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方法文章

细菌细胞中共表达偶联下拉实验作为高效检测困难蛋白质-蛋白质相互作用的工具

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DOI：

10.3791/64541

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2022年12月23日

 ,  ,  ,  , 
1Department of the Control of Genetic Processes, Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences, 2Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences

通讯作者： Artem Bonchuk <bonchuk_a@genebiology.ru>

本文内容

摘要

本文介绍一种利用一组相容性载体共表达不同标签蛋白的细菌共表达方法，随后结合常规的下拉技术，用于研究无法自行组装的蛋白复合物 体外.

摘要

Pulldown 是一种简单且广泛应用的蛋白质-蛋白质相互作用检测方法。然而，该方法在研究不能有效组装的蛋白质复合物时存在局限性 体外此类复合物可能需要共翻译组装以及分子伴侣的存在；或者它们会形成稳定的寡聚体，无法解离和重新结合 体外 或在没有结合伴侣的情况下不稳定。为解决这些问题，可采用基于细菌共表达不同标签蛋白的方法，使用一组相容性载体，随后结合常规的下拉技术。与传统下拉方法相比，该流程更加省时，因其省去了分别纯化相互作用蛋白及后续孵育等耗时步骤。另一优势在于更高的可重复性，这是由于操作步骤显著减少，且蛋白在复合物中存续的时间更短，从而降低了降解或失活的风险 体外 环境中的蛋白质易受到蛋白水解和氧化作用。该方法已成功应用于研究多种蛋白质-蛋白质相互作用，而其他方法 体外 发现这些技术不适用。该方法可用于批量检测蛋白质-蛋白质相互作用。文中展示了BTB结构域与内在无序蛋白质之间相互作用的研究结果，以及锌指相关结构域异源二聚体的研究结果。

引言

传统的下拉实验（pulldown）被广泛用于研究蛋白质-蛋白质相互作用1。然而，纯化的蛋白质在体外（in vitro）常常不能有效相互作用2,3，其中一些蛋白质在没有其结合伴侣的情况下不溶4,5。这类蛋白质可能需要共翻译组装或分子伴侣的存在5,6,7,8,9。传统下拉实验的另一个局限性在于，难以检测那些能够以稳定的同源寡聚体形式共翻译组装的结构域之间可能存在的异源多聚化活性8,10，因为许多此类寡聚体在体外孵育期间无法解离并重新结合in vitro。共表达被发现有助于克服这些问题3,11。利用相容性载体在细菌中进行共表达已成功用于纯化大型多亚基大分子复合物，包括多梳抑制复合物PRC212、RNA聚合酶II中介体头部模块13、噬菌体T4基板14、SAGA复合物去泛素化酶模块15,16以及铁蛋白17。常用于共表达的复制起点包括ColE1、p15A18、CloDF1319和RSF20。在商业化的Duet表达系统中，这些复制起点与不同的抗生素抗性基因和便捷的多克隆位点组合，形成多顺反子载体，可实现多达八种蛋白质的共表达。这些复制起点具有不同的拷贝数，可通过不同组合使用以实现目标蛋白表达水平的平衡21。为了检测蛋白质-蛋白质相互作用，常使用多种亲和标签；最常见的是6x组氨酸（6xHistidine）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）和麦芽糖结合蛋白（MBP），每种标签均对相应的树脂具有特异性亲和力。GST和MBP还能增强被标记蛋白质的溶解度和稳定性22。

目前已开发出多种涉及在真核细胞中进行蛋白质共表达的方法，其中最著名的是酵母双杂交实验（Y2H）23。Y2H实验成本低、操作简便，并可同时检测多个相互作用；然而，其实验流程需要超过一周时间才能完成。此外还有少数使用频率较低的基于哺乳动物细胞的检测方法，例如荧光双杂交实验（F2H）24和细胞阵列蛋白质-蛋白质相互作用检测（CAPPIA）25。F2H实验相对快速，能够在蛋白质天然的细胞环境中观察其相互作用，但需要使用昂贵的成像设备。这些方法相较于原核表达系统的优势在于能够提供天然的真核翻译和折叠环境；然而，它们均通过转录激活或荧光能量转移等方式间接检测相互作用，常常产生假象。此外，真核细胞中可能含有目标蛋白质的其他相互作用伙伴，这可能会干扰高等真核生物蛋白质之间二元相互作用的检测。

本研究描述了一种用于差异标记蛋白的细菌共表达方法，随后结合常规的下拉技术进行检测。该方法可用于研究需要共表达的靶蛋白之间的相互作用。与传统的下拉方法相比，该方法更节省时间，能够批量测试多个靶标，在大多数情况下具有优势。使用相容性载体进行共表达比多顺反子共表达更为便捷，因为它无需繁琐的克隆步骤。

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方案

该方法流程的示意图如图1所示。

1. 共转化 E. coli

  1. 使用标准克隆方法制备目标蛋白的表达载体。
    注意：通常，一个好的起点是使用带有氨苄青霉素抗性基因和ColE1复制起点的传统pGEX/pMAL载体来表达GST/MBP标签蛋白，以及使用带有p15A或RSF复制起点和卡那霉素抗性的兼容载体来表达6xHis标签蛋白；在某些情况下，可与硫氧还蛋白（Thioredoxin）或SUMO标签联用以提高可溶性。通常，在实验前需要测试多种标签组合。所述方法本身适用于批量测试目标蛋白的表达条件。需要注意的是，大多数Rosetta菌株已含有带p15A复制起点的质粒，用于表达稀有密码子对应的tRNA；因此，如果可能使用此类菌株，则应避免使用p15A质粒载体。详见材料表。
    1. 将适当菌株的细菌在LB（Luria-Bertani）培养基中于37 °C培养至光密度（OD）为0.1–0.2。本研究示例中使用BL21(DE3)菌株。
      注意：建议使用新鲜制备的感受态细胞，以实现两个载体的高效共转化。若需共转化两个以上载体，则建议依次转化，以获得良好的转化效率。电穿孔也是一种有效的替代方法。
    2. 取1.0 mL菌液在4 °C、9,000 × g条件下离心1分钟，弃去上清液。
    3. 加入0.5 mL预冷的转化缓冲液（TB）（10 mM MOPS [pH 6.7]、250 mM KCl、55 mM MnCl2 和 15 mM CaCl2），冰上孵育10分钟。
    4. 在4 °C、8,000 × g条件下离心30秒，弃去上清液。
    5. 加入100 µL TB缓冲液，再加入每种载体各100 ng，冰上孵育30分钟。为研究蛋白在无共表达条件下的行为，可单独转化单个载体。此外，应将表达载体与空的共表达载体成对共转化，作为非特异性结合的对照。
      ​注意：本研究提供的示例中，使用了将相应cDNA与GST/MBP cDNA融合的pGEX/pMAL载体，并与来源于pACYC、携带编码伴侣蛋白结构域与硫氧还蛋白cDNA融合的cDNA的兼容载体联合使用。
    6. 42 °C热激150秒，然后冰上冷却1分钟。
    7. 加入1 mL不含抗生素的液体LB培养基，37 °C孵育90分钟。涂布于含有0.5%葡萄糖及相应抗生素的LB琼脂平板上（常用浓度：氨苄青霉素50 mg/L；卡那霉素20 mg/L；链霉素50 mg/L；氯霉素35 mg/L）。37 °C过夜培养。

2. 表达

  1. 用 2 mL 液体 LB 培养基将平板上的菌落冲洗至含有相应抗生素的 50 mL LB 培养基中（常用浓度为：50 mg/L 氨苄青霉素；20 mg/L 卡那霉素；50 mg/L 链霉素；35 mg/L 氯霉素）。加入金属离子或其他已知辅因子（本研究示例中，向培养基中添加 0.2 mM ZnCl2）。取部分样品加入 20% 甘油，于 -70 °C 保存，以备后续重复实验使用。
    注意：建议直接从平板冲洗多个菌落，以排除因两个质粒之间偶然发生重组事件而导致单个克隆表达不佳的可能性。
  2. 在 37 °C、220 rpm 恒定摇动条件下培养细胞，使其 OD 值达到 0.5–0.7，然后冷却至室温（RT），加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度 1 mM。保留 20 µL 细胞悬液作为未诱导样品的对照。
  3. 在 18 °C、220 rpm 恒定摇动条件下过夜孵育细胞。
    注意：最佳孵育时间和温度可能因蛋白而异；大多数蛋白在 18 °C 过夜孵育效果最佳，建议默认首先尝试此条件。若观察到强烈的非特异性结合，可将孵育时间缩短至 2–3 小时。
  4. 将细菌悬液分为两部分（若使用两种以上不同标签，则相应分为更多部分），并保留 20 µL 细胞悬液以确认蛋白表达。在 4,000 × g 离心 15 分钟。
    注意：暂停点：细菌沉淀可在 -70 °C 保存至少 6 个月。

3. 下拉实验

注意：以下详细步骤适用于带有 6xHis 或 MBP/GST 标签的蛋白质。所有操作均在 4°C 下进行。

  1. 将细菌沉淀重悬于1 mL预冷的裂解缓冲液中，缓冲液中需在实验前立即加入蛋白酶抑制剂和还原剂（见下文）。当使用金属螯合树脂时，避免使用二硫苏糖醇（DTT），因为它会去除金属离子。根据所检测的蛋白质调整缓冲液组成。适用于大多数蛋白质的常见裂解缓冲液配方如下：
    1. 6xHis-pulldown：混合30 mM HEPES（pH 7.5）、400 mM NaCl、10 mM 咪唑、0.1% NP40、10% [w/w] 甘油、5 mM β-巯基乙醇、1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）以及1:1,000稀释的蛋白酶抑制剂混合液（参见材料表）。
    2. GST-或MBP-pulldown：混合20 mM Tris（25 °C时pH 7.5）、150 mM NaCl、10 mM KCl、10 mM MgCl2、0.1 mM ZnCl2、0.1% NP40、10% [w/w] 甘油、5 mM DTT、1 mM PMSF以及1:1,000稀释的蛋白酶抑制剂混合液（参见材料表）。
  2. 在冰上进行超声破碎细胞。保留20 µL样品用于电泳。
    注：通常每份样品需进行20–25次、每次5秒的脉冲，间隔15秒，输出功率为20 W。应根据每台仪器调整合适的超声功率，以避免过热并确保完全细胞裂解。为获得更佳效果，强烈推荐使用高通量多探头超声仪。
  3. 在20,000 x g条件下离心30分钟。取20 µL澄清裂解液用于后续SDS-PAGE分析。
  4. 将树脂（每份样品50 µL）用1 mL预冷裂解缓冲液在4°C下平衡10分钟，于2,000 x g离心30秒，弃去上清液。
  5. 将细胞裂解液（总蛋白浓度：20–50 mg/mL）加入树脂中，在15 rpm恒定旋转条件下孵育10分钟，于2,000 x g离心30秒，弃去上清液。收集20 µL未结合组分用于后续SDS-PAGE分析。
  6. 加入1 mL预冷洗涤缓冲液，孵育1分钟。于2,000 x g离心30秒，弃去上清液。常见洗涤缓冲液配方如下：
    1. 6xHis-pulldown：混合30 mM HEPES（pH 7.5）、400 mM NaCl、30 mM 咪唑、0.1% NP40、10% [w/w] 甘油以及5 mM β-巯基乙醇。
    2. GST-或MBP-pulldown：混合20 mM Tris（25 °C时pH 7.5）、500 mM NaCl、10 mM KCl、10 mM MgCl2、0.1 mM ZnCl2、0.1% NP40、10% [w/w] 甘油以及5 mM DTT。
  7. 进行两次长时间洗涤：加入1 mL预冷洗涤缓冲液，在15 rpm恒定旋转条件下孵育10–30分钟，于2,000 x g离心30秒，弃去上清液。
  8. 加入1 mL预冷洗涤缓冲液，孵育1分钟，于2,000 x g离心30秒，弃去上清液。
  9. 用50 μL洗脱缓冲液在1,200 rpm振荡器中洗脱结合的蛋白质，持续10分钟。常见洗脱缓冲液配方如下：
    1. 6xHis-pulldown：混合30 mM HEPES（pH 7.5）、400 mM NaCl、300 mM 咪唑以及5 mM β-巯基乙醇。
    2. GST-pulldown：20 mM Tris（25 °C时pH 7.5）、150 mM NaCl、50 mM 谷胱甘肽（用碱性Tris调节至pH 7.5）以及5 mM DTT。
    3. MBP-pulldown：混合20 mM Tris（25 °C时pH 7.5）、150 mM NaCl、40 mM 麦芽糖以及5 mM DTT。
  10. 使用SDS-PAGE分析洗脱的蛋白质。
    注：丙烯酰胺浓度应根据蛋白质大小进行调整。本研究示例中使用12%丙烯酰胺凝胶，在Tris-甘氨酸-SDS缓冲液（2 mM Tris、250 mM 甘氨酸、0.1% SDS）中以恒定电压180 V进行电泳。凝胶用含0.2%考马斯亮蓝R250、10%乙酸和30%异丙醇的溶液煮沸染色，再用10%乙酸溶液煮沸脱色。上样蛋白量不应相等，因为在不同实验中拉下的相互作用蛋白量可能不同。

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结果

该方法已常规应用于多种不同靶标的研究。此处展示了一些代表性结果，这些结果可能无法通过传统的下拉技术获得。首先是关于特定ZAD（锌指相关结构域）二聚化11的研究。ZAD能够形成稳定且特异的二聚体，异源二聚体仅可能在旁系同源组内密切相关结构域之间形成。这些结构域形成的二聚体非常稳定，在至少数天内不会解离；因此，混合纯化的ZAD蛋白不会产生任何可检测到的结合信号。然而，MBP与硫氧还蛋白-6xHis融合的ZAD蛋白共表达时，表现出良好且可重复的同源二聚化活性（图2A），在MBP下拉实验的SDS-PAGE结果中表现为额外的条带。当M1BP与另一结构域共表达时，可观察到少量异源二聚体；但该相互作用在Y2A实验中未得到验证，极有可能是由于蛋白浓度较高导致的非特异性结合，因为这些结构域富含半胱氨酸且极易发生聚集。值得注意的是，在此情况下，6xHis下拉不适用，因为ZAD是金属结合结构域，会非特异性地结合金属螯合树脂。此类活性应在平行实验中仔细验证。

另一个例子是ENY2蛋白与其结合伴侣Sg...

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讨论

所述方法可用于检测那些难以有效组装的蛋白质-蛋白质相互作用 体外 并且需要共表达。该方法是少数适用于研究异源二聚化蛋白的可行方法之一，这类蛋白同时也具有同源二聚化能力，因为当它们被分别纯化时，会形成稳定的同源二聚体，通常在实验过程中无法解离并重新结合。3,11.

与传统pull-down方法相比，本方法的工作流程更加省时，因为它省去了对相互作用蛋白进行单独纯化及后续孵育等耗时步骤。另一个优势是具有更高的可重复性，这是由于操作步骤显著减少，且蛋白质在体外（in vitro）人工环境中暴露于蛋白水解和氧化的时间更短。该方法已成功应用于研究多种蛋白质-蛋白质相互作用，而在这些情况下其他体外（in vitro）技术则被证明不适用3,11,27

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

本工作由俄罗斯科学基金会项目19-74-30026（方法开发与验证）和19-74-10099（蛋白质-蛋白质相互作用检测）以及俄罗斯联邦科学与高等教育部资助项目075-15-2019-1661（代表性蛋白质-蛋白质相互作用分析）支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
8通道探头Sonics630-0586高通量8通道超声破碎探头
琼脂AppliChemA0949
淀粉树脂New England BiolabsE8021用于纯化MBP标签蛋白的树脂
抗生素AppliChemA4789（卡那霉素）；A0839（氨苄青霉素）
β-巯基乙醇AppliChemA1108
BL21(DE3) Novagen69450-M
CaCl2AppliChemA4689
离心机Eppendorf5415R (Z605212)
谷胱甘肽AppliChemA9782
谷胱甘肽琼脂糖Pierce16100用于纯化GST标签蛋白的树脂
甘油AppliChemA2926
HEPES AppliChemA3724
HisPur Ni-NTA Superflow 琼脂糖Thermo Scientific25214用于纯化6xHis标签蛋白的树脂
咪唑AppliChemA1378
IPTGAppliChemA4773
KClAppliChemA2939
LB培养基AppliChem414753
麦芽糖AppliChemA3891
MOPSAppliChemA2947
NaClAppliChemA2942
NP40Roche11754599001
pACYCDuet-1Sigma-Aldrich71147带有p15A复制起点的蛋白共表达载体
pCDFDuet-1Sigma-Aldrich71340带有CloDF13复制起点的蛋白共表达载体
PMSFAppliChemA0999
蛋白酶抑制剂混合物VIICalbiochem539138蛋白酶抑制剂混合物
pRSFDuet-1Sigma-Aldrich71341带有RSF复制起点的蛋白共表达载体
SDS AppliChemA2263
Tris AppliChemA2264
VC505超声破碎仪SonicsCV334超声液体处理器
ZnCl2AppliChemA6285

参考文献

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