本文详细介绍了利用胎儿超声心动图、尸检以及基于共聚焦表层显微镜（ECM）的表层荧光成像（EFIC）结合三维（3D）重建技术，对小鼠先天性心脏病（CHD）进行诊断的方法。
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摘要
摘要
先天性心脏病（CHD）是美国婴儿死亡的主要原因。在20世纪80年代及更早时期，大多数患有中度或重度CHD的患者在成年之前死亡，其中出生后第一周的死亡率最高。随着外科技术、诊断方法和医学管理的显著进步，患者的预后已得到明显改善。为了满足深入理解先天性心脏缺陷的关键研究需求，小鼠模型提供了一个理想的研究平台，因为小鼠的心脏解剖结构与人类非常相似，且妊娠周期短。结合基因工程技术与高通量表型分析工具，已能够复制并诊断结构性心脏缺陷，从而进一步阐明CHD背后的分子通路。利用无创胎儿超声心动图对小鼠模型的心脏表型进行筛查，结合使用共聚焦表观显微镜（ECM）进行表观荧光图像采集（EFIC）的高保真组织病理学分析，并辅以三维（3D）重建，可深入细致地观察各种先天性心脏病的解剖结构。本实验方案详细阐述了上述方法的完整工作流程，以实现对小鼠先天性心脏病的准确诊断。将该表型分析方案应用于模式生物，将有助于准确诊断CHD，进而揭示其发病机制。明确CHD的潜在机制，将为开发潜在的治疗手段和干预措施提供契机。
引言
先天性心脏病（CHDs）是最常见的新生儿出生缺陷1,2，影响约0.8%–1.7%的新生儿，并导致显著的新生儿死亡率和发病率3。大量证据表明CHDs具有遗传病因4,5。由于小鼠具有四腔心脏，且其胎儿心脏发育相关的DNA序列与人类胎儿高度相似，因此基因修饰小鼠模型被广泛用于研究CHDs的复杂性及其致病机制6。确定小鼠突变体的表型是阐明靶基因功能的基础第一步。表达基因剂量效应的小鼠模型对于理解CHDs的复杂性及致病机制尤为重要，因为单个基因突变可导致一系列类似人类CHDs的心脏畸形。
本文概述了一种用于表征小鼠模型中心脏表型的研究流程。所采用的方法包括胎儿超声心动图7，随后进行解剖及表观遗传学、细胞与分子组织病理学（ECM组织病理学）7,8，这些方法能够清晰展示发育中鼠类心脏表型的精细解剖结构。胎儿超声心动图是一种无创成像技术，可直接可视化多个胚胎，并具备合理的成像分辨率。此外，该技术可快速确定一窝胚胎的总数、其发育阶段以及在子宫角内的相对位置和方向。通过频谱多普勒/彩色血流成像，可根据结构异常、血流动力学紊乱、生长受限或 水肿的出现来识别异常胚胎。由于胎儿超声心动图属于非侵入性技术，因此可在多个时间点重复扫描，以观察血流动力学或心脏形态的动态变化。获取高质量的胎儿超声心动图图像需要经验与技巧，缺乏经验可能导致某些特定心脏缺陷被遗漏。因此，结合解剖与ECM组织病理学可获得更为明确的心脏形态学分析结果。解剖可直接观察主动脉弓结构、主动脉与肺动脉的相对关系、心室与心房的大小、心脏相对于胸腔的位置以及支气管肺部结构。然而，仅通过解剖难以准确评估心脏瓣膜和心壁厚度等内部结构。因此，推荐采用ECM组织病理学进行最终确诊。ECM组织病理学是一种高分辨率成像技术，支持对图像序列进行二维和三维重建9。这些图像通过自动切片机以恒定间隔对石蜡包埋样本进行连续表观荧光切片成像获得。与传统组织学不同，ECM在组织从包埋块上切下前即采集每一层图像，从而确保所有图像均处于同一参考坐标系中。因此，ECM组织病理学生成的二维图像序列可被高效且可靠地重建为三维结构。该过程使用DICOM图像浏览器完成，可在冠状面、矢状面和横断面三个解剖平面上实现图像的三维可视化。基于这些高分辨率三维重建图像，可做出明确的心脏诊断。上述三种不同成像技术的应用，无论是单独使用还是联合使用，均可对小鼠胚胎中的结构性心脏缺陷进行准确表征。
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方案
在这些研究中使用小鼠是必要的，因为小鼠具有四腔心脏，能够模拟人类的先天性心脏病（CHDs）。小鼠由兽医提供护理，并饲养在本机构获得实验动物管理和使用评估认证协会（AAALAC）认证的动物护理设施中。研究严格遵循相关规程，以尽量减少小鼠的不适、应激、疼痛和损伤。小鼠采用CO2气体实施安乐死，该方法符合美国兽医医学协会《安乐死指南》对小型啮齿类动物的规定。本论文中涉及小鼠的研究均在匹兹堡大学经批准的IACUC方案下进行。
1. 胎儿超声心动图
注意：超声心动图是识别小鼠心血管畸形及心外缺陷的有力工具。由于小鼠胚胎体积较小（中期妊娠时约为1-2 mm，出生时为3.5 mm），需要使用具有超声生物显微镜（UBM）的超高频超声心动图设备。UBM配备多种高频（30-50 MHz）探头，成像窗口较小（15 mm × 14 mm），可提供足够的分辨率（轴向30 µm × 横向68 µm），以便逐个观察小鼠胎儿。40 MHz换能器可提供高分辨率图像，用于识别心血管表型7。
- 打开超声心动图仪器，并选择心脏病学程序。
注意：以下方案适用于从胚胎第（E）14.5天至19.5天的任何小鼠品系。 - 将目标小鼠置于麻醉诱导舱中进行麻醉。使用浓度为4%的异氟烷和医用氧气，氧气流速为1 L/min进行诱导麻醉，随后将异氟烷浓度降低至2%-3%以维持麻醉状态。
- 迅速将小鼠放置于成像平台。成像平台内置加热金属板，可在操作过程中保持小鼠体温。将小鼠的口鼻部放入麻醉鼻罩中，并用胶带固定四肢以防止移动。监测心率，确保其维持在400–450次/分钟之间。
- 使用直肠温度探头监测体温，并确保体温保持在37 °C ± 0.5 °C范围内。同时监测呼吸情况，避免缺氧。操作探头时应施加轻柔力度，以防造成损伤。
注意：可在小鼠上方设置加热灯，以预防麻醉期间及麻醉恢复过程中的低体温。可使用凡士林眼用软膏作为润滑剂，防止角膜干燥。 - 使用脱毛膏去除胸部和腹部的毛发。涂抹脱毛膏后等待3分钟，然后清除。用70%乙醇清洁皮肤区域。乙醇作为脱毛润滑剂的效果优于水。
- 将超声耦合剂预热至正常体温。充分涂抹超声耦合剂后，将探头置于腹部，调整至水平平面，在屏幕上识别膀胱。确认膀胱位置后，从膀胱向头侧扫描，寻找胎儿。测量顶臀长以确定胎龄10（图1和Table 1）。
注意：可调整探头位置以观察不同切面，包括横断面四腔心切面、矢状切面以及额面/冠状切面7（图1）。 - 使用彩色多普勒模式分析心脏血流。
- 若胚胎尚未达到预期发育阶段，则将小鼠放回笼中；否则，准备进行取材。
注意：在将小鼠放回笼中前，应确保其已清醒并从麻醉中良好恢复。 - 关闭异氟烷和氧气，清洁工作区域，并关闭仪器。
注意：务必清除探头上的耦合剂。
2. 尸体解剖
注意：一旦通过胎儿超声心动图怀疑存在异常心脏表型，即采集并固定胎儿标本 通过 将样本完全浸入固定液中：可选择10%磷酸盐缓冲福尔马林或4%多聚甲醛（PFA）。检查样本的外部和内部形态，观察是否存在肉眼可见的解剖学异常或畸形。
- 准备小鼠。
- 若为成年小鼠，采用标准的 CO2 方法实施安乐死。使用镊子或解剖剪在侧胸壁和腹部做切口（约 3 cm），以使固定液能够渗透至内脏器官。
注意：若胚胎发育阶段晚于 E14.5，样本应在解剖前至少固定 24 小时。
- 若为成年小鼠，采用标准的 CO2 方法实施安乐死。使用镊子或解剖剪在侧胸壁和腹部做切口（约 3 cm），以使固定液能够渗透至内脏器官。
- 分析体表结构。
- 设置软件，将图像以包含样本编号、显微镜放大倍数及图像内容的名称保存。
注意：对于 E14.5 或更晚期的小鼠，1.0x 至 3.2x 的放大倍数通常足以清晰成像大多数结构。 - 将小鼠置于体视显微镜镜头下的载物盘中，加入磷酸盐缓冲液（PBS）完全覆盖样本，防止脱水及成像时产生反光。调节放大倍数，使整个胚胎完整显示于屏幕中，随后拍摄胚胎左右两侧的图像。
注意：载物盘底部应涂覆石蜡、硅胶或其他类似基质，以便固定针固定。 - 用针从咽喉部将样本固定，腹面朝上，再拍摄一张图像。
注意：固定针应略微向上倾斜，确保不刺穿胸腔内的重要结构 。
- 设置软件，将图像以包含样本编号、显微镜放大倍数及图像内容的名称保存。
- 分析胸部结构。
- 用镊子夹起颈部中线处的皮肤，用剪刀向两侧腋窝方向剪开皮肤，随后沿中线向尾部剪开皮肤。再从脐部向腿部方向剪开皮肤。通过手腕和脚踝处将样本固定。
注意：应仅剪开皮肤，建议将剪刀刀片保持水平或略微向上倾斜操作。 - 用一对镊子提起皮肤，另一对镊子固定皮下组织，以分离结缔组织。通过皮肤固定样本，有助于暴露胸腔和腹腔（图 2）。
注意：在固定、剪切或刮除过程中过度拉伸可能导致组织损伤。 - 拍摄暴露的肌肉图像，然后轻柔刮除肌肉以暴露肋骨。
- 拍摄暴露的肋骨图像。将肋骨与膈肌分离，并尽可能沿侧面向颈部方向剪开两侧肋骨。
- 移除剪开的肋骨以暴露心脏，拍摄心脏图像。
- 用一对镊子将胸腺剥离，另一对镊子固定胸腺基部，防止撕裂下方血管。拍摄心脏及大血管的图像。
注意：使用固定针适度拉伸邻近结构可能有助于获得更佳的成像视野。此外，应分别拍摄大动脉、心脏及其他感兴趣结构的特写图像，因为这些结构可能无法同时处于焦点范围内。
- 用镊子夹起颈部中线处的皮肤，用剪刀向两侧腋窝方向剪开皮肤，随后沿中线向尾部剪开皮肤。再从脐部向腿部方向剪开皮肤。通过手腕和脚踝处将样本固定。
- 分析腹部结构。
- 牵拉膈肌将其移除，暴露肝脏，拍摄图像。
- 将肝脏向后固定，暴露胃和胰腺，拍摄图像。
- 剪断食管。用镊子将结肠和肠道拉出并移除。在肝脏上方剪断并移除肝脏，以暴露肾脏和肾上腺，拍摄图像。
注意：移除的器官应保存在固定液中。
- 分离胸部组织用于细胞外基质（ECM）分析。
- 沿肝脏与肺之间的直线剪开下胸部。切断头部时应足够高，避免损伤颈动脉分支。
- 轻柔移除侧肋，保留背侧肋骨和脊柱。剥离并刮除外侧的背侧脂肪组织。
- 将胸部组织从身体其余部分分离，放入 10% 磷酸盐缓冲福尔马林溶液中。
3. 包埋
- 将固定液倒入适当的危险废物瓶中。用1×PBS清洗样品，每次15分钟，共清洗三次。
- 使用浓度递增的乙醇和二甲苯对样品进行脱水。以下所有步骤的持续时间取决于胚胎的发育阶段。具体细节请参见表2。
注意：更换溶液时应小心操作，避免损坏样品。样品处理的最佳参数可通过实验经验进行调整。二甲苯会溶解某些塑料材料，因此应使用玻璃器皿和容器。 - 用石蜡取代二甲苯，作用一定时间。将瓶子置于65 °C的培养箱中，持续适当时间（参见表2）。
- 使用新鲜石蜡将样品按所需方向包埋。
注意：建议将样品置于石蜡块中央，背侧朝上，尾侧朝向石蜡块前方。在定位样品时需注意，包埋时石蜡块是倒置的。
4. 表面共聚焦显微镜技术（ECM）
注意：在适当包埋后，胚胎将被依次进行图像采集 通过 用于组织病理学分析的ECM。单个切片可从切片机中取出，用于进一步研究。
- 从-20 °C冰箱中取出石蜡包埋块，并移除金属模具。
- 使用剃刀刀片修剪包埋盒边缘和背面的石蜡。切割样品周围的石蜡，直至样品被包裹在与包埋盒相连的小块方形石蜡中。
注意：操作刀片时需格外小心。 - 使用金属杠杆将石蜡包埋块固定在切片机的切片台上。选择 男性 （手动）功能在 运行模式将石蜡块表面升至接近刀片位置，运行数个切片以确保刀片与石蜡块接触。
- 打开 LAS AF 应用并选择 MatrixScreener选择 单规则矩阵 并加载相应先前保存的模板。点击 快速LUT 按钮，用于切换为白色和橙色渐变。
- 选择 设置任务 并将可见激光的405 nm波长调至最大。将光谱块的左边缘与405 nm谱线对齐，右边缘拖动至800 nm谱线处。标记 针孔 选项并启动 实时 视图
- 调整激光投影的位置，使样本在屏幕上居中，并调节 缩放 将放大倍数调至约20倍。为优化分辨率，将增益设为1,250 V，并使用聚焦旋钮最大化蓝色区域；随后，将增益重置至约750 V进行成像。
注意：具体数值可能因胚胎的状况而异。 - 切换切割方法至 自动，将切片厚度设为约50 µm，然后开始切片。当肺和气道出现在视野中时，停止切割。
- 选择8-10 µm的切片厚度并停止 实时 查看。打开 切片机通信器 开始成像。采集图像前，请确保临时存储文件夹为空。
- 当无法观察到更多心脏结构时，停止切割。关闭 切片机通信器 应用，并将临时文件导出为一个 .tiff 图像序列 通过 用于后续三维重建的图像处理软件
5. 三维（3D）重建
注意：三维重建的目的是将来自细胞外基质成像的二维图像序列处理为冠状面、矢状面和横断面方向的三维视频，并利用这些三维视频对样本中的结构和解剖学异常进行诊断。
- 在图像处理软件中打开 ECM 图像序列。
- 将图像文件拖放到图像处理软件中。在菜单栏中选择 图像 > 变换 > 水平翻转，以水平翻转 ECM 图像。
- 保存翻转后的图像，并关闭图像处理软件。
- 在 DICOM 查看软件中导入 ECM 图像序列。
- 将已水平翻转的 ECM 图像拖放到 DICOM 查看软件中。确保样本列表周围出现浅蓝色边框，否则图像可能会被添加到现有的样本文件夹中。
- 当弹出窗口出现时，选择要复制到数据库中的链接或文件。样本列表中将出现一个新样本，其名称与复制到 DICOM 查看软件中的文件名相同。
- 点击新添加的文件以打开它。
- 执行三维重建。
- 文件打开后，点击工具栏中的 2D/3D 重建工具 菜单，然后选择 3D MPR。
- 对于 像素 X 分辨率 和 像素 Y 分辨率，输入 ECM 成像过程中使用的放大倍数对应的实际图像分辨率。对于 切片间距，输入 ECM 成像时切片的厚度。
注：相机分辨率会随变焦倍数变化，且不同相机之间可能存在差异。
- 使用左侧 工具 选项卡中的不同工具，按需调整图像序列。
- 使用 窗宽/窗位（WW/WL） 工具调节 窗宽 和 窗位。在图像上向上拖动工具可降低图像亮度，向下拖动可提高亮度；向右拖动可降低图像对比度，向左拖动可提高对比度。
注：某一结构的最佳 WW/WL 设置可能不适用于其他结构。因此，建议为观察不同结构分别生成独立的视频。 - 使用 平移 工具将图像拖动至所需位置。使用 缩放 工具按需放大或缩小图像，使用 旋转 工具按需旋转图像。
注：放大图像可能导致图像质量下降。旋转图像时需谨慎，因为这可能导致坐标轴翻转。
- 使用 窗宽/窗位（WW/WL） 工具调节 窗宽 和 窗位。在图像上向上拖动工具可降低图像亮度，向下拖动可提高亮度；向右拖动可降低图像对比度，向左拖动可提高对比度。
- 点击并拖动第一个面板中的彩色坐标轴。注意旋转该轴如何改变另外两个面板的方向。旋转三个面板的坐标轴，直到三个面板分别显示样本的冠状面、矢状面和横断面视图。
注：在重新定向样本时，应保持正确的前/后方向。 - 生成视频。
- 当三个面板均已正确放置、定向并调整亮度后，点击代表冠状面视图的面板。
- 点击菜单栏右侧的 视频导出。点击 批量，然后拖动 起始 和 结束 滑块以覆盖整个感兴趣区域。对于 间隔，选择 与厚度相同 选项。保存视频时注明视图的方向。
- 查看视频，判断是否能清晰识别目标结构。若不能，使用工具（步骤 5.4）按需重新调整视频，并重新保存。
- 对横断面和矢状面视图重复步骤 5.6。利用重建的视频对样本进行诊断。
注：应仔细观看每种方向的视频，全面评估样本是否存在解剖学异常或疾病表型（图 3）。
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结果
具有显著血流动力学缺陷的小鼠胚胎表现为胚胎致死。通过高通量、无创的胎儿超声心动图，结合不同切面，可识别多种类型的先天性心脏病（图1）。
室间隔缺损：最常见的先天性心脏病（CHD）是室间隔缺损，例如室间隔缺损（VSD）、房室间隔缺损（AVSD）和房间隔缺损（ASD）1。VSD 或 AVSD 可通过二维图像和彩色血流图像轻松观察。心室之间或心房与心室之间的血流可被轻易识别（图3）。在胎儿中，房间隔缺损难以与未闭的卵圆孔相区分。
流出道异常： 如图3所示，正常胚胎中主肺动脉的血流与升主动脉的血流呈交叉走行。在右心室双出口（DORV）的胚胎中，可见两条大动脉均起源于右心室。DORV 常伴随室间隔缺损（VSD）（
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讨论
转基因小鼠已被用于研究先天性心脏病的发病机制。本研究提供的方案旨在简化和标准化小鼠胎儿心脏缺陷的评估流程。然而，在操作过程中需注意若干关键步骤。小鼠胚胎在妊娠的每一天都会显著发育，因此通过准确执行胎儿超声心动图可确定合适的小鼠取材时间。胎儿超声心动图可用于筛查胎儿心血管系统的病理情况。二维图像可帮助识别异常解剖结构和心脏功能，结合彩色多普勒技术可观察血流情况，并检测心腔之间是否存在异常交通，或流出道与流入道是否存在异常。为明确先天性心脏病（CHD）的诊断，应在胚胎发育第14.5天（E14.5）开始对胎儿进行扫描，此时心室分隔和心腔结构已基本完成。若在更早阶段进行扫描，所见异常可能仅反映发育延迟而非结构性畸形。
组织病理学是通过使用切片机并结合光学显微镜观察来表征先天性心脏病（CHDs）8 的标准方法。该标准方法的主要缺点在于缺乏用于诊断的心血管结构的直观三维显示，并且无法提供样本的多种视角。细胞外基质（ECM）组织学是表征心脏缺陷最省时的方法。若无法获得ECM，可使用切片机对胚胎进行切片以确定心脏表型。获取心脏成像的其他方法...
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披露
作者声明本稿件不存在利益冲突。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1x 磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1.5 mL Eppendorf 管（或组织储存用首选小瓶） | SealRite | 1615-5599 | |
| 10% 缓冲福尔马林磷酸盐溶液 | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% 乙醇 | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% 多聚甲醛（PFA）固定液 | ThermoScientific | 28908 | 使用前新鲜配制为 1x PBS 中的 4% 工作浓度，4 °C 保存 |
| 50 mL 管 | Falcon | 352070 | |
| 6–12 孔板或 20 mL 小瓶 用于胚胎储存 | Falcon | 353046 | |
| 解剖显微镜 | Leica | MDG36 | |
| 解剖针（A1 或 A2 级） | F.S.T | 26002-15 | |
| 解剖板 | F.S.T | FB0875713 | 带石蜡底的培养皿 |
| 包埋模具 | Sakura | 4133 | |
| 超细剪刀（10.5 cm） | F.S.T | 14088-10 | 1–2 对 |
| Fiji 软件 / Image J | NIH | Fiji.sc | |
| 细尖头（0.05 mm × 0.01 mm）解剖镊（11 cm） | F.S.T | 11252-00 | 2 对 |
| 加热镊子 | F.S.T | 11252-00 | 用于胚胎定位 |
| 石蜡块工业标记笔 | Sharpie | 2003898 | 适用于实验室使用 |
| Jenoptik ProgRes C14plus 显微镜相机 | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro 图像采集软件 | Jenoptik | jenoptik.com | |
| 大玻璃烧杯 | Fisher Scientific | S111053 | 用于熔化石蜡 |
| Leica M165 FC 双目显微镜（16.5:1 变焦光学系统） | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD 版本 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| Paraplast 包埋用石蜡 | Millipore Sigma | 1003230215 | |
| 小玻璃烧杯 | Fisher Scientific | S111045 | |
| 小型带孔勺（14.5 cm） | F.S.T | 10370-17 | |
| 直头 Vannas 剪刀（4–8 mm） | F.S.T | 15018-10 | 一对 |
| Vevo2100 超高频超声生物显微镜 | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| 二甲苯 | Fisher Chemical | UN1307 |
参考文献
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