工程人造血干细胞和祖细胞中的致癌杂合功能获得突变

Summary

忠实地模拟造血干细胞和祖细胞（HSPC）体细胞突变的新策略对于更好地研究造血干细胞生物学和血液恶性肿瘤是必要的。在这里，描述了通过结合使用CRISPR / Cas9和双rAAV供体转导来模拟HSPC中杂合功能获得突变的方案。

Abstract

在其一生中，造血干细胞和祖细胞（HSPC）获得体细胞突变。其中一些突变改变了HSPC的功能特性，如增殖和分化，从而促进血液系统恶性肿瘤的发展。需要对HSPC进行有效和精确的遗传操作，以建模，表征和更好地了解复发性体细胞突变的功能后果。突变可能对基因产生有害影响并导致功能丧失（LOF），或者形成鲜明对比的是，可能增强功能，甚至导致特定基因的新特征，称为功能获得（GOF）。与LOF突变相反，GOF突变几乎完全以杂合方式发生。目前的基因组编辑方案不允许选择性靶向单个等位基因，从而阻碍了模拟杂合子GOF突变的能力。在这里，我们提供了一个详细的协议，说明如何通过结合CRISPR / Cas9介导的同源定向修复和重组AAV6技术来设计人类HSPC中的杂合GOF热点突变，以实现高效的DNA供体模板转移。重要的是，该策略利用双荧光报告系统来跟踪和纯化成功的杂合编辑HSPC。该策略可用于精确研究GOF突变如何影响HSPC功能及其向血液恶性肿瘤的进展。

Introduction

随着成簇规则间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9技术的发展，科学家的工具包中增加了一种新的极其强大的仪器。该技术允许基因组的精确工程，并且已经证明自己不仅对研究目的非常有用（Hsu等人¹中审查），而且最近也已成功转化为临床环境²，^3，4。CRISPR/Cas9编辑策略依赖于Cas9蛋白和单向导RNA（sgRNA）的活性⁵，^6，7。在宿主细胞中，Cas9蛋白被引导到DNA中与sgRNA序列互补的特定位点，并将引入DNA双链断裂（DSB）。一旦生成DSB，就会发生两种主要且相互竞争的修复机制:非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR）。NHEJ是一种容易出错的，主要使用的修复机制导致插入和缺失（插入缺失），而HDR通过使用姐妹染色单体作为修复模板，非常精确，但仅限于^{细胞周期的}S或G2期8。在基因组工程中，HDR 可用于 DNA 的靶向修饰，方法是提供供体模板，该供体模板两侧是与 Cas9 诱导的 DSB 的两个 DNA 末端相同的同源臂（图 1）。用于 HDR 的捐赠者模板类型会极大地影响编辑效率。对于人类HSPC的基因工程，腺相关病毒血清6型（AAV6）最近被描述为递送单链^DNA模板的极好载体9^，10。

CRISPR / Cas9基因组工程可用于治疗性纠正有害突变¹¹ ，但也可用于将致病突变引入DNA以模拟癌症发展¹²。血癌，如白血病，通过健康HSPC中体细胞突变的顺序获得 而 发展^13，14。早期遗传事件导致克隆增殖优势，导致不确定潜力的克隆造血（CHIP）^15，16。突变的进一步获得最终将导致白血病转化和疾病的发展。体细胞突变可以在控制自我更新、存活、增殖和分化的基因中找到¹⁷.

通过基因组工程 将 单个突变引入健康的HSPC可以精确地模拟这种逐步白血病生成过程。在骨髓性肿瘤（如急性髓性白血病（AML））中发现的复发性突变数量有限^18，19 使这种疾病特别适合使用基因组工程工具进行概括。

体细胞突变可能只出现在一个等位基因（单等位基因/杂合突变）或两个等位基因（双等位基因/纯合突变）上，并且可以对基因的功能产生深远的影响，这可能导致功能丧失（LOF）或功能获得（GOF）。LOF突变导致基因的LOF减少（如果一个等位基因受到影响）或完全（如果两个等位基因都受到影响），而GOF突变导致基因的激活或新功能增加。GOF突变通常是杂合的²⁰。

重要的是，合子性（异合子与纯合子）对尝试忠实地模拟突变具有重大意义;因此，仅对基因的一个等位基因进行靶向操作对于设计杂合热点GOF突变是必要的。容易出错的NHEJ导致不同长度的插入缺失²¹ ，这可能导致不同的，不可预测的生物学后果。然而，由于NHEJ是引入DSB后细胞采用的主要修复程序，因此目前用于操纵HSPC的大多数CRISPR / Cas9平台都不允许精确预测遗传结果^22，23。相比之下，引入 CRISPR/Cas9 介导的双链断裂 （DSB），结合使用基于重组腺相关病毒 （rAAV） 载体的 DNA 供体模板通过 HDR 进行 基因组工程，允许在人类 HSPC 中插入等位基因特异性突变^11，24。可以同时整合突变体和野生型（WT）序列，并在单个等位基因上结合不同的荧光报告基因，以选择杂合基因型（图2）。该策略可用作精确表征复发性、白血病性、杂合性 GOF 热点突变对 HSPC 功能、疾病起始和进展的影响的有力工具。

本文提供了原代人HSPC中复发性突变杂合GOF突变的有效工程的详细方案。该策略结合了CRISPR / Cas9和双AAV6转导的使用，为杂合GOF突变的预期生成提供WT和突变DNA供体模板。例如，钙网蛋白（CALR）基因中复发性1型突变（52 bp缺失）的工程将显示²⁵。 CALR 外显子 9 中的杂合 GOF 突变经常见于骨髓增殖性疾病，例如原发性血小板增多症 （ET） 和原发性骨髓纤维化 （PMF）²⁶。CALR是一种内质网驻留蛋白，在新合成蛋白质的折叠过程中主要具有质量控制功能。其结构可分为三个主要结构域:参与蛋白质伴侣功能的氨基（N）末端结构域和富含脯氨酸的P结构域，以及参与钙储存和调节的C结构域^27，28。 CALR 突变导致 +1 帧偏移，导致新型扩展 C 端的转录和内质网 （ER） 保留信号 （KDEL） 的丢失。突变型 CALR 已被证明可结合血小板生成素 （TPO） 受体，从而导致 TPO 非依赖性信号传导，增殖增加²⁹。

图 1:NHEJ 和 HDR 修复。 在DNA中引入双链断裂后NHEJ和HDR修复机制的简化示意图。 请点击此处查看此图的大图。

图 2:双等位基因 HDR 编辑策略的示意图。 示意图显示了供体模板与目标等位基因的整合，然后将它们翻译成功能性mRNA。橙色虚线框表示对应于左同源臂 （LHA） 和右同源臂 （RHA） 的区域。每个 HA 的理想大小为 400 bp。绿色虚线框表示对应于 SA 序列的区域。SA 的大小为 150 bp。 请点击此处查看此图的大图。

Protocol

该协议要求使用健康的供体来源的CD34 ⁺ HSPC，并需要当地机构审查委员会（IRB）的伦理批准和签署的知情同意书。该方案中使用的CD34 ⁺ HSPC是从足月分娩（妊娠>34周）的脐带血（UCB）中分离出来的。分娩前获得了母亲的知情同意，并从格拉茨医科大学获得了收集UCB的伦理批准（IRB批准:31-322 ex 18/19）。该协议中使用的材料的完整列表可以在 材料表中找到。

1. sgRNA设计与切割效率评估

1. 在在线数据库工具（例如，COSMIC，https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic）上搜索所需突变的位置和正确的转录本。
2. 使用 sgRNA 设计工具选择与突变相邻的 sgRNA（外显子靶向）或前一个内含子（内含子靶向）。在此协议中，使用了Benchling的在线工具。有关用于sgRNA设计的可能在线工具列表，请参阅 材料表 。
3. 选择 + （创建） 选项 > DNA 序列 > 导入 DNA 序列 > 从数据库导入。输入所需的基因，例如 CALR，然后选择人类作为物种 > 搜索 > 选择正确的转录本（例如，CALR-201 -ENST00000316448）> 导入。选择要引入DS中断的感兴趣区域（例如，内含子7）。
4. 选择屏幕右侧的 CRISPR 选项，然后选择 设计和分析指南。选择 单个导流板，将导板长度保持在20 bp，并使用SpCas9（NGG）进行编辑PAM序列。
5. 选择一个目标分数高（在所需位点进行编辑的机会高）和高脱靶分数（在不需要的位点进行编辑的机会低）的指南。选择至少三个指南进行测试，以找到性能最佳的sgRNA。从商业供应商处订购 sgRNA 作为化学修饰的合成 sgRNA。
   注意:建议在此阶段订购少量合成sgRNA进行初始筛选。一旦鉴定出表现良好的 sgRNA，继续处理所选 sgRNA 的更大顺序。
6. 解冻 2 x 10 5-5 x 10⁵ CD34⁺ HSPC。 将细胞转移到补充有 1% 抗生素（例如青霉素/链霉素）的 10 mL 预热的 RPMI1640 中。
   注意:应使用纯度为>90%的CD34 ⁺ HSPC，以获得最佳和最可重复的结果。
7. 在室温（RT）下以350× g 离心10分钟。用血细胞计数器计数细胞，并将细胞悬浮在补充有 0.2% 青霉素/链霉素 （P/S）、100 ng/mL 血小板生成素 （TPO）、100 ng/mL 干细胞因子 （SCF）、100 ng/mL FMS 样酪氨酸激酶 3 配体 （FLT3L）、100 ng/mL 白细胞介素-6 （IL-6）、35 nM UM171 和 0.75 μM StemRegenin1 （SR1） 的 SFEM II 培养基中，浓度为 2.5 x 10⁵ 个细胞/mL。在37°C / 5%CO₂ 下孵育48小时 - 72小时。
   注意:从现在开始，完整的培养基将被称为HSPC保留培养基。
8. 将细胞收集在 15 mL 管中并计数细胞。通过台盼蓝排除检查细胞活力。
   1. 在开始之前，打开转染系统并选择比色皿选项。为HSPC选择合适的程序和核连接溶液（见材料表）。2 x 10 5 和⁵ x 10⁶ 个细胞可以在一个 100 μL 比色皿中进行核转染。留出少量细胞（例如，1 x 10 5-2 x 10⁵）在培养物中保持48小时以用作WT对照。
9. 准备RNP复合物。在 1.5 mL 管中，加入 15 μg Cas9 和 8 μg sgRNA（摩尔比 1:2.5），并在 25 °C 下在加热块中孵育 10 分钟。
10. 当RNP复合物孵育时，在室温下以350× g 离心细胞5分钟，并使用移液管弃去上清液。将细胞悬浮在 100 μL 核连接溶液中。
11. 将细胞与RNP复合物混合并转移到比色皿中。轻轻拍打比色皿以去除转移过程中可能形成的任何最终气泡。
12. 将比色皿插入转染系统的支架中，并使用DZ-100程序对细胞进行电穿孔。
13. 电穿孔后，立即加入 400 μL 不含 P/S 的预热 HSPC 保留培养基。
14. 用精细转移移液管将细胞转移到含有不含P / S的预热HSPC保留培养基的培养板中。 根据细胞数量，使用适当的培养板（24孔、12孔或6孔板），以达到0.25 x 10⁶ 和1 x 10⁶ 细胞/ mL之间的密度。
15. 将板转移到37°C / 5%CO₂的培养箱中。孵育核细胞6-8小时。
16. 6-8小时后，除去旧培养基并用补充有P / S的新鲜预热HSPC保留培养基替换.以2.5 x 10⁵ 和5 x 10⁵ 的浓度悬浮细胞并转移到细胞培养板（24，12或6孔板）。将细胞在37°C / 5%CO₂下孵育48小时。
17. 收获2 x 10 5个细胞，并在室温下以350 x g 离心⁵分钟。在开始之前，将加热块设置为65°C和98°C。
18. 弃去上清液并将细胞悬浮在 1.5 mL 管中的 1 mL 1x DPBS 中。在室温下以350× g 离心5分钟。
19. 弃去上清液并将细胞悬浮在 50 μL DNA 提取溶液中。涡旋15秒。
20. 在65°C孵育6分钟。 涡旋15秒，并在98°C孵育2分钟。
21. 使用引物通过PCR扩增DSB区域，引物产生约400-600 bp的扩增子，DSB位于中心。使用 0.5-1 μL 提取的 DNA 进行 PCR 反应。
    注意:由于DNA提取溶液的组成，DNA浓度无法通过分光光度法准确定量。
22. 用DNA分子量标准在100V的1.5%琼脂糖凝胶上运行PCR产物45-60分钟。将凝胶放在蓝光或紫外透射仪上。
23. 根据制造商的说明，使用市售试剂盒从凝胶中提取正确大小的DNA条带（参见 材料表）。
24. 使用PCR的正向引物或反向引物通过Sanger测序对样品进行测序。对于长度为 400-600 bp 的 PCR 产物，测序需要 75 ng 的 DNA，总体积为 15 μL 的浓度为 5 ng/mL。
25. 通过将测序文件上传到旨在通过识别 sgRNA 产生的插入和缺失来计算编辑效率的程序来分析 sgRNA 的编辑效率。选择性能最佳的 sgRNA 进行。
    注意:专用的在线工具列在 材料表中。该分析需要转染和WT HSPC的.ab1文件，sgRNA序列和PAM序列。

2. 同源定向修复（HDR）载体构建

1. HDR 模板设计
   注意:应设计两个 HDR 模板:WT 序列模板和突变序列模板。
   1. 将所需基因的基因组序列和编码序列（CDS）导入适当的分子克隆软件中（专用工具可在 材料表中找到）。从基因组序列文件中，通过在DSB的5'端选择理想的400 bp来设计左同源臂（HA）。将此序列粘贴到新文件中。
   2. 如果内含子被sgRNA靶向，则需要包括剪接受体（SA）序列。选择目标内含子的最后 150 bp 并将其粘贴到左侧 HA 之后。如果外显子是直接靶向的，则不需要此序列（图3）。
   3. 从 CDS 文件中，选择感兴趣的 cDNA。如果靶向外显子序列，请确保cDNA从DSB位点的下游立即开始，并包括目的基因的所有后续外显子以及终止密码子。如果靶向内含子，请确保cDNA以下一个外显子的第一个密码子开头。密码子优化cDNA并将其插入SA序列之后。为此，请使用专用的在线工具（材料表）。
   4. 在感兴趣的cDNA（例如SV40或bGH）之后插入3'聚腺苷酸化（PolyA）信号（表1）。在PolyA之后，插入荧光蛋白的启动子序列（例如，脾病灶形成病毒[SFFV]或多泛素C [UBC]， 表1）。
   5. 插入荧光蛋白的序列（即GFP，BFP或mCherry）。插入第二个但不同的 PolyA 信号。
      注意:插入不同的PolyA序列将避免诸如质粒的细菌重组或由于模板中有两个相同序列而导致的序列比对问题等问题。
   6. 从基因组序列文件中，通过在DSB的3'端选择理想的400 bp来设计正确的HA。在第二个 PolyA 之后插入此序列。
   7. 创建整个模板的副本并修改感兴趣的cDNA，使其包含所需突变的序列。
   8. 用不同的荧光蛋白交换荧光蛋白。例如，如果 GFP 用于 WT 模板，则将其与 BFP 或 mCherry 交换为突变模板。构建HDR模板并将其克隆到pAAV-MCS质粒（或其他合适的骨架）中。
      注意:组装所需的片段可以通过PCR生产或商业订购，并且需要包含与其相邻片段重叠的序列。如果感兴趣的突变是点突变、小插入或小缺失，则可以通过PCR在含有WT cDNA的HDR模板上进行定点诱变来产生突变的cDNA。
   9. 使用热冲击法将合格的 大肠杆菌 与组装的产品转化。在开始之前，将细菌放在冰上解冻10分钟。
   10. 将 2 μL 组装好的产物添加到 50 μL 细菌中。轻轻轻弹混合内容物。
   11. 将样品放在冰上30分钟。将样品转移到设置为42°C的热块中30秒。
   12. 将样品在冰上转移5分钟。加入 450 μL 室温 SOC 培养基，并将样品在 37 °C 下孵育 1 小时。
   13. 将样品铺展到含有氨苄西林的LB琼脂平板上。对于每个样品，散布 100 μL 三种不同稀释度的细菌溶液（未稀释、1:5 和 1:10），以获得具有可采摘的单个菌落的 LB 琼脂平板。将板在37°C孵育过夜。
   14. 第二天，每个样品选择三个菌落。将菌落转移到15mL管中，盖子上含有4mL补充有氨苄青霉素的LB培养基，并在37°C的摇床中孵育过夜。
   15. 从每个菌落中分装 500 μL 细菌溶液，并将其储存在冰箱中以备后用。按照制造商的说明进行小型制备以提取质粒DNA。
   16. 将样品送去进行Sanger测序，以确认质粒的正确组装。使用分布在整个质粒中的足够引物，以确保不间断的序列确认，理想情况下，通过正向和反向读取覆盖每个区域两次。
   17. 将 200 μL 含有正确组装质粒的细菌溶液加入补充有氨苄青霉素的 200 mL LB 培养基中，并在 37 °C 下在摇床中孵育过夜。
   18. 按照制造商的说明进行中型或大型制备以提取质粒DNA。将质粒DNA储存在-20°C。
2. 重组AAV6制剂
   注意:需要执行两个单独的AAV6准备:一个用于带有WT HDR模板的rAAV6，另一个用于带有突变HDR模板的rAAV6。本节介绍仅制备一种病毒所需的步骤。
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Results

通过应用上述方案，杂合子1型 CALR 突变可重复地引入脐带血来源的HSPC中。该突变包括外显子 9（ CALR 的最后一个外显子）中的 52 bp 缺失，导致 +1 帧偏移，导致一种新的带正电荷的 C 端结构域^26，33 的翻译。为了在内源性基因位点引入CALR突变，采用了外显子9上游的内含子靶向策略，因为在Cas9诱导的DSB未通过 HDR 机制 修复 的情况下，这将规避编码序列中任何不必要的变化。在这种特定情况下，由于具有高靶上和低脱靶序列以及有利的同源臂（缺乏序列重复; 图5A）。

然后将两个供体模板设计并包装在AAV6载体中。为了实现从内源性外显子到整合的cDNA的正确剪接，供体模板包含（i）SA序列，包括3'剪接位点，分支点和聚嘧啶束，（ii）外显子8-9的密码子优化cDNA序列，包含WT（CALR^WT）或突变序列（CALR^DEL）包括终止密码子，（iii）猿病毒40（SV40）polyA信号，（iv）在单独的内部启动子，脾病灶形成病毒（SFFV）启动子的控制下编码荧光蛋白的序列，然后是（v）牛生长激素（bGH）polyA信号。含有 CALR ^WT cDNA 的供体模板设计为包含 GFP 盒，而含有 CALR^DEL cDNA 序列的供体模板设计为包含 BFP 盒。整个结构的两侧是左右HA（图5A）。

在用RNP复合物转染和用rAAV6病毒转导两天后，通过流式细胞术分析细胞。可以检测到四个主要群体:（i）既不表达GFP也不表达BFP的细胞，代表没有基于HDR的基因组编辑的细胞，（ii）仅对GFP呈阳性的细胞，代表仅整合WT构建体的细胞，（iii）仅对BFP呈阳性的细胞，代表仅整合突变构建体的细胞，以及（iv）GFP和BFP双阳性细胞， 代表整合了WT和突变序列的细胞（图5B）。为了获得携带杂合1型 CALR 突变的HSPC纯群体，通过流式细胞术对双阳性细胞进行分选。其中两个WT序列被敲入的HSPC用作对照细胞（GFP+ mCherry+; 图 5B）。用作对照细胞的有效替代方案是HSPC，其荧光蛋白在安全港位点（即AAVS1;未显示）中的双等位基因整合。对分选的HSPC进行的台盼蓝排除细胞计数表明，超过90%的细胞是活的。

通过应用In-Out PCR策略证实了构建体的无缝靶向整合（图6A）。在这种特定情况下，我们进行了两个单独的输入输出PCR，一个用于敲入CALR ^WT序列（图6A中凝胶电泳的泳道1），另一个用于敲入的CALR^DEL序列（图6A凝胶电泳的泳道2）。对从凝胶条带中提取的DNA进行的Sanger测序证实了WT和突变序列在CALR^{DEL / WT} HSPC中的正确插入（图6B）。

图5:携带杂合CALR突变的HSPC的产生 。 （A）描述杂合 CALR 突变插入的编辑策略的代表性方案。RNP 复合物靶向 CALR 基因的外显子 7 和外显子 8 之间的内含子。两个AAV，一个包含突变外显子8-9和一个BFP，另一个包含WT外显子8-9和一个GFP，将作为供体修复模板，并将促进突变序列在一个等位基因中的整合以及WT序列在其余等位基因中的整合。（B）代表性流式细胞术图，描述HSPC转染和转导后48小时GFP和BFP或GFP和mCherry的表达。 请点击此处查看此图的大图。

图 6:HSPC 中成功杂合 CALR 突变的验证。 （A） 对从 AAV 对照、CALR WT^/WT 和 CALR^DEL/WT 中提取的基因组 DNA 进行的进出 PCR 产物的凝胶电泳。使用100 bp DNA分子量标准。缩写:NTC = 非模板控件。（B）从对CALR^DEL/WT 进行的进出PCR获得的Sanger测序结果，证实了WT和突变序列的成功整合。 请点击此处查看此图的大图。

Discussion

人类原代HSPC的高效和精确的遗传操作为探索和理解影响正常造血的过程，最重要的是造血细胞的白血病转化提供了很好的机会。

在该协议中，描述了一种设计人类HSPC以表达复发性杂合GOF突变的有效策略。该程序利用CRISPR / Cas9技术和rAAV6载体作为DNA模板的供体，将WT和突变DNA序列精确地插入其内源性基因位点。将工程化的cDNA（WT和突变体）与分离的荧光报告蛋白偶联，可以富集和跟踪具有明确杂合状态的细胞。

与常用的基于慢病毒（LV）的方法相比，该策略具有几个优点。一个主要优点是基于CRISPR/Cas9的系统允许对内源性位点进行精确编辑，从而保存内源性启动子和调控元件。这导致编辑基因在细胞中的表达呈同质性，当使用基于LV的方法时，这一目标几乎无法实现。与左心室载体的基因转移导致基因的半随机整合，优先于转录活性位点³⁴。这可能转化为转移基因的过表达和编辑细胞之间的异质性，最终导致难以研究和分析突变和基因相互作用的作用。第二个优点是所描述的系统作为位点特异性编辑系统，消除了插入诱变的风险³⁵。

双荧光报告策略允许对在两个等位基因上成功编辑的细胞进行精确富集和跟踪，其中一个等位基因整合WT cDNA，另一个等位基因整合突变的cDNA序列。仅表达单个报告基因的细胞仅代表具有相同荧光报告基因的HDR模板的单等位基因整合或双等位基因整合。只有产生单细胞衍生克隆并进行单独分析，才能精确区分这两种情况。然而，HSPC在 体外的增殖能力有限，当长时间培养时，HSPC开始分化为更成熟的后代，并失去其自我更新和植入能力。这使得选择和扩增携带所需杂合突变的单细胞克隆不可行。双荧光蛋白策略的应用和流式细胞术富集携带杂合突变的细胞可以绕过扩展体 外 培养引起的问题。

在这个具体的例子中，成功地证明了HSPC可以有效地设计和分类，以获得携带杂合 CALR^DEL/WT突变的纯HSPC群体。

然而，该系统不仅限于工程杂合移码突变，而且还可以很容易地用于创建其他突变类型，包括错义和无义突变。通过应用含有WT的AAV的不同组合或具有不同荧光报告蛋白的突变序列，该系统还可用于引入纯合突变（同时转导两个rAAV都携带突变cDNA，但荧光报告基因不同）甚至校正突变（同时转导两个AAV都携带WT cDNA，但荧光报告基因不同）。此外，值得一提的是，该策略不仅限于引入致癌性GOF突变。事实上，所描述的方案可用于多种替代策略，包括基因敲除、基因替换³⁶，³⁷、转基因（即嵌合抗原受体）的靶向敲入³⁸，甚至用于校正致病突变^11，39。

将 CRISPR/Cas9 和 AAV6 与多种荧光报告基因相结合的策略也被证明适用于许多其他细胞类型，包括 T 细胞、浆细胞样树突状细胞、诱导多能干细胞、神经元干细胞和气道干细胞²⁴，³⁸，40，^41，42，^43，44.该策略可用于生产上嵌合抗原受体（CAR）T细胞。例如，最近发表的CRISPR/Cas9介导的敲除CAR-T细胞中TGFBR2基因的敲除大大增加了它们在抑制性TGF-β丰富的肿瘤微环境中的功能⁴⁵。这种方法可以提供一步方案，既可以设计T细胞以表达CAR，也可以通过将CAR特异性插入TGFBR2基因的两个等位基因中来敲除TGFBR2基因。此外，这种方法还可用于通过将CAR整合到T细胞受体α常数（TRAC）基因^46，47中来产生通用CAR-T细胞。

为了提高可重复性并保证细胞的有效编辑，需要考虑一些重要的因素。确保细胞成功编辑的主要关键点在于（i）sgRNA的选择，（ii）HDR模板的设计，以及（iii）rAAV6的生产。

选择性能良好的sgRNA至关重要，因为它将决定可以整合HDR模板的最大等位基因数量。由于现在有许多软件可用，因此对候选sgRNA的搜索已得到简化。通过选择感兴趣的区域，该软件可以提出一系列具有靶标评分和脱靶评分的sgRNA，分别指示在所需位点和不需要的位点进行编辑的机会。这些分数是根据以前发布的评分模型^48，49 计算得出的。虽然这是选择性能良好的sgRNA的良好起点，但sgRNA的性能需要确认，因为它在 计算机中的 预测性能并不总是与 体外有效的sgRNA相对应。因此，强烈建议设计和测试至少三种sgRNA，以增加找到最佳sgRNA的机会。一旦鉴定出真正表现良好的sgRNA，建议继续进行HDR模板的设计。

设计 HDR 模板时应考虑预防措施。左同源臂和右同源臂（分别为LHA和RHA）应分别跨越sgRNA切割位点的上游和下游400 bp，因为较短的HA可能导致HDR频率降低。 可以通过 HDR引入的cDNA的大小取决于AAV的包装能力，大约为4.7 kb。由于HDR模板中有许多必需的元素（LHA，RHA，SA，PolyA，启动子和荧光报告序列），突变或WT cDNA的剩余空间是有限的。如果所需的突变位于基因的3'末端附近或具有整体短CDS的基因中，则这是没有问题的。然而，如果突变位于具有长CDS的基因的转录起始侧（TSS）附近（超过AAV的剩余包装空间），这种描述的方法可能不可行。为了解决这个问题，Bak及其同事最近开发了一种依赖于将HDR模板拆分为两个AAV的策略。该策略依赖于两个独立的HDR介导的整合来获得大基因⁵⁰的最终无缝整合。

病毒的质量及其滴度是可以成就或破坏细胞基因组工程成功的其他因素。为了获得最佳产量，重要的是不要让HEK293T在培养物中保持完全汇合。理想情况下，HEK293T细胞应在达到70%-80%汇合时分裂。此外，HEK293T不应长时间培养，因为这会降低其产生病毒的能力。新的HEK293T细胞需要在20代后解冻。获得高病毒滴度对于提高实验的效率和可重复性非常重要。低病毒滴度将转化为HSPC转导所需的大量rAAV溶液。作为一般规则，添加到核化细胞中的rAAV溶液不应超过HSPC保留培养基总体积的20%。较高体积的AAV溶液可能导致细胞死亡增加，增殖降低和转导效率受损。因此，在病毒滴度低的情况下，建议进一步浓缩病毒。

总之，该协议提供了一种可重复的方法，通过同时使用CRIPSR / Cas9和rAAV6供体模板以及额外的双荧光报告基因，精确有效地操作人类HSPC。这种方法已被证明是研究正常造血干细胞生物学以及突变对白血病发生的贡献的重要工具。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
175 cm2 细胞培养瓶，通气盖，经 TC 处理	Corning	431080
150 mm x 25 mm 培养皿	Corning	430599
293T	DSMZ	ACC 635	https://www.dsmz.de/collection/catalogue/details/culture/ACC-635
4D Nucleofector 核心单元	Lonza	——	对于人 HSPC 的核转染，请使用 DZ-100 程序。
4D Nucleofector X 单元	Lonza-500
ml 离心管	康宁	431123
7-AAD	BD Biosciences	559925
AAVpro 纯化试剂盒	Takara	6666
Alt-R SP Cas9 核酸酶 V3	集成 DNA 技术 （IDT）	1081058
Avanti JXN-30 超速离心机	BeckmanCoulter-Benchling
sgRNA 设计工具			sgRNA 设计在线工具：http://www.benchling.com/crispr
牛血清白蛋白 （BSA）	Sigma-Aldrich	A7906-100G
C1000 Touch 热循环仪	Bio-Rad
化学修饰的合成 sgRNA	Synthego		网站：https://www.synthego.com/products/crispr-kits/synthetic-sgrna 靶向 CALR 内含子 7 的 sgRNA 序列：5'-CGCCTGTAATCCTCGCCCAG-3'        将 80 个核苷酸的 SpCas9 支架添加到 20 个核苷酸的 RNA 序列中以完成 sgRNA。将 2'-O-甲基的化学修饰添加到第一个和最后 3 个碱基中，并在前 3 个和最后 2 个碱基中添加 3' 硫代磷酸酯键。   *可从 IDT （https://eu.idtdna.com/site/order/oligoentry/index/crispr） 和 Trilink （https://www.trilinkbiotech.com/custom-oligos）
工具			用于 sgRNA 设计的在线工具：http://chopchop.cbu.uib.no
Costar 24 孔透明 TC 处理的多孔板康	宁	3526
CRISPick sgRNA 设计工具			sgRNA 设计在线工具：
https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public CRISPOR sgRNA 设计工具			sgRNA 设计在线工具：http://crispor.tefor.net
ddPCR 96 孔板	Bio-Rad	12001925
ddPCR 超混合液（无 dUTP）		Bio-Rad
DG8 小柱		Bio-Rad
DG8 垫片	Bio-Rad	1863009
DreamTaq Green PCR 预混液 （2X）	Thermo Scientific	K1081
探针液滴生成油	Bio-Rad	1863005
Dulbecco's 含高葡萄糖的改良 Eagle 培养基 （DMEM）	Sigma-Aldrich	D6429-6X500ML
Dulbecco'磷酸盐缓冲盐水 （DPBS）	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
FACSAria Fusion	BD Biosciences-Falcon
5 mL 圆底	康宁	352054
胎牛血清 （FBS） Good Forte（热灭活），500 ml	Pan Biotech	P40-47500
FlowJo 10.8.0	BD Biosciences	-
GenAgarose L.E.	Inno-train	GX04090
GeneRuler 100 bp Plus DNA 分子量标准	，Thermo Scientific	SM0321
Gibson组装预混液，	New England Biolabs Inc.（NEB）	E2611L
HEK293T
HEPES溶液	，Sigma-Aldrich	H0887-100ML
ICE	Synthego		https://ice.synthego.com
IDT 密码子优化工具	IDT		https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool
IDT sgRNA 设计工具			sgRNA 设计在线工具：https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM
LB 肉汤 （Lennox） EZMix 粉末 微生物生长培养基	Sigma-Aldrich	L7658-1KG
LB 肉汤与琼脂 （Lennox） EZMix 粉末微生物生长培养基	Sigma-Aldrich	L7533-1KG
Midori Green Advance	Nippon Genetics	MG04
Monarch 质粒小量制备试剂盒	NEB	T1010L
Monarch DNA 凝胶提取试剂盒	NEB	T1020L
NEB 5-α 感受态大肠杆菌（高效）	NEB	C2987U
无核酸酶水，5X100 ml	Ambion	AM9939
NucleoBond Xtra Midi	Macherey-Nagel	740410
Opti-MEM，减血清培养基，500 ml	Gibco	31985070
P3 原代细胞 4D-核细胞 X 试剂盒 L	Lonza	V4XP-3024	Lonza Primary P3 溶液以 2.25 mL P3 原代细胞核染剂溶液和 0.5 mL 添加剂 1 的形式提供。要复溶，请将补充剂 1 添加到 P3 原代细胞 Nucleofector 溶液中并混合。
pAAV-MCS2	Addgene	46954
PCR 板热封箔，可刺穿	Bio-Rad	1814040
pDGM6	Addgene	110660
青霉素-链霉素 （P/S）	Gibco	15140122
聚乙烯亚胺 （PEI）	Polysciences	23966	将 50 mL PBS 4.5 pH（由 HCl 制成）加入管中的 50 mg PEI 中。将试管放入 70°C 水浴并每 10 分钟涡旋一次，直到溶液溶解。溶液达到 RT 后，过滤灭菌至 0.22 &μ;m 过滤器，make 1120 μL 等分试样，并储存在 -80°C 下。
聚苯乙烯试管，带卡口盖
引物	Eurofins	引	物购自 Eurofins （eurofinsgenomics.eu），作为未修饰的无盐定制寡核苷酸。使用 PRIMER-Blast （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/） 设计引物                                                    底漆 1 Fwd：   AAGTGATCCGTTCGCCATGAC;               引物 2 Rev CALR WT 特异性：ACGTCCTCTCTTCCTCGTCCTC;                    引物 2 Rev CALR DEL 特异性：CCAACCCTGGAGACACGCTTC
PrimeTime qPCR 引物检测	IDT-PrimeTime		qPCR 探针检测（1 个探针/2 个引物） 可从 IDT 订购（https://eu.idtdna.com/site/order/qpcr/assayentry）。规模：Std - qPCR 检测 500 次反应;引物 1 向前 （5'-3'） ： GGAACCCCTAGTGATGGAGTT;引物 2 反向 （5'-3'）：CGGCCTCAGTGAGCGA;探头 （5'-3'）： CACTCCCTCTGCGCGCGCTCG;5' 染料/3' 淬灭基团：FAM/ZEN/IBFQ;引物与探针比：3.6
PX1 PCR 板密封剂	Bio-Rad	1814000
QuantaSoft 软件	Bio-Rad
快速提取 DNA 提取溶液	Lucigen	QE0905T
QX200 液滴发生器	Bio-Rad	1864002
QX200 微滴检测仪	Bio-Rad
重组人 Flt3 配体	Peprotech	300-19
重组人 IL-6	Peprotech	200-06
重组人 SCF	Peprotech	300-07
重组人 TPO	Peprotech	300-18
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758-6X500ML
SnapGene	Dotmatics		分子克隆软件 https://www.snapgene.com *也可以使用 Benchling （https://www.benchling.com） 和 Geneious （https://www.geneious.com）。
Soc 生长培养基	NEB	B9020S
丁酸钠	Sigma-Aldrich	B5887-1G
Stem Regenin 1 （SR1）	Biogems	1224999
StemSpan SFEM II	STEMCELL Technologies	9655
TAE 缓冲液（Tris-乙酸-EDTA） 50X	Thermo Scientific	B49
TIDE			http://shinyapps.datacurators.nl/tide/
盼蓝 0.4%	Sigma-Aldrich	T8154-100ML
TrypLE（含酚红），500 ml	Thermo Scientific	16605-028
UltraPure 0.5：EDTA，pH 8.0,100 ml	Thermo Scientific	15575-038
UM171	STEMCELL Technologies	72914
Vector Builder 密码子优化工具	Vector Builder		https://en.vectorbuilder.com/tool/codon-optimization.html