Escherichia coli中抗生素持留现象的群体与单细胞分析

摘要

抗生素持留现象描述了敏感同基因群体中的少数亚群在短时间内耐受高剂量杀菌性抗生素的能力。本实验方案结合多种方法，在将大肠杆菌（Escherichia coli）暴露于致死剂量的氧氟沙星后，从分子和细胞水平上表征其抗生素持留表型。

摘要

抗生素持留性是指少数细菌亚群短暂耐受高剂量杀菌性抗生素的能力。在杀菌性抗生素处理过程中，细菌群体的大部分会迅速被杀死。这种快速杀灭的第一阶段之后，持留细胞仍保持存活，杀灭速率显著下降。传统上，通过使用高剂量抗生素并设定明确暴露时间的时间-杀灭实验，在群体水平上测定持留性。尽管该方法可提供有关持留细胞比例及杀灭动力学的信息，却无法反映持留现象背后固有的单细胞间异质性。本文所述方案结合了经典的时间-杀灭实验与基于实时荧光显微镜的单细胞分析。通过使用适当的荧光报告系统，对活细胞进行显微成像可揭示抗生素对细胞过程的影响，例如染色体复制与分离、细胞伸长以及细胞分裂。结合群体水平与单细胞分析，能够实现对持留表型的分子与细胞层面的系统表征。

引言

本实验方案旨在单细胞和群体水平上分析细菌在特定抗生素处理下的持留表型。持留现象描述的是同基因型群体中的少数亚群能够耐受高剂量杀菌性抗生素（如氟喹诺酮类、氨基糖苷类、β-内酰胺类等）的能力，所谓持留细胞的最低抑菌浓度（MIC）与群体中大多数细胞相同。当在抗生素存在下随时间测定细菌存活率时，双相杀灭动力学可揭示短暂性耐药细胞的存在：首先非持留细胞被迅速清除，随后持留细胞的杀灭速率显著减慢。一旦去除抗生素，这些持留细胞可重新增殖为遗传上完全相同的群体，并在再次接受相同抗生素处理时表现出类似的杀灭动力学^1,2。与持留现象不同，抗生素耐药性是在群体水平上定义的，通常由de novo突变或携带耐药基因的质粒发生水平基因转移所致³。虽然导致耐药性的突变大多位于药物靶点或药物外排泵启动子区域，但通过全基因组及靶向突变分析所鉴定出的影响持留频率的基因已被证明数量众多且类型多样^{2,3,4,5,6,7,8}。因此，细菌细胞可能通过多种途径进入持留状态^9,10,11，亟需在单细胞水平上开展研究以阐明这些持留细胞的生理特性。

近年来，微流控技术与荧光显微镜相结合的工具发展迅速，为持久性表型的表征提供了新途径，并揭示了染色体复制¹²、DNA修复¹³和细胞分裂¹⁴等关键细胞过程在持久性细胞形成中的重要作用。本文介绍了一种整合经典微生物学实验与单细胞活体成像的方法，用于表征在高剂量氧氟沙星处理下指数生长期的Escherichia coli培养物中产生的持久性细胞。本文所述方案可用于研究其他细菌种类（如Bacillus subtilis¹⁵）或条件（例如β-内酰胺类抗生素处理后的抗生素持久性¹⁶）中的抗生素持久性现象，并可轻松修改以研究涉及表型异质性的多种现象^17,18,19。此外，本文描述的实验装置可与其他荧光报告系统联用，以在单细胞水平上研究感兴趣的特定细胞参数，例如细胞内pH²⁰或ATP²¹水平，从而可能为抗生素持久性现象提供新的见解。

方案

注意：使用无菌的培养玻璃器皿、移液器吸头和培养基。此处，E. coli 细胞在低自发荧光的化学成分明确培养基中培养（参见材料表）。接种操作在本生灯旁进行，以尽量降低污染风险。

1. 细胞培养与生长曲线

1. 从冻存的甘油菌种中挑取目标菌株，在Luria-Bertani（LB）琼脂平板（如需要可添加选择性抗生素）上划线，于37 °C培养过夜（15至19小时），以获得单菌落。
   注意：本实验中使用了两种菌株， E. coli K-12 MG1655 对应的 野生型 菌株及同基因型的 MG1655 hupA-mCherry 菌株²²后者菌株表达带有荧光标签的HU类核蛋白α亚基。 hupA-mCherry 报告基因在天然位点整合 位点 的 hupAHU-mCherry 可作为活细胞中类核动态的示踪标记，因其能以非特异性方式结合 DNA。
2. 接种5 mL培养基（此处为基于3-[N-吗啉代]丙磺酸的培养基[MOPS]）； 表1, 表 2，以及 表3加入0.4%葡萄糖及选择性抗生素（如需要）的液体培养基中接种单个菌落于玻璃试管（≥25 mL）中，将试管置于37 °C、180转/分钟（rpm）的摇床培养箱中过夜培养（15至19小时）。 alternatively，可使用塑料试管、玻璃或塑料锥形瓶（≥25 mL）替代玻璃试管。
   注意：除过夜培养使用含0.4%葡萄糖的MOPS培养基外，本研究中所描述的所有实验均使用含0.4%甘油的MOPS培养基。该条件下的世代时间 E. coli 在添加葡萄糖的MOPS培养基中的生长时间比在添加甘油的MOPS培养基中更短。在此步骤中使用含0.4%葡萄糖的MOPS培养基替代含0.4%甘油的MOPS培养基，可确保细胞在19小时内进入稳定期。也可使用其他培养基，如M9培养基或富含定义培养基（RDM），并补充不同的碳源。但应注意，生长速率和持留频率会因培养基和/或所用碳源的不同而有所差异。²³.
3. 次日早晨，取1 mL培养液，在2,300 x g 3分钟，弃去上清液，再用相同体积的磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻重悬沉淀。测定600 nm处的光密度（OD）_{600 nm}），并计算初始OD所需的体积_{600 nm} 最终体积为2 mL时，光密度值为0.01。
4. 将2 mL MOPS甘油0.4%培养基加入透明底24孔板的孔中，并接种计算好的过夜培养物体积。将24孔板放入自动微孔板读数仪中（参见 材料表）以监测 OD_{600 nm} 24小时。将酶标仪设置为测定OD值_{600 nm} 每15分钟一次，37 °C，高速振荡（140 rpm）。
   ​注意：如果实验中使用的菌株带有荧光报告基因，需确保其生长速率与对照菌株相当 野生型 以避免后续实验中出现任何人为干扰，因为生长速率会影响抗生素持留频率²³. 由于在极低细胞密度下的检测存在局限性，以及菌株特异性对OD的潜在影响_{600 nm}/菌落形成单位（CFU）关系，建议通过监测 CFU·mL^-1 在处理未表征菌株时。

2. 抗生素最低抑菌浓度的测定

注意：最低抑菌浓度（MIC）定义为未观察到细菌生长的最低抗生素剂量。每种抗生素和菌株均需进行MIC测定。在本研究所描述的实验中，使用了氟喹诺酮类抗生素氧氟沙星（OFX）。测定MIC可用于确认抗生素溶液配制正确、抗生素具有活性，以及各菌株对抗生素的敏感性一致。本研究采用已发表的琼脂稀释法测定不同菌株对OFX的MIC。²⁴特定抗生素对特定细菌菌株的最小抑菌浓度（MIC）也可被测定 通过 肉汤稀释法²⁴.

1. 用于 MIC 测定的平板制备
   1. 通过将 5 mg OFX 溶解于 1 mL 超纯水中，配制实验所用抗生素的母液。加入 20 µL 的 37% HCl 以提高 OFX 的溶解度。
   2. 融化 100 mL 无菌 LB 琼脂，并保持在 55 °C 以防止凝固。准备六个小玻璃烧瓶（25 mL），使用无菌移液管将 5 mL 液体 LB 琼脂培养基分别加入每个烧瓶中。
   3. 取 10 μL 浓度为 5 mg·mL^-1 的 OFX 母液，加入 90 μL 超纯水中稀释（1:10 稀释）。向六个含有 5 mL LB 琼脂培养基的玻璃烧瓶中分别加入 0 μL、2 μL、4 μL、6 μL、8 μL 或 10 μL 的 500 μg·mL^-1 OFX 溶液，使 LB 琼脂培养基中的终浓度分别为 0 μg·mL⁻¹、0.02 μg·mL⁻¹、0.04 μg·mL⁻¹、0.06 μg·mL⁻¹、0.08 μg·mL⁻¹ 和 0.1 μg·mL^-1 OFX。通过轻轻旋转烧瓶数次混匀溶液。
      注意：若已知目标抗生素的 MIC，浓度范围应涵盖低于和高于实际 MIC 的值。若 MIC 未知，建议使用涵盖较宽范围的 log₂ 稀释系列。务必确保在添加抗生素前 LB 琼脂培养基已冷却，因高温可能导致抗生素失活。但同时需注意，在加入抗生素前不可让 LB 琼脂培养基凝固，否则会导致抗生素在培养基中分布不均。
   4. 使用无菌移液管将步骤 2.1.3 中制备的六种 LB 琼脂培养基按浓度递增顺序各取 5 mL，分别倒入 6 孔细胞培养板的各孔中。让琼脂冷却至凝固，并在使用前将平板干燥。
      注意：抗生素溶液和培养平板应在实验当天配制。
2. MIC 测定实验
   1. 在玻璃试管（≥25 mL）中，用单个菌落接种 5 mL LB 培养基，并将试管置于设定为 37 °C、180 rpm 的摇床中过夜培养（15 至 19 小时）。
   2. 次日早晨，测定 OD_{600 nm}，并将菌液用 PBS 稀释至最终细胞密度为 1 x 10⁷ CFU·mL^-1。对于本实验中测试的菌株，1 x 10⁷ CFU·mL⁻¹ 对应的 OD_{600 nm} 为 0.0125。
      注意：若 CFU·mL^-1 与 OD_{600 nm} 之间的相关性未知，应通过测定菌落形成单位（CFU）和 OD_{600 nm} 建立生长曲线，以计算 CFU·mL^-1 与 OD_{600 nm} 之间的换算系数。
   3. 将上述稀释后的菌液各取 2 μL 点样至干燥的 6 孔板的每一孔中。待液滴完全干燥后，将平板置于 37 °C 培养箱中过夜培养（15 至 19 小时）。
   4. 次日，计数每孔中形成的菌落数。MIC 对应于未检测到细菌生长的最低抗生素浓度所在的孔。

3. 斑点实验

注意：点种法是一种定性方法，可用于估测存活细胞数量（即在抗生素胁迫后能够形成菌落的细胞）。在进行时间-杀菌实验之前需先执行点种实验，以了解所用菌株在测试条件下的存活能力，并确定时间-杀菌实验中所需的稀释倍数（见第4节）。

1. 为准备用于点样实验的LB琼脂平板，将50 mL LB琼脂倒入一个方形培养皿（144 cm²）中。每个时间点准备一个方形培养皿。待LB琼脂凝固后，在使用前将平板干燥。
2. 在玻璃试管（≥25 mL）中，用单个菌落接种5 mL培养基（MOPS葡萄糖0.4%），并将试管置于摇床培养箱中，37 °C、180 rpm条件下过夜培养（15至19小时）。
3. 次日，测定OD_{600 nm}，并将菌液稀释至新鲜的、预温至37 °C的培养基（MOPS甘油0.4%）中，最终OD_{600 nm}约为0.001。将菌液在37 °C、180 rpm条件下于培养箱中继续培养过夜（15至19小时）。
4. 第三天，测定OD_{600 nm}，并将菌液继续培养至最终OD_{600 nm}达到0.3。
5. 在培养过程中，准备96孔板：除第一行（A行）外，向其余每孔中加入90 μL 0.01 M MgSO₄溶液。该96孔板将用于步骤3.7中的10倍系列稀释。
   注意：本实验中，两种菌株（wt 和 hupA-mCherry 菌株）在七个不同时间点均设三个重复。由于每块板包含12列，每块板可用于两个时间点，因此共准备了四块板。
6. 当OD_{600 nm}达到0.3时，分别取200 μL各细菌培养物。这些样品对应于抗生素处理前的t0（未处理）时间点，用于测定抗生素处理前的CFU·mL^-1。
7. 将样品在2,300 xg条件下离心3分钟。在离心期间，向液体培养物中加入所需浓度的OFX，并继续在37 °C、振荡条件下培养。
   注意：本实验中，OFX的使用浓度为5 μg·mL^-1（相当于MIC的83倍）。在先前的研究中，该浓度被用于表征OFX暴露下的持留现象²⁵。时间-杀菌实验中所用抗生素浓度可根据抗生素种类、培养基及细菌生长状态而调整。
8. 离心后，将菌体沉淀重悬于200 μL 0.01 M MgSO₄溶液中。取100 μL加入步骤3.5中准备好的96孔板的空孔中。通过将A行孔中的10 μL转移至含有90 μL 0.01 M MgSO₄的B行孔中进行稀释。继续将B行孔中的10 μL转移至C行孔中，依此类推，直至达到10⁻⁷的稀释度（每次转移均为10倍稀释）。
   注意：本实验中，每个时间点测试六种培养物（wt 菌株三个重复 ，hupA-mCherry 菌株三个重复）。根据该方案，使用多通道移液器同时对六种菌株进行系列稀释。为最小化技术误差，每次转移均更换移液器吸头。
9. 将每种稀释液各取10 μL点样至步骤3.1中准备的LB琼脂平板上。
   注意：使用多通道移液器可同时将相同稀释度（例如10⁻⁴稀释度）的六种培养物点样。点样时应仅使用多通道移液器的第一档，避免按至第二档，否则可能导致微小液滴被分配到平板上。
10. 在添加抗生素后的相应时间点，取200 μL培养物，并按照步骤3.8所述进行系列稀释。按照步骤3.9所述，将每种稀释液各取10 μL点样。
    注意：本实验共采集七个时间点（t0、t1h、t2h、t3h、t4h、t5h、t6h）。对于相较于wt菌株抗生素敏感性增强的菌株，可使用0.01 M MgSO₄进行多次洗涤，以去除残留抗生素。
11. 将平板在37 °C下培养过夜（15至19小时）。次日，计数可检测到菌落的两个最高稀释度下的菌落数。理想情况下，这些稀释度在琼脂平板上的点样区域应含有3至30个菌落，以便准确测定各样品的CFU·mL^-1。
12. 通过将各时间点计算得到的CFU·mL^-1除以t0时间点初始菌群的CFU·mL^-1，计算存活率。

4. 时间-杀菌实验

注意：虽然斑点实验是一种易于使用的、用于估计特定菌株在特定抗生素作用下的存活率的方法，但时间-杀灭实验可提供更高分辨率的存活率数据，可用于准确量化细菌的存活性。通过分析杀灭曲线的特征，可以判断特定细菌菌株在给定条件下对该抗生素是敏感、耐受还是耐药。此外，时间-杀灭实验还可用于确定检测持留现象（双相杀灭曲线第二阶段斜率的起始点）所需抗生素暴露的时间以及持留频率。

1. 准备用于时间-杀灭涂布实验的LB琼脂平板。将25 mL LB琼脂倒入一个培养皿（±57 cm²）中。每个时间点至少准备两个培养皿（每株菌株每个时间点进行两个稀释度的涂布）。
2. 让LB琼脂凝固，并在每个平板中加入5至8个无菌玻璃珠前将平板干燥。倒置平板，并根据菌株/条件/时间点进行标记。
   注意：玻璃珠可在步骤4.7和步骤4.9中帮助细菌在琼脂平板上均匀分散。也可使用涂布棒代替玻璃珠进行细胞分散。
3. 为每个样品准备含有900 µL 0.01 M MgSO₄ 溶液的10倍系列稀释玻璃试管。每个样品所需准备的稀释试管数量应与点样实验中检测菌落所需的稀释梯度数相对应。
4. 在玻璃试管（≥25 mL）中，用单个菌落接种5 mL培养基（MOPS葡萄糖0.4%），并将试管置于设定为37 °C、180 rpm的摇床培养箱中过夜培养（15至19小时之间）。
5. 培养16小时后，测定OD_{600 nm}，并将菌液按比例稀释至新鲜的、预温至37 °C的培养基（MOPS甘油0.4%）中，使终浓度OD_{600 nm}约为0.001。将菌液在37 °C、180 rpm条件下于培养箱中继续培养过夜（15至19小时之间）。
6. 次日，测定OD_{600 nm}，并将菌液继续培养至终浓度OD_{600 nm}达到0.3。
7. 当OD_{600 nm}达到0.3时，取100 μL菌液，根据点样实验获得的数据进行稀释（在OD_{600 nm}为0.3且无抗生素条件下，通常10⁻⁵稀释度可产生200–300个菌落），然后取100 µL涂布于步骤4.1–4.2制备的LB琼脂平板上。轻轻摇动平板，避免玻璃珠接触培养皿边缘，以防细菌在LB琼脂培养基上分布不均。此抗生素处理前的首个样品对应t0时间点（抗生素处理前的CFU·mL^-1）。
8. 加入所需浓度的OFX，并继续在37 °C下振荡培养。
   注意：本实验中OFX的使用浓度为5 μg·mL^-1（相当于MIC的83倍）。
9. 在添加抗生素后的相应时间点，取100 μL菌液，根据点样实验所得数据进行稀释，并取100 µL涂布于步骤4.1–4.2制备的LB琼脂平板上。涂布操作方法同步骤4.7所述。
   注意：本实验共采集七个时间点（t0、t1h、t2h、t3h、t4h、t5h、t6h）。对于相较于wt菌株表现出抗生素敏感性增强的菌株，可使用0.01 M MgSO₄进行多次洗涤，以去除残留的抗生素。
10. 将平板在37 °C下培养过夜（15至19小时之间）。次日，统计两个最高稀释度下可检测到菌落的平板上的菌落数量。理想情况下，平板上的菌落数应在30–300之间，以便准确测定各样品中的CFU·mL^-1。
11. 通过将各时间点的CFU·mL^-1值除以t0时间点的CFU·mL^-1值，计算存活率。以时间为横坐标，绘制log₁₀标准化后的CFU·mL^-1值曲线。

5. 微流控时间延时显微成像

注意：以下部分描述了微流控板的制备，以及延时图像采集和图像分析流程。本实验的目的是在单细胞水平上观察和分析抗生素处理后持留表型的表现。实验过程中收集的数据可根据所研究的具体问题和/或实验中使用的荧光报告系统，用于生成多种结果。在本实验中，对细胞长度以及反映持留细胞与非持留细胞中拟核结构的 HU-mCherry 荧光强度进行了定量分析²²。

1. 用于微流控延时显微镜的细菌细胞培养
   1. 在玻璃试管（≥25 mL）中，接种一株单菌落至5 mL培养基（MOPS甘油培养基，含0.4%甘油，根据需要添加选择性抗生素），置于摇床培养箱中，37 °C、180 rpm振荡培养过夜（15至19小时）。
   2. 第二天，测定OD值_{600 nm}，并将培养物用新鲜的、温度已调节至37 °C的MOPS甘油培养基（0.4%）在玻璃试管中稀释至终浓度OD_{600 nm} 约0.001。将培养物置于37 °C、180 rpm的摇床培养箱中过夜培养（15至19小时），以获得次日处于对数生长期初期的培养物。
2. 微流控板的制备与延时显微成像
   注意：微流控实验可使用市售的微流控装置（如本文所述）或自行制备的微流控系统进行。
   1. 从微流控板的每个孔中移除保存液（如有），并替换为新鲜培养基。
      注意：如果微流控板含有废液出口孔，则应移除出口孔中的保存液，但不可用培养基替换。
   2. 使用歧管系统密封微流控板，方法是单击 密封 按钮或通过微流控软件（首先选择 工具，随后 密封板).
      注意：为密封板，应通过手动将板均匀地压向多孔板装置来施加均匀压力。若操作正确，该注意事项 "密封的" 应显示在ONIX2界面上。切勿对玻璃载片施加任何压力，以避免可能损坏多路阀的风险。
   3. 密封后，执行第一次引物序列（点击） 运行液体引注程序 在微流控软件界面上）。
      注意： 运行液体引物序列 对应于1-5号孔在6.9 kPa下灌注5分钟，随后8号孔在6.9 kPa下灌注5分钟，最后6号孔在6.9 kPa下进行5分钟的终末灌注。 运行液体引物序列 可去除仍残留在连接各孔通道中的保存液。
   4. 将培养板置于显微镜恒温控制柜中，在所需温度（此处为37 °C）下孵育至少2小时，然后开始显微成像。
   5. 启动第二个 运行液体引物序列 在开始实验之前。
   6. 通过点击微流控软件界面上的“Seal off”来密封微流控板。将1号和2号孔中的培养基更换为200 μL新鲜培养基，将3号孔中的培养基更换为含抗生素的新鲜培养基200 μL（此处为5 μg·mL⁻¹的OFX）⁻¹），在第4孔和第5孔中加入200 μL新鲜培养基，在第6孔中加入200 µL新鲜培养基，在第8孔中加入200 μL培养样品（来自步骤5.1.2）并稀释至OD_{600 nm} 新鲜培养基中为0.01。
   7. 按照5.2.2步骤所述密封微流控板，然后将该板放置于显微镜柜内的显微镜物镜上。
      注意：在放置微流控板之前，务必在显微镜物镜上滴加一滴浸油。
   8. 在微流控软件中，单击 细胞加载 以便将细胞加载到微流控板中。
      注意： 细胞加载 该步骤包括：对8号孔以13.8 kPa灌注15秒，随后对6号孔和8号孔以27.6 kPa灌注15秒，最后对6号孔以6.9 kPa灌注30秒。微流控板中细胞的密度对该实验至关重要。本微流控方案的第一部分是在新鲜培养基中培养细菌6小时，之后进行抗生素处理。经过6小时的培养后，细胞密度必须足够高，以便检测稀有的持留细胞（在本研究使用的条件下，持留细胞的出现频率为10⁻⁶）。⁻⁴）。如果细胞密度过高，则难以区分单个细胞，从而无法进行精确的单细胞分析。由于细胞生长速率直接依赖于培养基，因此在启动实验前应先评估显微镜视野中的细胞密度。
   9. 使用透射光模式设置最佳焦距，并选择若干细胞数量适宜的感兴趣区域（每个视野最多300个细胞）。
      注意：应选择至少40个ROI，以确保成像到稀有的持留细胞。
   10. 在微流控软件上，点击 创建实验方案将新鲜培养基在6.9 kPa压力下注入1-2孔，持续6小时；随后将含抗生素的培养基在6.9 kPa压力下注入3孔，持续6小时；最后将新鲜培养基在6.9 kPa压力下注入4-5孔，持续20小时。
       注意：将细菌培养物稀释至 OD_{600 nm} 0.01 的接种量可使细菌在微流控腔室中生长 6 小时，确保细胞处于对数生长期。根据加载步骤中引入微流控装置的细胞数量（见步骤 5.2.8），可调整生长时间，使每个 ROI 中的细胞数达到最多 300 个。由于持留现象较为罕见，增加每个 ROI 中的细胞数量有助于提高观察到持留细胞的概率。然而，每个 ROI 中的细胞数不应超过 300 个，否则将使单细胞分析变得繁琐。
   11. 以15分钟为间隔，使用透射光和荧光报告基因的激发光源，进行延时显微成像。此处采用560 nm激发光源检测mCherry信号（580 nm LED，10%功率，Zeiss滤光片00 [530-585 ex, 615LP em]，mCherry曝光时间为100 ms）。细胞成像使用与Zeiss兼容的Zen 3.2软件进行。
3. 图像分析
   注意：显微镜图像的打开和可视化使用开源的 ImageJ/Fiji 软件（https://fiji.sc/）完成²⁶使用开源的 ImageJ/Fiji 软件和免费的 MicrobeJ 插件（https://microbej.com）进行定量图像分析。²⁷在本方案中，使用了 MicrobeJ 5.13I(14) 版本。
   1. 打开计算机上的 ImageJ/Fiji 软件，将延时显微镜多通道时间序列图像拖入 Fiji 的加载栏中。使用 图像 > 颜色 > 制备复合材料 融合超堆栈的不同通道。如果延时实验的通道颜色与预期不符（例如，相差图像显示为红色而非灰色），请使用 图像 > 颜色 > 排列通道 为通道应用适当的颜色。
   2. 打开 MicrobeJ 插件，使用手动编辑界面检测细菌细胞。删除自动检测到的细胞，然后逐帧手动勾画出目标持留细胞。
      注意：可使用不同设置来自动检测单个细胞。此处采用手动检测，因为所分析的持留细胞会形成长丝状结构，而自动检测通常难以正确识别此类结构。
   3. 检测完成后，使用 结果 在 MicrobeJ 手动编辑界面中点击图标以生成 ResultJ 表格。保存 ResultJ 文件，并利用该表格深入分析单细胞分析中各个关注参数。在本实验方案中，导出了单个细胞的 HU-mCherry 荧光强度均值、细胞长度和细胞面积。

结果

如上所述，用于持留细胞单细胞表型分析的菌株在MOPS 0.4%甘油培养基中进行了表征。随时间监测OD_600nm的结果显示，wt菌株与hupA-mCherry 菌株之间无显著差异（图1）。这表明HU-mCherry融合蛋白的表达在这些条件下对细菌生长无影响。两种菌株的细菌细胞初始接种OD_{600 nm}为0.01，接种后约8小时进入对数生长期。

通过标准化方法（此处为连续琼脂稀释法）测定OFX的最小抑菌浓度（MIC）²⁴。MIC定义为未检测到可见生长的最低浓度。两种菌株的OFX MIC均确定为0.06 µg·mL⁻¹，表明与同源野生型（wt）菌株相比，hupA-mCherry融合蛋白对OFX的敏感性无影响（图2）。

我们进一步确定了致死浓度的氧氟沙星处理（83倍MIC）对本研究中使用的两种菌株存活率的影响。随着氧氟沙星暴露时间的延长，活菌数量逐渐减少，因此需要相应调整细菌培养物的稀释倍数，以确保每个平板上的菌落数在30至300之间。为了确定不同时间点的合适稀释倍数，我们进行了点样实验，使用多通道移液器将0至10⁻⁷倍比稀释的菌液各10 µL点样到方形培养皿上。合适的稀释度是指能够观察到单个分离菌落的稀释梯度（例如，t0时为10⁻⁵，t1h时为10⁻⁴/10⁻³，t4h时为10⁻²/10⁻¹）（图3）。

尽管斑点实验是了解氧氟沙星（OFX）介导杀灭动力学的简便方法，但它无法准确测定杀灭动态。当通过时间-杀灭实验监测经OFX处理的指数生长期细胞的存活率时，观察到典型的双相曲线（图4）。曲线的第一个斜率反映了非持留菌群的快速杀灭（红色虚线）。在本实验条件下，加入OFX处理3小时后，高达99.9%的细胞无法形成菌落。这一初始杀灭阶段之后是第二个阶段，表现为较慢的杀灭速率（蓝色虚线），揭示了耐药持留菌细胞的存在。在本实验条件下，持留菌阶段大约在添加OFX后3小时开始，这突显出为研究持留表型，需将细胞暴露于OFX超过3小时的必要性。重要的是，时间-杀灭曲线显示，hupA-mCherry融合蛋白对时间-杀灭动力学无影响。因此，编码该翻译融合荧光蛋白的菌株可用于通过荧光显微镜监测持留菌细胞。

我们进一步在单细胞水平上研究了持留现象。为此，将hupA-mCherry菌株引入微流控平板中，以便在对特定成像区域进行延时显微观察的同时，改变培养基条件（此处为生长、处理和恢复阶段）。在微流控实验的第一阶段，引入微流控装置的细胞被生长培养基（MOPS 甘油 0.4%）持续灌注，并以约2小时的世代时间进行分裂（图5和 图6）。这一初始生长期表明，在氧氟沙星（OFX）处理前，细胞具有活性并处于活跃分裂状态。

经过第一阶段的生长后，细胞用添加了5 µg·mL⁻¹ OFX的培养基灌注6小时。一旦抗生素到达细胞，细胞分裂即被阻断（图5 和 图6）。经过6小时的OFX处理后，细胞被更换为新鲜培养基进行灌注。尽管绝大多数细胞无法恢复生长（图5 和 图6），但有一小部分细菌亚群能够伸长并形成丝状细胞²⁵。这些在OFX处理后能够分裂并产生可存活子代细胞的细胞，可被定义为持留细胞。

由于该装置能够在处理前、处理中和处理后对持留细胞进行可视化观察，因此它不仅提供了持留细胞在恢复阶段的表型信息，还揭示了处理前持留细胞的生理状态（图6）。在所测试的条件下，持留细胞在氧氟沙星（OFX）处理前的分裂行为与非持留细胞相似，表明所观察到的持留细胞并非来源于休眠的亚群（图6）²⁵。

在恢复阶段对持留细胞进行的细胞长度分析显示，每根丝状体均有特定的伸长速率。每个持留细胞在首次分裂前达到的细胞长度各不相同。同样，首次分裂事件的发生时间也表现出高度异质性（图6）。发生分裂的持留丝状体会产生多个子代细胞，这些子代细胞随后开始生长和分裂，其行为在大多数情况下与未经处理的细胞相似（图7）。丝状体的连续分裂导致细胞长度逐步减小，最终产生的子代细胞长度与氧氟沙星（OFX）处理前的细胞长度相近（图6 和 图7B）。绝大多数细胞在去除OFX后无法诱导形成丝状体。这一大群大尺寸细胞对应于已死亡的细胞（图5 和 图6）。

核仁相关蛋白 HU 的荧光融合标记使得核仁动态变化的可视化成为可能²²。通过分析细胞内 HU-mCherry 的总荧光强度，可间接反映 DNA 含量^22,25。在生长阶段（氧氟沙星处理前），mCherry 总荧光强度存在波动，反映了细胞周期中染色体复制与分离的动态过程（图8）。加入氧氟沙星（OFX）后，细胞中部的 mCherry 荧光增强，表明核仁发生压缩，这一现象已被证实由双链 DNA 断裂引发²⁸（图5）。双链 DNA 断裂是氧氟沙星作用机制的后果，其通过干扰 II 型拓扑异构酶——DNA 旋转酶和拓扑异构酶 IV 的功能而起效^29,30。在 E. coli 中，DNA 旋转酶是氧氟沙星的主要靶点^29,30。氧氟沙星在其双链通过机制的关键步骤中结合靶酶，抑制断裂 DNA 链的重新连接，最终导致双链 DNA 断裂的释放³⁰。如上所述，对氧氟沙星处理产生耐受的持留细胞在恢复过程中开始出现丝状生长²⁵（图6）。细胞长度的增加伴随着总 mCherry 荧光强度的上升，反映了染色体复制重启以及丝状细胞中核仁含量的增加²⁵（图7a 和 图8）。对于死亡细胞，其总 mCherry 荧光强度在处理期间及恢复阶段均保持稳定，表明这些细胞在去除氧氟沙星后无法重启染色体复制（图8）。同时提供了 E. coli HU-mCherry 细胞在氧氟沙星处理前、处理中及处理后的微流控视频（视频1）。

图 1：wt 与 hupA-mCherry E. coli 菌株的生长监测。对wt（黑色）和hupA-mCherry（红色）进行光密度监测（OD_{600 nm}）。阴影区域和虚线表示生物学重复实验的标准偏差。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：OFX 对 wt 和 hupA-mCherry E. coli 菌株的 MIC 测定。wt（♦）和 hupA-mCherry（●）菌株在 LB 培养基中培养后，取 2 µL 点样于含系列稀释 OFX 的 LB 琼脂平板上（各图中浓度以 µg·mL⁻¹ 表示）。可见最低在 0.06 µg·mL⁻¹ 时出现生长抑制。该图为代表性的生物学重复实验结果（三次重复中的一次）。比例尺 = 1 cm。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：野生型（wt）和 hupA-mCherry E. coli 菌株在OFX处理下的点种实验。（A）wt 和（B）hupA-mCherry 菌株在MOPS甘油（0.4%）培养基中培养，培养条件如方案第3节所述。对数生长期细胞（OD_{600 nm} = 0.3）用5 µg·mL⁻¹ OFX处理。T0表示添加OFX前的时间点，T1、T2、T3、T4、T5和T6分别表示添加OFX后1至6小时的时间点。该图为代表性的生物学重复实验结果（共三次重复）。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：时间-杀菌试验 野生型 和 hupA-mCherry 大肠杆菌 暴露于氧氟沙星（OFX）时的菌株反应。 这 野生型 （♦）和 hupA-mCherry (●) 菌株在 MOPS 甘油 0.4% 培养基中培养，具体方法如方案第 4 节所述，取对数生长期细胞（OD_{600 nm} = 0.3）的样本用 5 µg·mL⁻¹ OFX。虚线表示第一个“快速”（红色）杀灭阶段和第二个“缓慢”（蓝色）杀灭阶段，分别对应敏感菌亚群和持留菌亚群（通过T0至T2以及T3至T6期间的线性回归获得）。误差线表示三次生物学重复的标准偏差。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图5：利用微流控工具观察OFX持留细胞与死亡细胞的代表性图像。 显微镜图像展示了使用hupA-mCherry菌株进行的微流控实验中相关时间点的结果（灰度为相差图像，红色为HU-mCherry信号）。表达标记的hupA-mCherry细胞在微流控板中培养（此处为4小时），随后接受OFX处理（5 µg·mL⁻¹）。在OFX存在条件下培养6小时后，用新鲜培养基灌注细胞，使持留细胞得以恢复。在OFX处理期间存活的持留细胞及其在去除OFX后的子代细胞分别用绿色和蓝色高亮显示。各面板中标注了相应的时间点。比例尺 = 5 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6：持留细胞与死亡细胞长度的显微镜延时分析。 死亡细胞（红色，n = 109）和持留细胞（灰色，n = 13）的细胞长度分析。氧氟沙星（OFX）处理开始（5 µg·mL⁻¹）以红色虚线表示（5小时），OFX的移除以蓝色虚线表示。插图对应OFX添加前的生长阶段。实验重复三次。阴影区域和虚线表示死亡细胞群体（n = 109）的标准差。请点击此处查看该图的放大版本。

图7：代表性的对氧氟沙星（OFX）耐受菌的显微镜延时分析。（A）在去除OFX后8.5小时（微流控实验开始后18.5小时，包括4小时生长、6小时5 µg·mL⁻¹ OFX处理以及去除OFX后的8.5小时恢复期）期间，由丝状体分裂产生的代表性OFX耐受菌及其子代细胞的明场延时图像轨迹图（kymograph）。每帧图像对应15分钟。比例尺 = 5 µm。（B）由A中的耐受菌kymograph生成的掩膜图。被监测的耐受菌细胞以蓝色轮廓标出，子代细胞则用不同颜色高亮显示。（C）根据B生成的耐受菌细胞谱系示意图。颜色编码与B相同。请点击此处查看该图的放大版本。

图8：代表性持留细胞与死亡细胞的细胞长度及mCherry荧光分析。 在微流控延时实验过程中，对一个代表性持留细胞（实心黑色和红色线）和一个代表性死亡细胞（虚线黑色和红色线）的细胞长度（左侧纵轴）和总HU-mCherry荧光强度（右侧纵轴，以任意单位表示）进行分析。OFX处理开始（5 µg·mL⁻¹）以红色虚线表示，OFX去除以蓝色虚线表示。请点击此处查看该图的放大版本。

视频 1：E. coli HU-mCherry 细胞在氧氟沙星处理前、处理中及处理后的微流控视频。 微流控延时成像显示 HU-mCherry 标记的细胞。细胞在 MOPS 甘油 0.4% 培养基中培养 4 小时后，接受 6 小时的 OFX 处理（5 µg·mL⁻¹），随后向微流控芯片中灌注不含抗生素的培养基，使持留细胞恢复生长。比例尺 = 5 µm。时间（单位：分钟）已标注。生长与恢复阶段标注为“MOPS- Gly. 0.4%”，OFX 处理阶段标注为“OFX 5 µg/mL”。请点击此处下载该视频。

10x MOPS
	储备液	1 L 10倍MOPS储存液所需原液体积	10x MOPS 缓冲液中的终浓度
MOPS酸	1 M（用KOH调节pH至7.4）	400 mL	0.4 M
Tricine	1 M（用KOH调节pH至7.4）	40 mL	0.04 M
FeSO₄·7H₂O2O	0.01 M	10 mL	0.0001 M
NH4Cl	1.9 M	50 mL	0.095 M
K2SO4	0.276 M	10 mL	0.00276 M
CaCl2.2H2O	0.0005 M	10 mL	0.000005 M
MgCl2·6H₂O	0.528 M	10 mL	0.00528 M
NaCl	直接加入 29.2 g		0.5 M
蒸馏水		460 mL
微量营养素 1000x（见表2）		10 mL

表1：10x MOPS 的成分组成。

微量元素 1000x
	微量元素 1000x 储存液中的浓度	10x MOPS 基础液中的终浓度
(NH4)6Mo7O24.4H2O	0.000003 M	0.00000003 M
H3BO3	0.0004 M	0.000004 M
CoCl2.6H2O	0.00003 M	0.0000003 M
CuSO4.5H2O	0.00001 M	0.0000001 M
MnCl2.4H2O	0.00008 M	0.0000008 M
ZnSO.7H2O	0.00001 M	0.0000001M

表2：1,000倍微量营养素的组成。

MOPS 葡萄糖 0.4% 或 MOPS 甘油 0.4%
	储存液	配制 1 L MOPS 葡萄糖 0.4% 或 MOPS 甘油 0.4% 所需体积	MOPS 葡萄糖 0.4% 或 MOPS 甘油 0.4% 中的终浓度
10x MOPS	见表 1	100 mL
K2HPO4	0.132 M	10 mL	0.00132 M
葡萄糖（用于 MOPS 葡萄糖 0.4%）	20%（20 g 溶于 100 mL 蒸馏水）	20 mL	0.40%
甘油（用于 MOPS 甘油 0.4%）	≤99%	4 mL	0.40%
蒸馏水		MOPS 葡萄糖 0.4% 需 870 mL，MOPS 甘油 0.4% 需 886 mL

表3：0.4% MOPS葡萄糖和0.4% MOPS甘油培养基的组成。

讨论

本文所述方案可用于在群体和单细胞水平上分析对抗生素处理产生反应的持留表型。实验使用了 E. coli MG1655菌株在化学成分明确的培养基（MOPS甘油0.4%）中培养。时间-杀灭曲线实验和显微镜实验均在对数生长期的培养物上进行。我们使用了浓度为5 μg·mL的氟喹诺酮类抗生素氧氟沙星（OFX）⁻¹ 以揭示持留细胞。此处描述的方法可应用于其他杀菌性抗生素，如β-内酰胺类、氨基糖苷类或抗菌化合物。³¹因此，也可使用其他细菌菌株、培养基或培养条件。采用与本文所述相似的实验设置来监测不同的荧光融合蛋白，有助于追踪DNA复制等细胞过程³²DNA修复^25,33，以及细胞分裂³⁴ 抗生素处理前、处理中和处理后的细胞生理变化。类似地，可利用荧光报告系统研究细胞生理学的不同方面，例如细胞内pH³⁵，ATP³⁶，或活性氧（ROS）³⁷ 水平。除了荧光融合蛋白外，也可使用化学染料。例如， hupA-mCherry 融合可被4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）替代，这是一种可染色DNA的荧光染料³⁸然而，应避免将延时显微镜与这类荧光染料联用，因为这些染色技术可能在延时实验过程中干扰细胞周期的动态变化。 Alternatively，此类实验可由在关键时间点进行的快照成像的时间序列分析来替代。

尽管这类荧光报告系统具有帮助作用，但不应忽视通过相差图像分析所能获取的信息量。在此，我们监测了细胞长度在整个生长、氧氟沙星（OFX）处理及恢复阶段的演变过程。利用适当的软件（如 MicrobeJ²⁷），还可轻松提取基于相差图像的其他参数，例如细胞宽度、相差强度以及细菌细胞的曲率。

总之，此处描述的方法可应用于其他条件和细菌种类，以监测细胞对变化环境或应激因素的响应^18,19。通过结合使用其他荧光报告系统（如转录和翻译报告系统、化学染料）以及群体分析方法（例如流式细胞术/FACS），可以在多尺度框架下探讨一系列有趣的科学问题。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Axio Observer	Zeiss		倒置荧光显微镜
CaCl2.2H2O	默克	1.02382.0250	0.4% MOPS葡萄糖和0.4% MOPS甘油生长培养基
CellASIC ONIX 微流控系统	默克	CAX2-S0000	微流控系统
CellASIC ONIX2 FG	默克	ONIX2 1.0.1	微流控软件
CellASIC ONIX2 流体控制平台基础组件	默克	CAX2-MBC20	多通管路系统
CoCl2.6H2O	默克	1.02539.0100	用于 MOPS 葡萄糖 0.4% 和 MOPS 甘油 0.4% 生长培养基
CuSO₄4.5H2O	默克	1.02790.0250	0.4% MOPS葡萄糖和0.4% MOPS甘油生长培养基
D-(+)-葡萄糖	Sigma Aldrich	G7021-1KG	MOPS 葡萄糖 0.4% 生长培养基的碳源
E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+)		BE10	野生型参考菌株，实验室菌株
E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) hupA-mCherry::FRT-kan-FRT		BE16	通过P1转导在天然位点整合HU-mCherry融合蛋白，实验室菌株
FeSO₄·7H₂O2O	VWR Chemicals	24244.232	0.4% MOPS葡萄糖和0.4% MOPS甘油生长培养基
Fiji	ImageJ	https://fiji.sc/	图像软件；若在出版物中使用，请引用 Schindelin 等人
甘油	默克	56815	MOPS 甘油 0.4% 生长培养基的碳源
Greiner CELLSTAR® 多孔培养板	默克	M8812-100EA	24孔透明平底2 ml容积培养板，适用于自动酶标仪
H3BO3	Sigma-Aldrich	B6768-1KG	0.4% MOPS葡萄糖和0.4% MOPS甘油生长培养基
滨松ORCA Flash 4.0数字相机	滨松	C13440-20CU	数字图像采集
K2HPO4	默克	1.05099.1000	0.4% MOPS葡萄糖和0.4% MOPS甘油生长培养基
KOH	默克	1.05029.1000	0.4% MOPS葡萄糖和0.4% MOPS甘油生长培养基
K2SO4	默克	1.05153.0500	0.4% MOPS葡萄糖和0.4% MOPS甘油生长培养基
Luria-Broth 琼脂培养基	Invitrogen	22700041	平板检测用培养基
Luria-Broth 培养基	Invitrogen	12780029	用于 MIC 测定的培养基
MgCl2.6H2O	默克	1.05832.1000	0.4% MOPS葡萄糖和0.4% MOPS甘油生长培养基
MgSO4	默克	7487-88-9	用于细菌存活率检测的稀释液，使用浓度为10 mM
MicrobeJ	ImageJ/Fiji 插件	https://www.microbej.com/	显微镜图像分析插件。Ducret 等人发表中；检测设置：针对细菌：面积（μm2）：0,1-最大值；长度（μ米）：0，5-最大值；宽度（μ米）：0,6-最大值；范围（μm）：0,5-最大值；角度（rad）：0-0,3；其余所有参数均为0-最大值。
Microfluidic Plates CellASIC ONIX	默克	B04A-03-5PK	微流控系统用板
MnCl2.4H2O	默克	1.05927.0100	0.4% MOPS葡萄糖和0.4% MOPS甘油生长培养基
MOPS，游离酸 ULTROL® 等级	默克	475898-500GM	用于 MOPS 葡萄糖 0.4% 和 MOPS 甘油 0.4% 生长培养基
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886-1KG	0.4% MOPS葡萄糖和0.4% MOPS甘油生长培养基
(NH4)6Mo7O24.4H2O	默克	1.01180.0250	MOPS 葡萄糖 0.4% 和 MOPS 甘油 0.4% 生长培养基
NH4Cl	默克	1.01145.0500	0.4% MOPS葡萄糖和0.4% MOPS甘油生长培养基
氧氟沙星	默克	82419-36-1	用于治疗细菌细胞的氟喹诺酮类抗生素
磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4，1×	默克	P3813	稀释缓冲液
GENESYS 10S 紫外-可见分光光度计	赛默飞世尔科技	840-208200	紫外-可见分光光度计，单/六联池架带打印机，光密度OD600nm测定
SoftMax Pro	Molecular Devices		微孔板读板仪软件
SpectraMax i3x	Molecular Devices		酶标仪
N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸éthyl)-méthyl]-甘氨酸	默克	1.08602.0250	0.4% MOPS葡萄糖和0.4% MOPS甘油生长培养基
Zeiss® 浸油 518F	Zeiss		用于提高显微镜分辨率的镜油
Zen3.2 Pro	Zeiss		显微图像采集与处理软件
ZnSO₄·7H₂O2O	默克	1.08883.0500	0.4% MOPS葡萄糖和0.4% MOPS甘油生长培养基