azenta Life Sciences		https://web.azenta.com/zh-cn/azenta-life-sciences
山羊抗小鼠IgG（H+L）交叉吸附二抗 Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11004
HiFiScript cDNA合成试剂盒	CWBIO	CW2569M	步骤6.2.2.1中使用的试剂盒
裂解液（Zymolyase）	zymoresearch	E1004-A
Nikon Eclipse 80i 荧光显微镜	Nikon	-	荧光显微镜
移液器吸头—10 μL	Axygen	T-300-R-S
移液器吸头—1000 μL	Axygen	T-1000-B-R-S
移液器吸头—200 μL	Axygen	T-200-Y-R-S
pRSII403	Addgene	35436
pRSII404	Addgene	35438
pRSII405	Addgene	35440
pRSII406	Addgene	35442
pRSII424	Addgene	35466
pTPGI_dSpCas9_VP64	Addgene	49013
Q5 高保真DNA聚合酶	New England Biolabs	M0491
限制性内切酶-Acc65I	New England Biolabs	R0599
限制性内切酶-BamHI	New England Biolabs	R0136
限制性内切酶-SacI-HF	New England Biolabs	R3156
限制性内切酶-XhoI	New England Biolabs	R0146
Roche LightCycler 96	Roche	-	实时荧光定量PCR仪
S. cerevisiae CEN.PK2-1C	-	-	亲本菌株，基因型为：MATa; his3D1; leu2-3_112; ura3-52; trp1-289; MAL2-8c; SUC2
Stem-Loop 试剂盒	SparkJade	AG0502	步骤6.2.1.3中使用的试剂盒
T100 梯度PCR仪	BIO-RAD	186-1096
T4 DNA连接酶	New England Biolabs	M0202
T5 核酸外切酶	New England Biolabs	M0363
Taq DNA连接酶	New England Biolabs	M0208
Taq DNA聚合酶	New England Biolabs	M0495
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2x)（SYBR Green I染料）	Takara	RR820Q
YeaStar RNA提取试剂盒	Zymo Research	R1002
β-雌二醇	Sigma-Aldrich	E8875