本文详细介绍了利用胎儿超声心动图、尸检以及基于共聚焦表层显微镜（ECM）的表层荧光成像（EFIC）结合三维（3D）重建技术，对小鼠先天性心脏病（CHD）进行诊断的方法。
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本文内容
摘要
摘要
先天性心脏病（CHD）是美国婴儿死亡的主要原因。在20世纪80年代及更早时期，大多数患有中度或重度CHD的患者在成年之前死亡，其中出生后第一周的死亡率最高。随着外科技术、诊断方法和医学管理的显著进步，患者的预后已得到明显改善。为了满足深入理解先天性心脏缺陷的关键研究需求，小鼠模型提供了一个理想的研究平台，因为小鼠的心脏解剖结构与人类非常相似，且妊娠周期短。结合基因工程技术与高通量表型分析工具，已能够复制并诊断结构性心脏缺陷，从而进一步阐明CHD背后的分子通路。利用无创胎儿超声心动图对小鼠模型的心脏表型进行筛查，结合使用共聚焦表观显微镜（ECM）进行表观荧光图像采集（EFIC）的高保真组织病理学分析，并辅以三维（3D）重建，可深入细致地观察各种先天性心脏病的解剖结构。本实验方案详细阐述了上述方法的完整工作流程，以实现对小鼠先天性心脏病的准确诊断。将该表型分析方案应用于模式生物，将有助于准确诊断CHD，进而揭示其发病机制。明确CHD的潜在机制，将为开发潜在的治疗手段和干预措施提供契机。
引言
先天性心脏病（CHDs）是最常见的新生儿出生缺陷1,2，影响约0.8%–1.7%的新生儿，并导致显著的新生儿死亡率和发病率3。大量证据表明CHDs具有遗传病因4,5。由于小鼠具有四腔心脏，且其胎儿心脏发育相关的DNA序列与人类胎儿高度相似，因此基因修饰小鼠模型被广泛用于研究CHDs的复杂性及其致病机制6。确定小鼠突变体的表型是阐明靶基因功能的基础第一步。表达基因剂量效应的小鼠模型对于理解CHDs的复杂性及致病机制尤为重要，因为单个基因突变可导致一系列类似人类CHDs的心脏畸形。
本文概述了一种用于表征小鼠模型中心脏表型的研究流程。所采用的方法包括胎儿超声心动图7，随后进行解剖及表观遗传学、细胞与分子组织病理学（ECM组织病理学）7,8，这些方法能够清晰展示发育中鼠类心脏表型的精细解剖结构。胎儿超声心动图是一种无创成像技术，可直接可视化多个胚胎，并具备合理的成像分辨率。此外，该技术可快速确....
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方案
在这些研究中使用小鼠是必要的，因为小鼠具有四腔心脏，能够模拟人类的先天性心脏病（CHDs）。小鼠由兽医提供护理，并饲养在本机构获得实验动物管理和使用评估认证协会（AAALAC）认证的动物护理设施中。研究严格遵循相关规程，以尽量减少小鼠的不适、应激、疼痛和损伤。小鼠采用CO2气体实施安乐死，该方法符合美国兽医医学协会《安乐死指南》对小型啮齿类动物的规定。本论文中涉及小鼠的研究均在匹兹堡大学经批准的IACUC方案下进行。
1. 胎儿超声心动图
注意：超声心动图是识别小鼠心血管畸形及心外缺陷的有力工具。由于小鼠胚胎体积较小（中期妊娠时约为1-2 mm，出生时为3.5 mm），需要使用具有超声生物显微镜（UBM）的超高频超声心动图设备。UBM配备多种高频（30-50 MHz）探头，成像窗口较小（15 mm × 14 mm），可提供足够的分辨率（轴向30 µm × 横向68 µm），以便逐个观察小鼠胎儿。40 MHz换能器可提供高分辨率图像，用于识别心血管表型7。
- 打开超声心动图仪器，并选择心脏病学程序。
注意：以下方案适用于从胚胎第（E）14.5天至19.5天的任何小鼠品系。 - 将目标小鼠置于麻醉诱导舱中进行麻醉。使用浓度为4%的异氟烷和....
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结果
具有显著血流动力学缺陷的小鼠胚胎表现为胚胎致死。通过高通量、无创的胎儿超声心动图，结合不同切面，可识别多种类型的先天性心脏病（图1）。
室间隔缺损：最常见的先天性心脏病（CHD）是室间隔缺损，例如室间隔缺损（VSD）、房室间隔缺损（AVSD）和房间隔缺损（ASD）1。VSD 或 AVSD 可通过二维图像和彩色血流图像轻松观察。心室之间或心房与心室之间的血流可被轻易识别（图3）。在胎儿中，房间隔缺损难以与未闭的卵圆孔相区分。
流出道异常： 如图3所示，正常胚胎中主肺动脉的血流与升主动脉的血流呈交叉走行。在右心室双出口（DORV）的胚胎中，可见两条大动脉均起源于右心室。DORV 常伴随室间隔缺损（VSD）（
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讨论
转基因小鼠已被用于研究先天性心脏病的发病机制。本研究提供的方案旨在简化和标准化小鼠胎儿心脏缺陷的评估流程。然而，在操作过程中需注意若干关键步骤。小鼠胚胎在妊娠的每一天都会显著发育，因此通过准确执行胎儿超声心动图可确定合适的小鼠取材时间。胎儿超声心动图可用于筛查胎儿心血管系统的病理情况。二维图像可帮助识别异常解剖结构和心脏功能，结合彩色多普勒技术可观察血流情况，并检测心腔之间是否存在异常交通，或流出道与流入道是否存在异常。为明确先天性心脏病（CHD）的诊断，应在胚胎发育第14.5天（E14.5）开始对胎儿进行扫描，此时心室分隔和心腔结构已基本完成。若在更早阶段进行扫描，所见异常可能仅反映发育延迟而非结构性畸形。
组织病理学是通过使用切片机并结合光学显微镜观察来表征先天性心脏病（CHDs）8 的标准方法。该标准方法的主要缺点在于缺乏用于诊断的心血管结构的直观三维显示，并且无法提供样本的多种视角。细胞外基质（ECM）组织学是表征心脏缺陷最省时的方法。若无法获得ECM，可使用切片机对胚胎进行切片以确定心脏表型。获取心脏成像的其他方法.......
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披露
作者声明本稿件不存在利益冲突。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1x 磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1.5 mL Eppendorf 管（或组织储存用首选小瓶） | SealRite | 1615-5599 | |
| 10% 缓冲福尔马林磷酸盐溶液 | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% 乙醇 | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% 多聚甲醛（PFA）固定液 | ThermoScientific | 28908 | 使用前新鲜配制为 1x PBS 中的 4% 工作浓度，4 °C 保存 |
| 50 mL 管 | Falcon | 352070 | |
| 6–12 孔板或 20 mL 小瓶 用于胚胎储存 | Falcon | 353046 | |
| 解剖显微镜 | Leica | MDG36 | |
| 解剖针（A1 或 A2 级） | F.S.T | 26002-15 | |
| 解剖板 | F.S.T | FB0875713 | 带石蜡底的培养皿 |
| 包埋模具 | Sakura | 4133 | |
| 超细剪刀（10.5 cm） | F.S.T | 14088-10 | 1–2 对 |
| Fiji 软件 / Image J | NIH | Fiji.sc | |
| 细尖头（0.05 mm × 0.01 mm）解剖镊（11 cm） | F.S.T | 11252-00 | 2 对 |
| 加热镊子 | F.S.T | 11252-00 | 用于胚胎定位 |
| 石蜡块工业标记笔 | Sharpie | 2003898 | 适用于实验室使用 |
| Jenoptik ProgRes C14plus 显微镜相机 | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro 图像采集软件 | Jenoptik | jenoptik.com | |
| 大玻璃烧杯 | Fisher Scientific | S111053 | 用于熔化石蜡 |
| Leica M165 FC 双目显微镜（16.5:1 变焦光学系统） | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD 版本 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| Paraplast 包埋用石蜡 | Millipore Sigma | 1003230215 | |
| 小玻璃烧杯 | Fisher Scientific | S111045 | |
| 小型带孔勺（14.5 cm） | F.S.T | 10370-17 | |
| 直头 Vannas 剪刀（4–8 mm） | F.S.T | 15018-10 | 一对 |
| Vevo2100 超高频超声生物显微镜 | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| 二甲苯 | Fisher Chemical | UN1307 |
参考文献
- Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), Baltimore. e20593(2020).
- vander Linde, D., et al.
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