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方法文章

小鼠轻度创伤性脑损伤的电磁控制闭合式头部模型

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DOI：

10.3791/64556

⸱

2022年9月28日

 ,  , 
1Spinal Cord & Brain Injury Research Center, University of Kentucky, 2Department of Neuroscience, University of Kentucky, 3Sanders-Brown Center on Aging, University of Kentucky

本文内容

摘要

本方案描述了小鼠模型中的轻度创伤性脑损伤。具体而言，详细阐述了一步一步诱导轻度中线闭合性头部损伤的方法以及该动物模型的表征。

摘要

为了测试治疗干预措施并理解创伤性脑损伤（TBI）如何改变脑功能的机制，需要具有明确病理特征且高度可重复的动物模型。由于临床上TBI的表现形式和严重程度多种多样，因此必须建立多种动物模型以模拟这些不同方面。本文描述了一种采用中线闭合性头部损伤（CHI）方法建立轻度TBI小鼠模型的技术。该模型被定义为轻度，因其不会导致基于神经影像学或大体神经元丢失可见的结构性脑损伤。然而，单次冲击所引发的病理变化足以导致损伤后至少1个月内可检测到的认知功能障碍。本文详细阐述了使用立体定位引导的电磁撞击装置在小鼠中诱导CHI的逐步操作方案。该轻度中线CHI模型的优点在于损伤所致改变具有高度可重复性，且动物死亡率低。该模型在损伤后长达1年的时间范围内，已对神经影像学、神经化学、神经病理学及行为学变化进行了时间特征表征。该模型与使用相同撞击装置的开颅控制性皮层撞击模型互为补充，因此实验室可利用同一撞击设备同时建立轻度弥漫性TBI模型和局灶性中至重度TBI模型。

引言

创伤性脑损伤（TBI）由作用于大脑的外部力量引起，常与跌倒、运动损伤、身体暴力或交通事故相关。2014年，美国疾病控制与预防中心（CDC）统计显示，有253万美国人因TBI相关事故前往急诊科寻求医疗救助1。由于轻度TBI（mTBI）占所有TBI病例的大多数，过去几十年来已采用多种mTBI模型，包括落锤法、活塞驱动的闭合性头部损伤、可控皮层冲击、旋转性损伤、轻度液体脉冲损伤以及爆炸伤模型2,3。这些mTBI模型的异质性有助于研究在患者中观察到的不同mTBI特征，并有助于评估与脑损伤相关的细胞和分子机制。

在常用的闭合性头部损伤模型中，最早且应用最广泛的模型之一是重物坠落法，即从特定高度将物体坠落到动物头部（麻醉状态或清醒状态）2,4。在重物坠落法中，损伤的严重程度取决于多个参数，包括是否进行开颅手术、头部是否固定，以及下落物体的重量和下落距离2,4。该模型的一个缺点是损伤严重程度变异性大，并且常伴随呼吸抑制导致的高死亡率5,6。一种常见的替代方法是使用气动或电磁装置施加冲击，可直接作用于暴露的硬脑膜（可控性皮层冲击：CCI）或闭合的颅骨（闭合性头部损伤：CHI）。活塞驱动型损伤模型的优点在于其高度可重复性和低死亡率。然而，CCI需要进行开颅手术7,8，而开颅手术本身会引发炎症反应9。相比之下，CHI模型无需开颅。如前所述，每种模型均有其局限性。本文所述CHI模型的一个局限性在于手术需使用立体定位仪固定动物头部，导致头部完全固定。尽管完全固定可确保实验的可重复性，但无法模拟冲击后头部的运动，而这种运动可能对轻度创伤性脑损伤（mTBI）相关的损伤机制产生影响。

本方案描述了一种使用市售的电磁式冲击装置在小鼠中实施闭合性头部损伤（CHI）的基本方法10。该方案详细说明了实现高度可重复性损伤所需的精确参数。特别是，研究者可对损伤深度、停留时间和冲击速度等参数进行精确控制，从而准确定义损伤的严重程度。如文中所述，该CHI模型可产生双侧病理改变，包括弥散性和微观性损伤（如胶质细胞的慢性活化、轴突损伤和血管损伤），并伴随行为学表型11,12,13,14,15。此外，所描述的模型被认为属于轻度损伤，因其即使在损伤后1年，也不会在MRI或病理学检查中引起结构性脑损伤或明显的组织病变16,17。

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方案

实验已获得肯塔基大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准，研究过程中遵循了ARRIVE指南和《实验动物照护与使用指南》中的相关规定。

1. 手术准备

注意：小鼠以每笼4-5只群养，饲养房间湿度维持在43%-47%，温度维持在22-23 ˚C。小鼠给予 随意摄取 自由获取食物和水，并置于12小时光照/12小时黑暗循环（上午7点/下午7点）环境中。

  1. 使用指定的手术区域（如超净台或专用手术室）进行动物手术。
  2. 确保手术区域配备加热垫、带有电磁撞击器的立体定位仪，以及用于输送异氟烷气体的麻醉面罩（见图1A）。
  3. 确保实施手术的外科医生或相关人员穿戴洁净的实验服、口罩、手套和手术帽。
  4. 使用无菌手术器械、无菌棉签和纱布垫。在手术当天，每只小鼠之间使用热珠灭菌器对器械进行灭菌。
  5. 在术前准备区使用麻醉诱导舱对小鼠进行手术前麻醉准备。
  6. 使用加热垫维持动物体温，使用清洁的术后小鼠饲养笼，并使用计时器记录小鼠术后翻正反射的时间。

2. 术前准备

  1. 准备头部支撑装置（见图1B）。
    1. 从1 mL乳胶移液器球（可充气端）上取下卷边末端（见图1C）。
    2. 使用Parafilm将球体连接到管路上（见图1C）。
    3. 使用三通阀将管路连接至10 mL注射器，并用注射器吸入水（见图1C）。
      注意：1 mL乳胶移液器球将置于小鼠头部下方，以使冲击力避开耳朵。使用前应尽可能排出球体内的空气，使球体主要充满水而非空气。
  2. 冲击器设置。
    1. 选择5 mm探针头，将其拧入致动器底部中央的活塞（位于较大圆筒内部），并轻轻拧紧探针，避免施加过大的力。每次冲击之间需重新拧紧探针头（见图1B）。
    2. 在开启冲击器之前，确保伸展/收缩开关处于中间“关闭”位置。然后将致动器上的电缆连接至冲击器控制箱前面板的插孔，并将传感器电缆连接至前面板的另一插孔。最后打开后面板上的电源开关（见图1D）。
      注意：当不使用时，伸展/收缩拨动开关必须保持在中间“关闭”位置。
    3. 通过旋转控制箱左侧的大旋钮，设置冲击速度，直至显示屏上显示冲击速度为5.0 ± 0.2 m/s（见图1D）。
    4. 通过旋转调节旋钮，将驻留计时器 设置为100 ms，直至显示读数为0.01（见图1D）。
      注意：驻留时间是指自动回缩前的接触持续时间。
    5. 将冲击器致动器放置在冰袋上，以防止塑料圆筒膨胀，否则会导致圆筒卡住，无法移动，从而影响后续冲击的施加（见图1E）。
  3. 准备小鼠进行手术。
    1. 手术前目视检查小鼠，若发现以下任一情况，则将其排除在研究之外：毛发状况差、嗜睡或体重过低（4月龄小鼠体重<20 g）。
    2. 将小鼠置于加热垫上的诱导室中，使用100%氧气携带4%-5%异氟烷麻醉1-2分钟。
    3. 使用电动毛发剪去除手术区域的毛发。
    4. 用无菌酒精棉片清洁头部，并在剃除毛发的头皮上涂抹局部麻醉剂，至少在手术开始前15分钟完成。
    5. 在手术前将小鼠放回干净的暂养笼中。在局部麻醉剂作用至少15分钟后开始手术（诱导时间）。
      注意：麻醉所需时间可能因所用麻醉剂的不同而有所差异。
  4. 再次检查立体定位仪框架、冲击器和数字立体定位显示屏（见图1F）是否已准备就绪，可投入使用。
  5. 将小鼠放回含有100%氧气携带4%-5%异氟烷的诱导室中，持续约3分钟。
  6. 将小鼠固定在头部固定装置上。

3. 手术步骤

  1. 使用轻质乙缩醛树脂锥形耳杆、咬合杆和小鼠麻醉面罩将小鼠固定在立体定位仪框架中（见图1G、H）。异氟烷气体以2%-3%浓度在室空气中以100-200 mL/min流速输送。密切监测小鼠呼吸，以确保麻醉深度，并根据需要调整气体浓度。
  2. 在眼睛上涂抹无菌眼用润滑剂，防止角膜干燥。
  3. 用聚维酮碘棉签和无菌酒精棉片对头皮进行三次消毒。
  4. 通过确认小鼠无足趾夹捏反应，确保其处于深度麻醉状态。
  5. 使用手术刀在眼睛与颈部之间沿中线做约1 cm长的头皮切口，暴露颅骨（见图1I）。
  6. 让颅骨干燥1-2分钟。
  7. 确定前囟（冠状缝与矢状缝的交点）和后囟（矢状缝与人字缝的交点）（见图1J）。
    注：可参考小鼠脑图谱作为定位依据。
  8. 将头部支撑装置置于小鼠头部下方，并用水充盈球囊，直至其轻压小鼠头部底部，但不使头部脱离咬合杆。
    注：此步骤对减少闭合性头部损伤（CHI）可能引起的耳部问题至关重要。若耳杆造成耳部损伤，出现卷曲或出血，该动物应从实验中剔除并实施安乐死。
  9. 将撞击器移至动物头部正上方位置。
  10. 将撞击器控制盒上的伸展/回缩拨动开关置于伸展位置，使撞击器伸出。
    注：务必通过向下轻拉尖端确认其已完全伸出。
  11. 调整撞击器位置，使其精确对准前囟中心（见图1K）。
  12. 在立体定位读数器的触摸屏控制界面上，将数字立体定位x和y坐标重置为0。
  13. 通过将探针从前囟移动至目标坐标（内侧-外侧 = 0.0 mm，前-后 = −1.6 mm），将探针对准撞击位置。
  14. 将接触传感器夹在动物耳朵上。
    1. 缓慢降低已伸出的探针尖端，直至首次接触颅骨表面，听到蜂鸣声后立即停止。
    2. 在立体定位读数器中将数字立体定位z坐标重置为0。
  15. 仔细检查探针尖端是否与颅骨表面齐平（在内侧-外侧和前-后平面上）。
    注：探针尖端的定位是该操作中最关键的步骤，以避免颅骨骨折和耳部损伤。
  16. 将控制盒上的拨动开关置于“回缩”位置，使撞击器回缩。此时探针尖端收回，不再与动物头部接触，直至撞击发生。
  17. 通过将背-腹方向深度调节至−1.2 mm来设定撞击深度。
    注：撞击深度影响损伤严重程度。应根据不同年龄、体重和品系的小鼠对深度进行滴定，以达到所需的损伤程度。为维持一致的损伤严重性，可能需要随时间调整或重新滴定深度。损伤严重性可通过神经病理学方法（如小胶质细胞和星形胶质细胞的免疫组化染色）以及行为学测试（如放射臂水迷宫和主动回避实验）进行评估。
  18. 密切监测小鼠呼吸，确保麻醉深度，并根据需要调整气体浓度。
    注：通常在撞击前10-20秒应降低或关闭异氟烷气体浓度。密切观察呼吸是否略有加快。若撞击时呼吸过慢，动物可能因呼吸暂停而在撞击后60秒内死亡。此情况可通过在撞击前数秒调整麻醉深度加以预防。
  19. 按下右侧拨动开关至撞击位置以触发撞击。探针尖端以设定速度下压，保持预设的停留时间后自动回缩。
    注：假手术小鼠接受与CHI小鼠相同的操作处理，但不施加实际撞击。
  20. 在闭合性头部损伤（CHI）撞击完成后立即启动计时器，记录翻正时间（从侧卧位恢复至俯卧位所需时间）；对于假手术小鼠，则在将其移出立体定位仪框架时开始计时。平均翻正反射时间为5-15分钟。
    注：翻正反射时间可能因小鼠品系和年龄而异。
  21. 评估小鼠是否存在可见的颅骨骨折、出血或呼吸暂停。出现凹陷性颅骨骨折或明显出血的小鼠应从研究中剔除。
    注：颅骨骨折存在不同程度。对于减压性颅骨骨折（即骨片明显压迫脑组织）的动物，应实施安乐死（先使用CO2，再以断头作为辅助方法）。若撞击器尖端设置正确，此类严重颅骨骨折极为罕见。若发生颅骨骨折，更常见的表现为颅骨表面出现少量血滴及轻微触感粗糙，通常位于鼻骨后端连接的缝线上。此类小鼠应在记录中标注为“可能颅骨骨折”，但通常不从研究中剔除。
  22. 将动物从小鼠立体定位仪框架中取出。
  23. 使用皮肤缝合钉闭合头皮切口。
    注：也可使用可吸收或不可吸收缝线代替缝合钉闭合头皮。
  24. 使用无菌棉签将三重抗生素软膏涂抹于闭合的切口处。
  25. 将小鼠放回清洁的暂养笼中进行恢复。恢复笼的一半置于加热垫（低档），以便动物清醒后可自行远离热源，同时在意识未恢复期间维持体温（见图1L）。
    注：将小鼠侧卧放置于恢复笼中。为防止窒息，恢复笼内应无垫料，或仅铺一层纸巾（如有垫料存在）。
  26. 将伸展/回缩拨动开关恢复至居中/关闭位置。
    注：若开关停留在“伸展”或“回缩”位置，电流将持续通过，导致活塞膨胀。撞击器将无法正常工作，直至活塞冷却。
  27. 从支架上取下撞击器，并轻轻放置于冰袋上。
    注：将撞击器置于冰袋上有助于减少其潜在的膨胀风险。
  28. 持续监测动物直至翻正反射出现，并记录翻正所需时间（见图1M）。
    注：翻正反射定义为小鼠恢复至俯卧位的时刻。监测期间应保持笼子不受干扰；若触碰、移动笼子或产生噪音，可能诱发小鼠翻正。
  29. 当小鼠清醒且警觉后，将其送回原饲养笼。通常在损伤后1小时内，动物即可完全恢复意识并自由活动。同时，在笼底添加一些湿润食物。

4. 术后护理

  1. 术后对动物进行为期5天的监测。
  2. 记录其体重以及任何生理或行为变化，如呼吸频率（定性呼吸功能）、步态、身体和毛发状况、进食、饮水、排便和排尿情况。
  3. 观察小鼠是否有不适迹象，以及手术伤口是否出现肿胀、渗出物、发红边缘或裂开。若动物表现出疼痛或不适症状（如发声、不动、低体温、不饮水或不进食），请立即联系兽医。
  4. 术后7–10天在麻醉状态下于加热垫上拆除钉合钉。
    ​注意：若使用不可吸收缝线，须在术后7–10天于麻醉状态下拆除。

5. 清洁

  1. 清洁并消毒手术区域和器械。
  2. 每次使用后以及每日工作结束时，用酒精棉片清洁探头尖端。
    注意：撞击器在出厂时已校准，据报告其性能在长时间使用中保持稳定，无需常规校准。然而，应定期检查撞击器和立体定位仪。此外，应监测模型终点指标，如翻正反射时间、死亡率和神经病理学变化，以评估可能的实验偏差。

6. 排除标准

  1. 手术前排除健康状况不佳的动物，例如4个月大的小鼠体重 <20 g、精神萎靡或毛发状态差。
  2. 排除手术过程中出现并发症的动物，例如凹陷性颅骨骨折、与手术相关的明显出血或耳部出血。
  3. 若动物术后出现以下症状，应将其排除出研究：无法正常进食和/或活动、发出异常叫声、体重下降，或术后伤口愈合不良。
    注：该模型可作为轻度创伤性脑损伤（mild TBI）的重复模型。若小鼠在第一次手术后24小时接受第二次手术，则可拆除 staples 或缝线，并使用同一切口暴露颅骨。若两次手术间隔时间较长，则需制作新的切口。

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结果

这种立体定位电磁撞击装置具有多种用途，可用于开颅的可控皮层撞击（CCI）或闭合性头部损伤（CHI）手术。此外，通过调节撞击速度、停留时间、撞击深度、撞击头类型和损伤靶点等参数，可调控损伤的严重程度。本文描述了一种使用5.0 mm钢制撞击头进行的CHI手术。该损伤属于轻度，因为不会造成脑组织结构性病变。在成年小鼠中，死亡率低于0.9%11,14，而在老年小鼠（>8个月龄）中略升高，约为2.5%11。死亡通常发生在撞击后的最初2分钟内，主要原因是呼吸暂停，但通过在撞击前数秒内密切监测麻醉深度，可显著预防该情况的发生。

该CHI模型的优点在于，冲击可导致双侧弥漫性病理改变，而无需暴露皮层硬脑膜表面（开颅手术）。另一项使其成为有效TBI模型的特征是，由于手术后颅骨骨折或耳部问题而被排除在研究之外的小鼠比例低于1%。重要的是，该模型通过单次冲击即可产生神经病理学和行为学功能障碍，从而降低了与重复性轻度CHI模型相关的实验复杂性<...

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讨论

使用所述模型重建一致的损伤模型涉及多个步骤。首先，必须将动物正确固定在立体定位仪框架中。动物头部不得发生侧向移动，颅骨应完全水平，前囟和后囟的坐标读数需一致。正确放置耳杆是该手术中最困难的部分，只能通过练习掌握。如果颅骨不水平，则应在诱导闭合性头部损伤（CHI）前调整头部位置。若未调整头部定位，将导致颅骨骨折。为评估颅骨是否水平，应从冲击头端周围的各个角度观察颅骨与冲击头端之间的间隙。出现凹陷性颅骨骨折的小鼠应排除在实验之外，因为与未发生颅骨骨折的小鼠相比，它们具有更强的炎症反应和更严重的损伤19。此外，发生颅骨骨折的小鼠表现出更严重的创伤性脑损伤（TBI）后果，例如创伤后呼吸抑制、继发性反跳性损伤，最终可能导致死亡20。

在本研究中，使用耳杆固定动物的头部。特别需要注意的是，仅推荐使用专为小鼠设计的锥形尖端乙缩醛树脂耳杆，而不应使用适用于大鼠的大型耳杆。虽然可以使用不穿刺的橡胶尖端耳杆，但这类耳杆会压迫颅骨，改变闭合性头部损伤（CHI）的生物力学特性，且实验重复性较差。此外，使用耳杆存...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作部分由美国国立卫生研究院资助，资助编号为 R01NS120882、RF1NS119165 和 R01NS103785，以及美国国防部资助编号 AZ190017。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院或美国国防部的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
9 mm 自动夹施加器Braintree scientificACS- APL外科手术
9 mm 自动夹移除器Braintree scientificACS- RMV外科手术
9 mm 自动夹，每盒 1,000 个Braintree scientificACS- CS外科手术（缝合钉）
Aperio ImageScope 软件 Leica BioSystemsNA 免疫组化
BladeFLASK 刀片移除器Fisher Scientific22-444-275外科手术
棉签涂抹器VWR89031-270外科手术
数字小鼠立体定位仪Stoelting51730D外科手术
Dumont #7 镊子RobozRS-5047外科手术
耳杆Stoelting51649外科手术
EthoVision XT 11.0 Noldus Information TechnologyNA放射状八臂迷宫水迷宫 
Fiber-LiteDolan-Jeffer IndustriesUN16103-DG外科手术
Fisherbrand 小移液管用吸头Fisher Scientific03-448-21头部支撑装置
Gemini 避免系统San Diego InstrumentsNA主动回避
加热垫Sunbeam 732500000U术前准备
HRP 标记的山羊抗兔 IgG Jackson Immuno Research laboratories111-065-144 免疫组化
诱导室Kent ScientificVetFlo-0530XS术前准备
异氟烷，USPCovetrusNDC: 11695-6777-2外科手术
小鼠气体麻醉头部固定器Stoelting51609M外科手术
Neuropactor 立体定位撞击器Neuroscience Toolsn/a外科手术：曾由 Lecia 以 Impact One 名义销售
NexGen 小鼠 500Allentown n/a术后饲养笼
Parafilm 封口膜BemisPM992头部支撑装置
Peanut - 专业理发剪Whal8655-200 术前准备
聚维酮碘溶液 USP，10% (w/v)，含有效碘 1% (w/v)，用于实验室Ricca3955-16外科手术
Puralube Vet 软膏，凡士林眼用软膏，无菌眼润滑剂Dechra17033-211-38外科手术
兔抗 GFAP 抗体 DakoZ0334免疫组化
兔抗 IBA1 抗体 Wako019-19741免疫组化
八臂放射状水迷宫MazeEngineersn/a放射状八臂迷宫水迷宫 
天平OHAUS CS 系列BAL-101术前准备
7 号实心手术刀柄，6.25 英寸" RobozRS-9847外科手术
无菌酒精擦拭垫（70% v/v 异丙醇）Fisher Brand22-363-750术前准备
SumnoSuite 低流量麻醉系统Kent ScientificSS-01外科手术
10 mL 鲁尔锁接头注射器BD Bard-Parker302995头部支撑装置
计时器Fisher Scientific6KED8外科手术
局部麻醉乳膏L.M.X 4NDC 0496-0882-15术前准备
三重抗生素软膏MajorNDC 0904-0734-31术后护理
管路MasterFlex96410-16头部支撑装置
单通道麻醉系统蒸发器Kent ScientificVetFlo-1210S术前准备

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闭合性头部损伤小鼠TBI模型电磁冲击器立体定位仪认知功能障碍神经影像学分析行为学评估控制性皮层冲击弥漫性脑损伤
小鼠轻度创伤性脑损伤的电磁控制闭合式头部模型
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