下拉测定与细菌细胞共表达相结合，作为测试具有挑战性的蛋白质-蛋白质相互作用的省时工具

摘要

在这里，我们描述了一种使用一组兼容载体对差异标记蛋白质进行细菌共表达的方法，然后使用传统的下拉技术来研究无法 在体外组装的蛋白质复合物。

摘要

下拉是一种简单且广泛使用的蛋白质-蛋白质相互作用测定。然而，它在研究体 外不能有效组装的蛋白质复合物方面存在局限性。这种复合物可能需要共翻译组装和分子伴侣的存在;它们要么形成稳定的低聚物，在 体外 不能解离和重新结合，要么在没有结合伴侣的情况下不稳定。为了克服这些问题，可以使用基于差异标记蛋白的细菌共表达的方法，使用一组兼容的载体，然后使用传统的下拉技术。与传统的下拉相比，该工作流程更省时，因为它缺乏单独纯化相互作用蛋白及其后续孵育的耗时步骤。另一个优点是更高的可重复性，因为 体外 环境中存在的蛋白质暴露于蛋白水解和氧化的步骤数量明显较少，并且持续时间更短。当发现其他 体外 技术不合适时，该方法成功地应用于研究许多蛋白质 - 蛋白质相互作用。该方法可用于批量测试蛋白质-蛋白质相互作用。对于BTB结构域与固有无序蛋白质之间的相互作用以及锌指相关结构域的异二聚体的研究，显示了具有代表性的结果。

引言

常规下拉广泛用于研究蛋白质-蛋白质相互作用¹。然而，纯化的蛋白质通常不能在体外有效相互作用²，³，其中一些在没有结合伴侣^4，5的情况下是不溶的。这些蛋白质可能需要共翻译组装或分子伴侣⁵，⁶，⁷，^8，9的存在。常规下拉的另一个限制是测试结构域之间可能的异多聚化活性，这些结构域可以作为稳定的同源低聚物以共翻译8，^{10的形式存在，}因为它们中的许多在孵育期间不能在体外解离和重新结合。发现共表达有助于克服这些问题^3，11。使用细菌中相容载体的共表达成功用于纯化大型多亚基大分....

方案

方法工作流程的示意图如图 1所示。

1. 大肠杆菌的共转化

1. 使用标准克隆方法制备靶蛋白的表达载体。
   注意:通常，一个好的起点是使用带有氨苄青霉素抗性基因和ColE1来源的常规pGEX/pMAL载体表达GST/MBP标记蛋白，以及使用具有p15A或RSF来源和卡那霉素抗性的兼容载体来表达6xHis标记的蛋白质，在某些情况下与硫氧还蛋白或SUMO标签结合使用以增加溶解度。通常，在实验之前需要测试几种标签组合。该方法本身便于批量测试靶蛋白的表达条件。需要注意的是，大多数Rosetta菌株已经含有p15A来源的质粒，用于表达稀有密码子的tRNA;因此，如果可能选择使用这种菌株，则应避免使用p15A质粒。有关详细信息，请参阅 材料表 。
   1. 在37°C的Luria-Bertani（LB）培养基中培养适当菌株的细菌至0.1-0.2的光密度（OD）。本研究以BL21（DE3）菌株为例。
      注意:建议使用新鲜制备的感受态细胞，以实现与两个载体的高效共转化。如果需要对两个以上的向量进行共变换，最好按顺序变换，以达到良好的变换效率。电穿孔是一个不错的选择。
   2. 在4°C下以9，000× g 离心1.0mL细菌悬浮液1分钟，弃去上清液。
   3. 加入 0.5 mL ....

结果

所描述的方法常规用于许多不同的目标。这里介绍的是一些使用传统下拉技术可能无法获得的代表性结果。首先是研究特异性ZAD（锌指相关结构域）二聚化¹¹。ZAD形成稳定和特异性的二聚体，异二聚体只能在副同源组内密切相关的结构域之间产生。由这些结构域形成的二聚体是稳定的，至少几天内不会解离;因此，混合纯化的ZAD不会产生任何可检测的结合。同时，MBP和硫氧还蛋白-6xHis融合ZADs的共表达显示出良好且可重现的同源二聚化活性（图2A），在MBP下拉测定的SDS-PAGE结果中显示为附加条带。可以看到一小部分异二聚体与M1BP与另一个结构域共表达;这种相互作用未与Y2A证实，并且很可能是由于高蛋白质浓度引起的非特异性关联的结果，因为这些结构域富含半胱氨酸并且极易聚集。值得注意的是，在这种情况下，6xHis-pulldown是不合适的，因为ZAD是与金属螯合树脂非特异性结合的金属配位结构域。这种活动应在平行实验中仔细检查。

另一个例子是ENY2蛋白与其结合伴侣Sgf11（1-83aa）和.......

讨论

所描述的方法允许测试不能在 体外 有效组装并需要共表达的蛋白质 - 蛋白质相互作用。该方法是研究异源二聚化蛋白质的少数合适方法之一，这些蛋白质也能够进行同源二聚化，因为当单独纯化时，这些蛋白质形成稳定的同源二聚体，在实验^3，11期间通常不能解离和重新结合。

与传统的下拉相比，所述方法的工作流程更具时间效率，因为它缺乏单独纯化相互作用蛋白质及其后续孵育的耗时步骤。另一个优点是更高的可重复性，因为步骤数量明显较少，蛋白质在暴露于蛋白水解和氧化时存在于人工体外环境中的时间更短。当发现其他体外技术^不合适时，该方法成功地应用于研究几种蛋白质-蛋白质相互作用3，^11，27。具有不同亲和标签的平行共沉淀可提供蛋白质表达水平控制。由于该方法比传.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
8 元件探针	Sonics	630-0586	高通量 8 元件超声仪探针
琼脂	AppliChem	A0949
直链淀粉树脂	New England Biolabs	E8021	用于纯化 MBP 标签蛋白的树脂
抗生素	AppliChem	A4789（卡那霉素）;A0839 （氨苄青霉素）
β-巯基乙醇	AppliChem	A1108
BL21（DE3）	Novagen	69450-M
CaCl2	>AppliChem	A4689
离心机	Eppendorf	5415R （Z605212）
谷胱甘肽	AppliChem	A9782
谷胱甘肽琼脂糖	Pierce	16100	用于纯化 GST 标签蛋白的树脂
甘油	AppliChem	A2926
HEPES	AppliChem	A3724
HisPur Ni-NTA 超流琼脂糖	Thermo Scientific	25214	填料，用于纯化 6xHis 标签蛋白
咪唑	AppliChem	A1378
IPTG	AppliChem	A4773
KCl	AppliChem	A2939
LB	AppliChem	414753
麦芽糖	AppliChem	A3891
MOPS	AppliChem	A2947
NaCl	AppliChem	A2942
NP40 罗	氏	11754599001
pACYCDuet-1	Sigma-Aldrich	71147	与 p15A 复制起始点共表达蛋白质的载体
pCDFDuet-1	Sigma-Aldrich	71340	用于与 CloDF13 复制起始点
PMSF	AppliChem	A0999
蛋白酶抑制剂混合物 VII	Calbiochem	539138	蛋白酶抑制剂混合物
pRSFDuet-1	Sigma-Aldrich	71341	用于与 RSF 复制起始点 SDS 共表达蛋白质的载体
	AppliChem	A2263
Tris	AppliChem	A2264
VC505 超声仪	Sonics	CV334	超声波液体处理
ZnCl2	AppliChem	A6285