需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

社会隔离模型：一种非侵入性啮齿类动物应激与焦虑模型

5.8K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/64567

⸱

2022年11月11日

 ,  ,  , 
1Titus Family Department of Clinical Pharmacy, School of Pharmacy, University of Southern California, 2Homer Stryker M.D. School of Medicine, Western Michigan University

本文内容

摘要

本文介绍了一种由社会隔离（SI）诱导的焦虑小鼠模型，该模型利用野生型C56BL/6J小鼠，在最少操作干预且无创的情况下诱导应激和类似焦虑的行为。该模型反映了现代社会生活中社会隔离的模式，是研究焦虑及相关疾病的理想模型。

摘要

焦虑症是美国（US）致残的主要原因之一。目前的治疗方法并不总是有效，且不到50%的患者能够实现完全缓解。开发新型抗焦虑药物的关键步骤之一是建立并利用动物模型（如小鼠）来研究病理变化，并测试药物靶点、疗效和安全性。现有方法包括基因操作、长期给予诱导焦虑的分子或施加环境应激。然而，这些方法可能无法真实反映日常生活中所诱发的焦虑状态。本方案描述了一种新型焦虑模型，可模拟现代生活中有意或无意的社交隔离模式。该社交隔离诱导的焦虑模型最大限度地减少了外界干扰和侵入性操作，采用野生型C57BL/6小鼠。在本方案中，6至8周龄的小鼠（雄性和雌性）被单独饲养在不透明笼子中，以视觉屏蔽外部环境（例如邻近小鼠），持续4周。不提供任何环境丰富化物品（如玩具），垫料减少50%，任何药物处理均以琼脂形式给予，并尽量减少对小鼠的暴露和操作。采用本方案建立的社交隔离小鼠表现出更显著的类焦虑行为和攻击性， 以及认知能力下降。

引言

焦虑症是美国（US）最大类且负担最重的精神疾病，其相关年度费用超过420亿美元1,2,3。近年来，焦虑和压力使自杀及自杀意念的发生率上升了16%以上4。患有慢性疾病的患者尤其容易受到心理痛苦或认知功能下降等非预期继发效应的影响5。目前治疗焦虑的方法包括心理治疗、药物治疗，或两者联合使用6。然而，尽管存在这一危机，接受治疗的患者中仍有不到50%能够实现完全缓解6,7。苯二氮䓬类药物（BZs）和选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs）等抗焦虑药物存在显著缺陷，或几乎不产生即时疗效8。此外，目前正处于研发阶段的新型抗焦虑药物相对匮乏，药物开发过程的成本高昂且耗时漫长，进一步加剧了这一挑战9,10。

药物开发过程中的一个关键步骤是建立并利用动物模型（如小鼠），以研究病理变化并测试药物的安全性和有效性11。目前建立焦虑动物模型的方法包括：1）基因操作，例如敲除血清素受体（5-HT1A）或γ-氨基丁酸A受体（GABAAR）α亚单位12；2）长期给予促焦虑物质，如皮质酮或脂多糖（LPS）13,14；或3）施加环境应激，包括社会挫败和母婴分离15。然而，这些方法可能无法真实反映日常生活中诱发的焦虑状态，因此可能不适用于研究其潜在机制或测试新型药物。

与人类相似，小鼠和大鼠是高度社会化的动物16,17,18。社交接触和社会互动对于大脑健康至关重要，并且在养育期间对正常的神经发育具有关键作用19。因此，在养育期间进行母体分离或社会隔离会导致小鼠出现更高的焦虑、抑郁水平以及神经传递功能的改变20。此外，社交理毛（异体理毛）是共同生活的小鼠和大鼠之间常见的建立联系或安抚行为21。因此，社会化是啮齿类动物生活的重要组成部分，而隔离会对它们的健康产生负面影响。

在此背景下，本实验方案描述了一种模拟现代生活中有意或无意社交孤立模式的新型焦虑模型。该社交孤立（SI）模型可最大限度减少动物感知到的干扰和侵入性，采用成年野生型C57BL/6小鼠和Sprague-Dawley（SD）大鼠进行实验。. 本文所述方案基于我们已发表的研究证据，该证据表明社会隔离会导致小鼠出现焦虑样行为增加、攻击性增强、认知功能下降以及神经炎症加剧的焦虑小鼠模型22,23,24通过高架十字迷宫（EPM）和开放旷场（OF）实验确认类焦虑行为，而认知功能则通过新物体识别（NOR）和新环境识别（NCR）实验进行评估。该模型适用于焦虑及相关障碍的研究，也可进行调整或改进，用于研究自然病程及发展过程 轻度认知障碍以及由压力引起的代谢变化。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有动物实验均按照南加州大学（USC）机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的方案进行，所有方法均遵循相关指南、法规和建议。

1. 动物

  1. 获得相关动物护理委员会对研究的批准。
  2. 将动物饲养室设置为12小时明暗循环，温度和湿度分别控制在24 ± 2 °C 和50%-60%范围内。
  3. 获取6-8周龄的雄性和/或雌性野生型C57BL/6小鼠。按性别分层后，将小鼠随机分配至以下任一组：1）群体饲养并给予溶剂处理；2）群体饲养并给予药物处理；3）社会隔离并给予溶剂处理；或4）社会隔离并给予药物处理。每组每性别至少包含四只小鼠（理想情况下每组六只小鼠）。
  4. 小鼠到达后，应在动物饲养室中适应至少24小时。小鼠到达时应为单只饲养状态。

2. 笼具设置

  1. 对于社会隔离动物，取一个标准小鼠笼（75 in2 底面积），加入一半量的垫料，并提供一块 1 in2 的棉布（或等效材料）用于筑巢。
  2. 用不透明的黑色塑料袋（或等效材料）包裹笼子的外壁，并用胶带固定。确保小鼠无法看到外部环境或周围动物。
    1. 笼子的顶部和底部保持不包裹，除非小鼠能通过这些部位看到邻近动物。
    2. 包裹时，确保塑料袋没有任何部分可从笼内触及，以防止动物撕破袋子。
    3. 不要添加任何形式的环境丰富物，例如玩具或跑轮。
  3. 小心轻柔地将小鼠放入准备好的笼子中。自由提供食物和饮水 ad libitum。
  4. 对照组小鼠在正常饲养条件下以每笼两到三只的方式群养（即使用标准小鼠笼 [75 in2 底面积]，全量垫料，一块 2 in2 的棉布或等效材料用于筑巢，且不使用不透明袋包裹）。
    1. 确保群养小鼠之间相互兼容（即彼此之间无打斗或冲突）。若发生冲突，应移除攻击者并将其排除在分析之外。
    2. 将雄性和雌性小鼠分开饲养，并保持一定距离，以避免雄性气味影响雌性小鼠内分泌水平的变化。

3. 社会隔离期间的护理与处理

  1. 在社交隔离期间，尽量减少对小鼠的干扰。所有操作和活动，如换笼和给药，均应在小鼠活跃期（即黑暗周期）进行，并尽量减少噪音干扰。
  2. 每周仅在黑暗周期换笼一次。同一塑料袋可移除后重新包裹至新笼盒中，除非袋子有明显破损。
    1. 对于对照组（群养）小鼠，根据需要在黑暗周期每周换笼两次或更频繁。
  3. 确保小鼠拥有充足的水和食物，足以维持至少1周。
  4. 持续隔离（或群养）小鼠至少4周，以获得最佳实验效果。

4. 琼脂药物/处理制备——一种非侵入性药物处理方法

  1. 如果研究中涉及处理措施（例如，正在研究的药物），理想的做法是尽可能减少操作，使用琼脂形式给予处理。注射和灌胃等给药途径会对小鼠造成额外的应激，可能成为焦虑的混杂因素。
  2. 根据所用药物的性质调整治疗的时间和频率。
    注：本研究中使用2 mg/kg的二氢杨梅素（DHM，[(2R,3R)-3,5,7-三羟基-2-(3,4,5-三羟基苯基)-2,3-二氢色烯-4-酮]）作为处理药物。在隔离（或群体饲养）期的最后2周内，每天于黑暗期给予一次DHM。
  3. 准备处理液时，将3%（w/v）琼脂加入去离子（DI）水中，并加热至约90 °C 溶解时会产生气泡。需防止溢出或沸腾溅出。
    注意：在玻璃烧瓶中加热溶液 通过 短时间微波，每次10秒
    注意：玻璃器皿将很烫。处理溶液时应佩戴适当的个人防护装备（PPE）。
  4. 混匀溶液，并通过目视确保溶液均匀。
    注意：该溶液应呈半透明，颜色为浅黄色至浅棕色。
  5. 溶液仍温热时，加入5%（w/v）蔗糖及所需剂量的处理物质。对照组（溶剂对照）中仅加入蔗糖，不加入待测处理物质。
  6. 轻轻搅拌溶液，并目视确认其均匀。随后将溶液倒入模具中，在室温下静置冷却至凝固。若处理物对光敏感，需注意避光保护。
    注意：该溶液应略带黏性。
  7. 凝固后，将琼脂切成 0.5 cm × 0.5 cm × 0.5 cm 的小块，并储存于 4 °C 直至给药。
  8. 给药时，将一块琼脂置于小型称量舟中。在明暗循环的黑暗阶段，安静而小心地将装有琼脂的称量舟放入各个小鼠笼内，避免接触小鼠。让小鼠自由摄食琼脂。
    注意：小鼠通常需要 15–45 分钟才能完全吃完琼脂。
  9. 确认琼脂完全消耗后，小心地将称量舟从笼中取出。必要时重复此操作。
  10. 每周制备琼脂块以保持新鲜并避免任何污染。

5. 行为分析

  1. 在为期4周（或更长）的隔离期结束后的24小时进行行为学测试。测试应在黑暗期、间接红光照明下进行，并用摄像机记录。
  2. 安排至少三名研究人员以双盲方式手动进行离线评分，以尽量减少偏差和误差。
  3. 高架十字迷宫（EPM）
    1. 准备EPM装置。本实验所用装置为市售产品（见材料表），由不透明塑料制成，包含两个开放臂和两个封闭臂（每个臂尺寸为33 cm × 5 cm，开放臂与封闭臂相互垂直），中央平台为5 cm × 5 cm。将装置抬高至离地面50 cm处。
    2. 将动物放置于装置中央平台，使其面向一个开放臂。允许动物自由探索5分钟，并用摄像机记录其活动。
      1. 每次测试后，使用消毒剂（70%乙醇）彻底擦拭装置所有表面以清洁，确保清除所有啮齿类动物排泄物。
    3. 通过秒表离线评分小鼠行为，依据其在开放臂、封闭臂及中央平台停留的时间进行评分。当小鼠至少有三只爪进入某一臂或平台时，开始计时。
  4. 旷场实验（OF）测试
    1. 准备OF装置。本实验所用装置（见材料表）由不透明塑料制成，尺寸为50 cm × 50 cm × 38 cm（长×宽×高）。
    2. 在场地上绘制边长为10 cm的正方形网格，共25个网格。
    3. 将动物置于场地中央，允许其自由探索10分钟，并用摄像机记录其活动。
      1. 每次测试后，使用消毒剂（70%乙醇）彻底擦拭装置所有表面以清洁，确保清除所有啮齿类动物排泄物。
    4. 通过离线方式评分小鼠行为，依据其在中心区域停留时间、角落停留时间、总移动距离以及直立次数进行评分。
      1. 使用秒表记录动物在中心区或角落的停留时间。当小鼠至少有三只爪进入相应区域时，开始计时。
      2. 使用计数器记录移动距离和直立频率。以小鼠进入的方格数（当小鼠至少有三只爪进入某一格时计为一次）来估算移动距离。当小鼠明显以后肢站立时计为一次直立；若小鼠站立并倚靠墙壁，或为理毛而站立，则不计入。
  5. 新物体识别（NOR）测试
    1. 本测试持续3天。第1天，准备一个50 cm × 50 cm × 38 cm（长×宽×高）的旷场装置。将动物置于旷场中央，允许其自由熟悉环境5分钟，之后将其放回饲养笼。
      1. 每次测试后，使用消毒剂（70%乙醇）彻底擦拭装置所有表面以清洁，确保清除所有啮齿类动物排泄物。
    2. 第2天，使用相同的旷场装置，并放置两个相同的物体（如小立方体），对称分布，相距约20 cm。将动物置于装置中央，允许其自由探索5分钟，之后将其放回饲养笼。
      1. 每次测试后，使用消毒剂（70%乙醇）彻底擦拭装置所有表面以清洁，确保清除所有啮齿类动物排泄物。
    3. 第3天，使用相同的旷场装置，保留第2天使用的一个物体（如小立方体）作为熟悉物体，另放置一个形状不同的新物体（如木质金字塔），与熟悉物体对称分布，相距约20 cm。允许动物自由探索3分钟，并用摄像机记录其活动。
      1. 每次测试后，使用消毒剂（70%乙醇）彻底擦拭装置所有表面以清洁，确保清除所有啮齿类动物排泄物。
    4. 通过离线方式评分小鼠行为，依据其探索熟悉物体和新物体的时间进行评分。计算物体识别指数（ORI%），其中 ORI百分比公式；\(ORI\%=\frac{t_n}{t_n+t_f} \times 100\)；数学公式。；tf 和 tn 分别代表探索熟悉物体和新物体的时间。
  6. 新环境识别（NCR）测试
    1. 本测试持续2天。准备两个形状明显不同的旷场装置，以及两对形状不同的物体。其中一个旷场装置可用作一种环境（方形旷场），另一环境应大小相似但形状不同（如圆形旷场）。
    2. 第1天，在方形环境中放置一对相同物体（如两个立方体），在圆形环境中放置另一对相同物体（如两个金字塔）。物体应呈对称分布，相距15–20 cm。
    3. 将动物置于其中一个环境的中央，允许其自由探索5分钟。随后在另一环境中重复该过程。之后将动物放回饲养笼。
      1. 每次测试后，使用消毒剂（70%乙醇）彻底擦拭装置所有表面以清洁，确保清除所有啮齿类动物排泄物。
    4. 第2天，将一个环境中的一个物体与另一环境中的一个物体互换（即在方形环境中放置一个立方体和一个金字塔，在圆形环境中也放置一个立方体和一个金字塔）。
    5. 将动物置于中央，允许其自由探索3分钟，并用摄像机记录其活动。动物无需在两个环境中均被记录。
      1. 每次测试后，使用消毒剂（70%乙醇）彻底擦拭装置所有表面以清洁，确保清除所有啮齿类动物排泄物。
    6. 通过离线方式评分小鼠行为，依据其探索不同物体的时间进行评分。计算识别指数（RI%），即动物探索“环境外”新物体（如在方形环境中出现的金字塔）所用时间占探索新物体与熟悉物体（如在方形环境中出现的立方体）总时间的比例。色谱分析中保留指数（RI%）的公式：\( RI\% = \frac{t_n}{t_n + t_f} \times 100 \)。。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

所有代表性结果和图示均改编自我们近期的发表文章22,23。为评估社交隔离对焦虑和探索行为的影响，在为期4周的社交隔离期结束后的24小时，进行了高架十字迷宫（EPM）和旷场（OF）实验。与对照组相比，社交隔离小鼠在开放臂中停留的时间显著更短（1.28 ± 0.17 min 对照组为 2.31 ± 0.27 min），而在封闭臂中停留的时间显著更长（3.31 ± 0.27 min 对照组为 2.24 ± 0.31 min）（图1）。同样，在旷场实验中，社交隔离小鼠的移动距离更短（2,176 ± 146 cm 对照组为 2,765 ± 161 cm），站立次数更少（28.25 ± 2.07 对照组为 46.63 ± 1.52），在角落停留的时间更长（73.00 ± 4.31 s 对照组为 28.25 ± 2.07 s），在中央区域停留的时间更短（7.63 ± 0.86 s 对照组为 19.63 ± 0.71 s），表明其焦虑样行为增强（

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

实验方案中的关键步骤包括正确设置社交隔离笼具（即使用不透明袋包裹并减少垫料量），以及在整个隔离期间尽量减少对小鼠的抓取和干扰, 并确保小鼠完全摄取和消耗含药物的琼脂。必须将动物房或饲养环境的温度和湿度维持在恒定水平，并尽量减少外界干扰。应尽最大努力减少这些混杂因素，包括但不限于噪音干扰（如交谈声、设备噪音等）、过度操作，以及在明暗循环的光照阶段对动物造成干扰。在隔离期间更换笼具、补充食物和/或水、给予处理及其他所有操作所需的时间也应尽可能缩短。尽管较为罕见，但我们过去曾观察到群养雄性小鼠之间发生争斗。因此，对于群养小鼠（对照组或其他情况），需进行仔细观察，以确保小鼠之间无冲突，否则可能成为焦虑或应激的另一混杂因素。若确实发生争斗，应将疑似攻击者与另一只群养小鼠调换，并继续观察。如果该攻击者持续引发冲突，建议将其以及因该攻击者而受伤的小鼠均排除出研究。

本方案建议进行为期4周的隔离，但该时间可适当延长。我们实施过的最长社交隔离时间为8周，此外还采用过重复社交隔离（隔离、合笼饲养、再次隔离）作为累积性焦虑/应激的动物模型。这些隔离周期的具体时间和持续时长可根据实验需求...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院基金 AA17991（资助 J.L.）、Carefree 生物技术基金会（资助 J.L.）、南加州大学（USC）、南加州大学研究生院旅行/研究奖（资助 S.W.）、沙特阿拉伯文化使团奖学金（资助 A.A.O.）以及美国陆军卫生专业人员奖学金项目（资助 A.S.S.）提供资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
黑色塑料袋Office Depot79193224" x 32"
高架十字迷宫SD InstrumentsNA黑色
旷场实验箱SD InstrumentsNA白色
选择性琼脂Invitrogen30391-023
方形棉质筑巢材料（巢垫）Ancare CorporationNC9365966将一块 2" 见方的材料分成 4 份，为隔离组制备出 1" 见方的小块
蔗糖SigmaS1888-1KG
称量舟SigmaHS1420A小型、白色正方形聚苯乙烯材质

参考文献

  1. Craske, M. G., et al. Anxiety disorders. Nature Reviews Disease Primers. 3 (1), 17024(2017).
  2. Kasper, S., den Boer, J., Ad Sitsen, J. Handbook of Depression and Anxiety: A Biological Approach. , Marcel Dekker Inc. New York. (2003).
  3. Konnopka, A., König, H. Economic burden of anxiety disorders: a systematic review and meta-analysis. Pharmacoeconomics. 38 (1), 25-37 (2020).
  4. Batterham, P. J., et al. Effects of the COVID-19 pandemic on suicidal ideation in a representative Australian population sample-Longitudinal cohort study. Journal of Affective Disorders. 300, 385-391 (2022).
  5. Ismail, I. I., Kamel, W. A., Al-Hashel, J. Y. Association of COVID-19 pandemic and rate of cognitive decline in patients with dementia and mild cognitive impairment: a cross-sectional study. Gerontology and Geriatric Medicine. 7, 23337214211005223(2021).
  6. NIMH. Anxiety Disorders. , Available from: https://www.nimh.nih.gov/health/topics/anxiety-disorders/index.shtml (2018).
  7. Roy-Byrne, P. Treatment-refractory anxiety; definition, risk factors, and treatment challenges. Dialogues in Clinical Neuroscience. 17 (2), 191-206 (2015).
  8. Cassano, G. B., Baldini Rossi, N., Pini, S. Psychopharmacology of anxiety disorders. Dialogues in Clinical Neuroscience. 4 (3), 271-285 (2002).
  9. Garakani, A., et al. Pharmacotherapy of anxiety disorders: current and emerging treatment options. Frontiers in Psychiatry. 11, 595584(2020).
  10. Hutson, P. H., Clark, J. A., Cross, A. J. CNS target identification and validation: avoiding the valley of death or naive optimism. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57 (1), 171-187 (2017).
  11. Hart, P. C., et al. Experimental models of anxiety for drug discovery and brain research. Mouse Models for Drug Discovery: Methods and Protocols. Proetzel, G., Wiles, M. V. , Springer. New York. 271-291 (2016).
  12. Scherma, M., Giunti, E., Fratta, W., Fadda, P. Gene knockout animal models of depression, anxiety and obsessive compulsive disorders. Psychiatric Genetics. 29 (5), 191-199 (2019).
  13. Liu, W. -Z., et al. Identification of a prefrontal cortex-to-amygdala pathway for chronic stress-induced anxiety. Nature Communications. 11 (1), 2221(2020).
  14. Zheng, Z. -H., et al. Neuroinflammation induces anxiety- and depressive-like behavior by modulating neuronal plasticity in the basolateral amygdala. Brain, Behavior, and Immunity. 91, 505-518 (2021).
  15. Toth, I., Neumann, I. D. Animal models of social avoidance and social fear. Cell and Tissue Research. 354 (1), 107-118 (2013).
  16. Wang, F., Kessels, H. W., Hu, H. The mouse that roared: neural mechanisms of social hierarchy. Trends in Neurosciences. 37 (11), 674-682 (2014).
  17. Endo, N., et al. Multiple animal positioning system shows that socially-reared mice influence the social proximity of isolation-reared cagemates. Communications Biology. 1 (1), 225(2018).
  18. Netser, S., et al. Distinct dynamics of social motivation drive differential social behavior in laboratory rat and mouse strains. Nature Communications. 11 (1), 5908(2020).
  19. Krimberg, J. S., Lumertz, F. S., Orso, R., Viola, T. W., de Almeida, R. M. M. Impact of social isolation on the oxytocinergic system: A systematic review and meta-analysis of rodent data. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 134, 104549(2022).
  20. Mumtaz, F., Khan, M. I., Zubair, M., Dehpour, A. R. Neurobiology and consequences of social isolation stress in animal model-A comprehensive review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 105, 1205-1222 (2018).
  21. Ranade, S. Comforting in mice. Nature Neuroscience. 24 (12), 1640(2021).
  22. Al Omran, A. J., et al. Social isolation induces neuroinflammation and microglia overactivation, while dihydromyricetin prevents and improves them. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 2(2022).
  23. Watanabe, S., et al. Dihydromyricetin improves social isolation-induced cognitive impairments and astrocytic changes in mice. Scientific Reports. 12 (1), 5899(2022).
  24. Silva, J., et al. Modulation of hippocampal GABAergic neurotransmission and gephyrin levels by dihydromyricetin improves anxiety. Frontiers in Pharmacology. 11, 1008(2020).
  25. Porter, V. R., et al. Frequency and characteristics of anxiety among patients with Alzheimer's disease and related dementias. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neuroscience. 15 (2), 180-186 (2003).
  26. Hossain, M. M., et al. Prevalence of anxiety and depression in South Asia during COVID-19: A systematic review and meta-analysis. Heliyon. 7 (4), 06677(2021).
  27. NHGRI. Knockout Mice Fact Sheet. , Available from: https://www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/Knockout-Mice-Fact-Sheet (2020).
  28. Takahashi, A. Social stress and aggression in murine models. Current Topics in Behavioral Neuroscience. 54, 181-208 (2022).
  29. Lam, R. W. Challenges in the treatment of anxiety disorders: beyond guidelines. International Journal of Psychiatry in Clinical Practice. 10, 18-24 (2006).
  30. Sullens, D. G., et al. Social isolation induces hyperactivity and exploration in aged female mice. PLoS One. 16 (2), 0245355(2021).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

啮齿类焦虑模型非侵入性应激模型类焦虑行为认知功能障碍C57BL/6小鼠单只饲养不透明笼具饲养旷场实验新物体识别
社会隔离模型：一种非侵入性啮齿类动物应激与焦虑模型
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。