本文介绍一种利用一组相容性载体共表达不同标签蛋白的细菌共表达方法，随后结合常规的下拉技术，用于研究无法自行组装的蛋白复合物 体外.
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本文内容
摘要
摘要
Pulldown 是一种简单且广泛应用的蛋白质-蛋白质相互作用检测方法。然而，该方法在研究不能有效组装的蛋白质复合物时存在局限性 体外此类复合物可能需要共翻译组装以及分子伴侣的存在；或者它们会形成稳定的寡聚体，无法解离和重新结合 体外 或在没有结合伴侣的情况下不稳定。为解决这些问题，可采用基于细菌共表达不同标签蛋白的方法，使用一组相容性载体，随后结合常规的下拉技术。与传统下拉方法相比，该流程更加省时，因其省去了分别纯化相互作用蛋白及后续孵育等耗时步骤。另一优势在于更高的可重复性，这是由于操作步骤显著减少，且蛋白在复合物中存续的时间更短，从而降低了降解或失活的风险 体外 环境中的蛋白质易受到蛋白水解和氧化作用。该方法已成功应用于研究多种蛋白质-蛋白质相互作用，而其他方法 体外 发现这些技术不适用。该方法可用于批量检测蛋白质-蛋白质相互作用。文中展示了BTB结构域与内在无序蛋白质之间相互作用的研究结果，以及锌指相关结构域异源二聚体的研究结果。
引言
传统的下拉实验（pulldown）被广泛用于研究蛋白质-蛋白质相互作用1。然而，纯化的蛋白质在体外（in vitro）常常不能有效相互作用2,3，其中一些蛋白质在没有其结合伴侣的情况下不溶4,5。这类蛋白质可能需要共翻译组装或分子伴侣的存在5,6,7,8,9。传统下拉实验的另一个局限性在于，难以检测那些能够以稳定的同源寡聚体形式共翻译组装的结构域之间可能存在的异源多聚化活性8,10，因为许多此类寡聚体在体外孵育期间无法解离并重新结合in vitro。共表达被发现有助于克服这些问题3,
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方案
该方法流程的示意图如图1所示。
1. 共转化 E. coli
- 使用标准克隆方法制备目标蛋白的表达载体。
注意：通常，一个好的起点是使用带有氨苄青霉素抗性基因和ColE1复制起点的传统pGEX/pMAL载体来表达GST/MBP标签蛋白，以及使用带有p15A或RSF复制起点和卡那霉素抗性的兼容载体来表达6xHis标签蛋白；在某些情况下，可与硫氧还蛋白（Thioredoxin）或SUMO标签联用以提高可溶性。通常，在实验前需要测试多种标签组合。所述方法本身适用于批量测试目标蛋白的表达条件。需要注意的是，大多数Rosetta菌株已含有带p15A复制起点的质粒，用于表达稀有密码子对应的tRNA；因此，如果可能使用此类菌株，则应避免使用p15A质粒载体。详见材料表。- 将适当菌株的细菌在LB（Luria-Bertani）培养基中于37 °C培养至光密度（OD）为0.1–0.2。本研究示例中使用BL21(DE3)菌株。
注意：建议使用新鲜制备的感受态细胞，以实现两个载体的高效共转化。若需共转化两个以上载体，则建议依次转化，以获得良好的转化效率。电穿孔也是一种有效的替代方法。 - 取1.0 mL菌液在4 °C、9,000 × g条件下离心....
- 将适当菌株的细菌在LB（Luria-Bertani）培养基中于37 °C培养至光密度（OD）为0.1–0.2。本研究示例中使用BL21(DE3)菌株。
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结果
该方法已常规应用于多种不同靶标的研究。此处展示了一些代表性结果，这些结果可能无法通过传统的下拉技术获得。首先是关于特定ZAD（锌指相关结构域）二聚化11的研究。ZAD能够形成稳定且特异的二聚体，异源二聚体仅可能在旁系同源组内密切相关结构域之间形成。这些结构域形成的二聚体非常稳定，在至少数天内不会解离；因此，混合纯化的ZAD蛋白不会产生任何可检测到的结合信号。然而，MBP与硫氧还蛋白-6xHis融合的ZAD蛋白共表达时，表现出良好且可重复的同源二聚化活性（图2A），在MBP下拉实验的SDS-PAGE结果中表现为额外的条带。当M1BP与另一结构域共表达时，可观察到少量异源二聚体；但该相互作用在Y2A实验中未得到验证，极有可能是由于蛋白浓度较高导致的非特异性结合，因为这些结构域富含半胱氨酸且极易发生聚集。值得注意的是，在此情况下，6xHis下拉不适用，因为ZAD是金属结合结构域，会非特异性地结合金属螯合树脂。此类活性应在平行实验中仔细验证。
另一个例子是ENY2蛋白与其结合伴侣Sg.......
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讨论
所述方法可用于检测那些难以有效组装的蛋白质-蛋白质相互作用 体外 并且需要共表达。该方法是少数适用于研究异源二聚化蛋白的可行方法之一，这类蛋白同时也具有同源二聚化能力，因为当它们被分别纯化时，会形成稳定的同源二聚体，通常在实验过程中无法解离并重新结合。3,11.
与传统pull-down方法相比，本方法的工作流程更加省时，因为它省去了对相互作用蛋白进行单独纯化及后续孵育等耗时步骤。另一个优势是具有更高的可重复性，这是由于操作步骤显著减少，且蛋白质在体外（in vitro）人工环境中暴露于蛋白水解和氧化的时间更短。该方法已成功应用于研究多种蛋白质-蛋白质相互作用，而在这些情况下其他体外（in vitro）技术则被证明不适用3,11,27
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
本工作由俄罗斯科学基金会项目19-74-30026（方法开发与验证）和19-74-10099（蛋白质-蛋白质相互作用检测）以及俄罗斯联邦科学与高等教育部资助项目075-15-2019-1661（代表性蛋白质-蛋白质相互作用分析）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 8通道探头 | Sonics | 630-0586 | 高通量8通道超声破碎探头 |
| 琼脂 | AppliChem | A0949 | |
| 淀粉树脂 | New England Biolabs | E8021 | 用于纯化MBP标签蛋白的树脂 |
| 抗生素 | AppliChem | A4789（卡那霉素）；A0839（氨苄青霉素） | |
| β-巯基乙醇 | AppliChem | A1108 | |
| BL21(DE3) | Novagen | 69450-M | |
| CaCl2 | AppliChem | A4689 | |
| 离心机 | Eppendorf | 5415R (Z605212) | |
| 谷胱甘肽 | AppliChem | A9782 | |
| 谷胱甘肽琼脂糖 | Pierce | 16100 | 用于纯化GST标签蛋白的树脂 |
| 甘油 | AppliChem | A2926 | |
| HEPES | AppliChem | A3724 | |
| HisPur Ni-NTA Superflow 琼脂糖 | Thermo Scientific | 25214 | 用于纯化6xHis标签蛋白的树脂 |
| 咪唑 | AppliChem | A1378 | |
| IPTG | AppliChem | A4773 | |
| KCl | AppliChem | A2939 | |
| LB培养基 | AppliChem | 414753 | |
| 麦芽糖 | AppliChem | A3891 | |
| MOPS | AppliChem | A2947 | |
| NaCl | AppliChem | A2942 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| pACYCDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71147 | 带有p15A复制起点的蛋白共表达载体 |
| pCDFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71340 | 带有CloDF13复制起点的蛋白共表达载体 |
| PMSF | AppliChem | A0999 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物VII | Calbiochem | 539138 | 蛋白酶抑制剂混合物 |
| pRSFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71341 | 带有RSF复制起点的蛋白共表达载体 |
| SDS | AppliChem | A2263 | |
| Tris | AppliChem | A2264 | |
| VC505超声破碎仪 | Sonics | CV334 | 超声液体处理器 |
| ZnCl2 | AppliChem | A6285 |
参考文献
- Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S. Protein-protein interactions: Pulldown assays. Methods in Molecular Biology. 1615, 247-255 (2017).
- Rose, R. B., et al. Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 ....
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重印与许可
