利用延时显微镜和时期特异性蛋白质核内耗竭研究减数分裂 S. cerevisiae

摘要

延时显微镜是研究芽殖酵母减数分裂的有力工具。本实验方案结合了细胞周期同步化、延时显微镜观察以及目标蛋白的条件性耗竭方法，展示了如何研究特定蛋白在减数分裂染色体分离过程中的功能。

摘要

延时荧光显微镜技术通过提供固定细胞成像中通常无法观察到的时间和空间信息，彻底改变了人们对减数分裂细胞周期事件的理解。芽殖酵母作为研究减数分裂染色体分离的重要模式生物，其众多减数分裂相关基因具有高度保守性。对芽殖酵母减数分裂过程进行延时显微观察，可监测不同减数分裂突变体，揭示突变如何干扰减数分裂过程。然而，许多蛋白质在减数分裂的多个阶段均发挥功能。使用功能缺失型或减数分裂完全缺失型突变体可能干扰早期过程，从而阻断或扰乱后期事件，使得难以确定与各个独立功能相关的表型。为克服这一挑战，本实验方案描述了如何在减数分裂特定阶段，利用延时显微镜监测减数分裂事件的同时，条件性地将蛋白质从细胞核中去除。具体而言，本方案详细说明了如何将细胞同步于减数第一次分裂前期，如何应用“锚定去除”（anchor away）技术在减数分裂特定阶段将蛋白质从细胞核中去除，以及如何通过延时成像监测减数分裂染色体的分离过程。为展示该技术的应用价值，实验中在减数分裂不同时间点将着丝粒蛋白Ctf19从细胞核中去除，并在减数第二次分裂结束时分析染色质团块的数量。总体而言，本方案可被调整用于在监测减数分裂过程的同时，条件性去除细胞核内的多种不同核蛋白。

引言

延时荧光显微镜是研究出芽酵母减数分裂过程中染色体分离动态的有力工具^1,2。通过关键营养物质的饥饿处理，可诱导出芽酵母细胞进入减数分裂³。在减数分裂过程中，细胞经历一次染色体分离，随后进行两次分裂，最终形成四个减数分裂产物，并将其包裹在孢子中（图1）。利用该技术可对单个细胞在减数分裂各个阶段的动态过程进行连续观察，从而获得固定细胞成像难以捕捉到的空间和时间信息。本实验方案展示了如何将延时荧光显微镜技术与两种已建立的方法——可诱导的NDT80系统（NDT80-in）和“锚定移除”技术（anchor away technique）——相结合，用于研究特定蛋白质在减数分裂不同阶段中的功能。

的 NDT80-在系统是一种强大的减数分裂细胞周期同步工具，依赖于中期减数分裂转录因子的可诱导表达 NDT80^4,5. NDT80 表达是减数第一次分裂前期退出所必需的^6,

方案

1. 准备必要的材料

1. 准备用于酵母细胞生长和孢子形成的试剂。
   注意：如果芽殖酵母菌株为 ade2- 和 trp1-，则在步骤 1.1.1–1.1.3 中的所有培养基中补充腺嘌呤和色氨酸，终浓度均为 0.01%（来自 1% 储液）。若通过高压灭菌对培养基进行灭菌，则需在培养基高压灭菌并冷却至室温后，再加入这些氨基酸。
   1. 为进行营养生长，配制 2 倍合成完全加葡萄糖培养基（2XSC）：将 6.7 g 无氨基酸酵母氮源基础培养基、2 g 完全氨基酸混合物和 20 g 葡萄糖溶解于 500 mL 水中。通过 121 °C 高压灭菌 20 分钟或使用 0.2 µm 滤膜过滤，对混合物进行灭菌。
   2. 为孢子形成的第一步，配制 2 倍合成完全加乙酸盐培养基（2XSCA）：将 6.7 g 无氨基酸酵母氮源基础培养基、2 g 完全氨基酸混合物和 20 g 乙酸钾溶解于 500 mL 水中。通过 121 °C 高压灭菌 20 分钟或使用 0.2 µm 滤膜过滤，对混合物进行灭菌。
   3. 为孢子形成的最后一步，配制 1% 乙酸钾（1% KAc）：将 5 g 乙酸钾溶解于 500 mL 水中。通过 121 °C 高压灭菌 20 分钟或使用 0.2 µm 滤膜过滤，对混合物进行灭菌。
2. 准备用于显微镜观察、细胞周期同步化和锚定去除实验的药物与试剂。 ....

结果

为了监测染色质的分离，组蛋白 Htb2 被标记上 mCherry。在减数第一次分裂前期，染色质呈现为单一的 Htb2 信号团块。同源染色体在第一次减数分裂中分离后，染色质表现为两个明显的信号团块（图 3A）。姐妹染色单体分离后，染色质则表现为四个团块。如果某些染色体未能与纺锤体微管正确连接，则在减数分裂 I 或减数分裂 II 后可观察到额外的信号团块。

上述方法用于研究着丝粒组分 Ctf19 在确保芽殖酵母减数分裂过程中染色体正确分离中的作用。使用锚定撤离（anchor away）酵母菌株，该菌株表达与 FRB 标签融合的 Ctf19，并通过 NDT80-in 系统（tor1-1; fpr1Δ; RPL13A-FKBP12; CTF19-FRB; GAL1-10 诱导 NDT80; GAL4-ER）将细胞阻滞在减数第一次分裂前期 I 进行同步化。作为对照，使用具有锚定撤离菌株背景但不表达 FRB 标签蛋白的 NDT80-in 菌株（<.......

讨论

本实验方案结合了NDT80-in系统以实现细胞同步化、锚定移除技术以耗竭细胞核内的蛋白质，以及荧光延时显微镜技术对减数分裂过程中的芽殖酵母细胞进行成像。NDT80-in系统是一种用于减数分裂细胞周期同步的方法，其原理是利用第一次减数分裂前期的阻滞与释放^4,8。尽管单个细胞在后续各个减数分裂阶段所经历的时间略有差异，大多数细胞在整个减数分裂过程中仍能保持高度的同步性。

锚定远离技术是一种适用于有丝分裂和减数分裂研究的灵活工具。通过改变锚定远离的目标蛋白以及雷帕霉素的添加时间，该方法可被用于研究酿酒酵母减数分裂任意阶段的多种蛋白。用于研究酿酒酵母有丝分裂的条件性突变体的常用方法并不总是适用于减数分裂研究。例如，使用可抑制启动子通常需要改变碳源以调控目标蛋白的表达，而这可能会干扰减数分裂²⁰。温度敏感型突变体则依赖温度变化来降低或消除目标蛋白的活性。许多此类条件性突变体无法用于减数分裂研究.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
β-雌二醇	Millipore Sigma	E8875	用95%乙醇配制1 mM储备液
0.22 µm 螺纹式瓶顶滤器	Millipore Sigma	S2GPT02RE
100% 乙醇	菲舍尔科技（Fisher Scientific）	22-032-601
10× PBS	菲舍尔科技（Fisher Scientific）	BP399500	使用时按1:10稀释，作为ConA的溶剂
24 mm × 50 mm 盖玻片，No. 1.5	VWR北美公司（VWR North American）	48393241
25 mm × 75 mm 显微镜载玻片	VWR北美公司（VWR North American）	48300-026
腺嘌呤半硫酸盐	Millipore Sigma	A9126	用于补充SC、SCA和1% Kac培养基
细菌琼脂（Bacto Agar）	BD	214030
刀豆蛋白A（Concanavalin A）	Millipore Sigma	C2010	用1× PBS配制成1 mg/mL溶液
CoolSNAP HQ2 CCD相机	Photometrics		在第4.3节中使用
D-葡萄糖	菲舍尔科技（Fisher Scientific）	D16-10
不含氨基酸的Difco酵母氮源基础培养基	BD	291920
二甲基亚砜（DMSO）	Millipore Sigma	D5879
Eclipse Ti2倒置显微镜	尼康（Nikon）		在第4.4节中使用
Fiji	美国国立卫生研究院（NIH）		从 https://fiji.sc/ 下载
GE Personal DeltaVision显微镜	Applied Precision		在第4.3节中使用
L-色氨酸	Millipore Sigma	T0254	用于补充SC、SCA和1% Kac培养基
模型黏土	Crayola	2302880000	用于固定载玻片上的盖玻片
NIS-Elements AR 5.30.04成像软件	尼康（Nikon）		在第4.4节中使用
ORCA-Fusion BT相机	滨松光子学（Hamamatsu）	C15440-20UP	在第4.4节中使用
塑料移液器吸头架	Dot Scientific	LTS1000-HR	截取该产品支架部分的一个4格×4格的区域。
乙酸钾	菲舍尔科技（Fisher Scientific）	BP264
雷帕霉素	菲舍尔科技（Fisher Scientific）	BP29631	用DMSO配制1 mg/mL储备液
硅酮密封胶	Aqueon	100165001	也称为水族箱胶。
SoftWorx 7.0.0 成像软件	Applied Precision		在第4.3节中使用
合成完全培养基混合物（Kaiser）	Formedium	DSCK2500
Type N浸油	尼康（Nikon）	MXA22166