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用于衰老研究的iPSC衍生脑类器官长期培养的稳健组织制备技术

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DOI：

10.3791/64586

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2023年5月12日

 ,  , 
1Department of Applied Stem Cell Technologies, TechMed Centre Enschede, University of Twente, 2Centro de Biotecnología-FEMSA, Tecnologico de Monterrey, 3Department of Genetics, Harvard Medical School

本文内容

摘要

本方案提供了由人诱导性多能干细胞（iPSCs）衍生的脑类器官可重复生成、维持及老化过程的逐步操作流程。该方法能够长期培养和成熟脑类器官，从而有助于模拟与脑老化及年龄相关疾病发生机制有关的生物学过程。

摘要

目前可用的动物和细胞模型尚不能完全重现人类大脑衰老过程中发生的复杂变化。近年来，人们发展出一种新方法，可由人类诱导性多能干细胞（iPSCs）生成人脑类器官，这一进展有望从根本上改变我们对人类大脑衰老及相关致病过程的建模与理解能力。本文介绍了一种优化后的人iPSC来源脑类器官的生成、维持、老化及表征的实验方案。该方案可实现脑类器官的可重复性制备，并作为逐步操作指南，整合了最新的技术手段，显著提升了类器官在培养过程中的成熟度与老化效果。本方案同时针对类器官成熟、坏死、变异性及批次效应等关键问题提出了应对策略。总体而言，这些技术进步将使研究人员能够利用来自不同年轻和年老人类供体，以及患有年龄相关性脑部疾病个体的细胞，构建脑类器官模型，从而揭示人类大脑衰老的生理与致病机制。

引言

随着人类预期寿命的持续延长，衰老相关疾病模型变得日益重要。大规模基因组研究发现，在老年群体中存在分子过程的失调以及影响生活质量的遗传改变1。衰老过程的特征是机体普遍的功能丧失，包括认知功能下降、神经退行性疾病风险增加以及多种慢性疾病的发生2。

目前的细胞培养技术无法充分反映衰老的多因素特性，因为这些功能障碍无法通过突变、毒素或感染得到恰当复制3。研究衰老过程的动物模型通常伴随着较长的实验周期和高昂的成本，同时也带来伦理方面的考量。利用患者来源的诱导性多能干细胞（iPSCs）可以揭示疾病进展背后的分子机制，因为iPSCs能够使细胞自然发育为成熟组织3。iPSCs已成为研究神经退行性疾病众多实验室的核心工具，因为所获取细胞的重编程过程似乎并未消除供体的疾病或衰老印记4。这些印记可重现已在人类和动物模型中观察到的细胞表型，使iPSCs适用于研究高度密集的脑组织中个体细胞的退化过程5,6。由iPSCs衍生的类器官已成为三维组织培养的首选模型，能够实现更复杂的细胞间相互作用，并更好地模拟发育过程。尽管类器官最初主要用于发育相关研究，但其在疾病建模中的应用日益广泛，特别是用于炎症、神经退行性和衰老模型7。在既往iPSC研究的基础上，类器官能够在类似组织的网络连接生理环境中保留疾病表型和细胞表型8,9。然而，培养特定尺寸的三维组织仍具挑战性，尤其是长期培养的情况下。

本研究提出了一种可重复生成脑类器官的详细方法，能够使组织在较长时间内显著增大并成熟。脑类器官的制备方法目前相对标准化，主要借鉴了若干经典实验方案10,11。然而，已有多种改进方法被提出，以提升细胞分化效率和维持类器官长期存活。这些替代方案包括使用促神经生成因子以增强神经分化12，添加额外支架以改善营养交换、延长细胞寿命13，以及采用低剪切应力震荡以支持长期培养与生长14。本方法整合了上述改进措施，旨在构建能够表达神经退行性变和衰老表型的成熟类器官。

方案

患者研究已获得机构审查委员会的批准。所有参与者均签署了书面知情同意书和样本库同意书，允许其数据和生物样本被重新利用。iPSC 细胞系的建立遵循了 IRB 及机构指南。图1 展示了本实验方案工作流程的示意图。

1. 诱导多能干细胞重编程与维持

  1. 采集受试者（老年或疾病患者，年龄65岁及以上）8 mL血液，置于含柠檬酸钠的细胞分离管（CPT）或EDTA或肝素抗凝管中。
  2. 在室温（RT）下以1,800 × g 离心30分钟，收集仅含外周血细胞而无血清的沉淀物15。
  3. 根据制造商说明书使用特定的重编程载体（参见材料表），以获得诱导性多能干细胞（iPSCs）16。
  4. 将iPSCs培养于无饲养层、无乳酸脱氢酶升高病毒（LDEV）的低生长因子基底膜基质包被的6孔培养板中，使用Essential 8（E8）培养基，在37 °C、含5% CO2的湿润环境中培养（参见材料表）。
  5. 使用E8培养基维持iPSCs培养3–4天，以避免细胞过度生长或自发分化。
  6. 利用免疫荧光标记物（步骤2）验证iPSC细胞系的多能性，并进行支原体检测（步骤3）。

2. 多能性染色

  1. 为节约试剂和抗体，分析前3-4天将细胞接种于已包被（步骤1.4）的24孔培养板中。用移液器吸除培养基，并在室温下用磷酸盐缓冲液（1× PBS）中含4%甲醛的溶液固定细胞15-20分钟。
  2. 用1× PBS洗涤细胞3次，然后在室温下用含1%牛血清白蛋白（BSA）的0.1% Triton-X 100溶液透化处理至少15分钟，但不超过1小时。
  3. 再次用1× PBS洗涤3次，并在室温下用含5% BSA的PBS溶液封闭30分钟。
  4. 再用1× PBS洗涤3次，加入Sox2和Oct3/4抗体（1:100稀释；参见材料表）以及核酸染料DAPI（1:4,000稀释）溶于含1% BSA的溶液中，4 °C孵育过夜。用铝箔包裹以避光。
  5. 用1× PBS洗涤3次，将细胞保留在PBS中。使用荧光显微镜在10-20倍放大倍数下进行成像。确保多能性标志物Sox2和Oct3/4定位于细胞核内17,18。

3. 支原体检测

注意：有关详细的检测操作和分析步骤，请参考检测试剂盒的说明书（见材料表）。该检测试剂盒提供用于支原体检测的试剂、底物和检测缓冲液。

  1. 在传代细胞或更换培养基之前，收集 2-3 mL 细胞培养基至离心管中，在室温下以 200 × g 离心 5 分钟，沉淀细胞或碎片。将上清液于 4 °C 保存，保存时间不超过 5 天。将细胞与培养基共同孵育至少 24 小时，以确保获得可检测的信号。
  2. 取 100 µL 细胞上清液加入新的离心管或白色壁 96 孔板的孔中（推荐使用不透明底板，参见材料表）。用检测缓冲液重悬试剂和底物，并在室温下平衡 15 分钟。
  3. 向样品中加入 100 µL 试剂，在室温下孵育 5 分钟。使用发光仪测量发光值（测量值 #1）。
  4. 向样品中加入 100 µL 底物，在室温下孵育 10 分钟。测量发光值（测量值 #2）。
  5. 通过测量值 #2 与 #1 的比值判断支原体污染情况。结果解读请参考试剂盒说明书。

4. 微丝制备

  1. 使用手术刀的钝端将聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA，参见材料表）缝合线解开松散，然后用70%乙醇轻轻喷洒处理松散的纤维。
  2. 在显微镜下，借助尺子将PLGA纤维切割成长度为500 µm至1 mm的片段，总共切割约25 mm长的纤维。将切割后的纤维保存在15 mL离心管中，并加入1 mL抗生素-抗真菌素溶液。
    1. 在生物安全柜中，用10 mL DMEM/F-12培养基（表1）稀释纤维溶液，充分涡旋混匀。
      ​注意：操作需在细胞培养超净台的无菌环境中进行。
  3. 向96孔板中三个用于胚胎体（EB）形成的孔中，每孔加入20 µL纤维溶液。在明场显微镜下计数每孔中的纤维数量并计算平均值，调整浓度使每孔平均含有5–10根PLGA微纤维。以相同方式准备每个孔。
  4. 此时，各孔已准备好接种细胞。若暂不使用，可将培养板置于室温保存，或于4 ˚C保存至次日。

5. 胚状体（EB）形成

注意：所有培养基和溶液必须预热至室温。

  1. 当iPSCs达到70%-80%融合度时（图2A），即可进行传代并用于拟胚体（EB）形成。使用显微镜在10x-20x放大倍数下观察细胞，确保克隆中自发分化的区域极少（<10%）。
  2. 用移液器吸除培养基，并用DPBS洗涤细胞一次。加入500 µL细胞解离溶液（见材料表）或0.5 mM乙二胺四乙酸（EDTA），在37 °C孵育3-5分钟。
    注意：操作需在无菌环境下的细胞培养生物安全柜中进行。
  3. 向每孔加入1 mL新鲜E8培养基，轻柔吹打，收集解离的细胞，直至所有细胞完全脱离。
  4. 将1.5 mL细胞悬液转移至15 mL离心管中，再加入1 mL新鲜E8培养基，使总体积达到2.5 mL。
  5. 在室温下以290 x g离心3分钟。
  6. 用移液器吸除上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL Essential 6（E6，见材料表）培养基中，该培养基需添加50 µM ROCK抑制剂，并使用血细胞计数板对细胞进行计数19。
  7. 根据所需的接种密度，用添加了50 µM ROCK抑制剂的E6培养基制备浓度为60,000-90,000个细胞/mL的细胞悬液（见材料表）。
  8. 向每个96孔超低吸附（ULA）板孔（或预先准备的凹形板20）中加入150 µL细胞悬液，每孔接种9,000-11,000个细胞。
  9. 将培养板在室温下以290 x g离心1分钟，促使细胞聚集。随后将培养板置于37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中培养。

6. 神经上皮诱导

  1. 24 小时后，用移液器小心吸出 120 µL 培养基。注意不要将移液器吸头插入过深，以免吸走类胚体（EB）。
  2. 每孔加入 150 µL E6 培养基（室温），并补充 2 µM XAV939 以及 SMAD 抑制剂：10 µM SB431542 和 500 nM LDN 193189（见材料表）。
  3. 每天更换新鲜配制的 E6 培养基，培养基中需添加 2 µM XAV939、10 µM SB431542 和 500 nM LDN 193189。
    注意：至第 6 天（DIV6）时，类胚体直径应达到 550–600 µm，可进行后续分化。

7. 类器官的分化与成熟

注意：所有培养基均需预热至室温。

  1. 在大约 DIV7 时，检查所有 EB 是否均已达到 550–600 µm 的直径，并呈现光滑且清晰的边缘（图2B）；此时，它们已准备好嵌入细胞外基质（ECM）中。
    注意：在无菌环境中操作。
  2. 使用热塑性封膜制备带凹面的包埋片（参见 材料表将一张约4英寸长的薄膜片放在一个空的P200盒上，使用15 mL离心管或500 µL微量离心管，轻轻将薄膜片压入孔中，形成12个凹陷。用70%乙醇喷洒薄膜片，并在超净台内打开紫外灯照射至少30分钟，使其干燥。
  3. 解冻足量的基底膜基质（Matrigel，参见 材料表) 置于冰上，并放入超净台中。
    注意：根据EB要求，大约需要30 µL未稀释的膜基质。始终将膜基质保持在4 °C以下，以防止其发生凝胶化。建议使用预冷的移液器吸头，因其可减缓基质在吸头内聚合，从而减少材料损失。
  4. 使用宽口P200枪头将一个类胚体（EB）转移至每个凹孔中，并用普通枪头尽可能吸除培养基，注意避免类胚体干燥。使用常规P200枪头向每个类器官加入约30 µL未稀释的基底膜基质，确保类胚体位于液滴中央。
  5. 将所有拟胚体包埋于基质中后，将含有拟胚体的薄膜置于无菌培养皿中。
    注意：可选地，可在较大的培养皿内靠近薄膜片的位置放置一个盛有无菌水的小培养皿，以防止蒸发。
    1. 将培养皿转移至培养箱中，在37 ˚C、含5% CO₂的湿润环境中孵育2 静置约10分钟，使膜基质凝固。
  6. 每12个包埋的类器官准备5 mL不含维生素A的B27分化培养基（表1) 加入超低吸附6孔板的一个孔中。将该培养板置于培养箱中，预热至37 °C。
  7. 孵育时间结束后，通过取下薄膜片并从片背面推出凹面，将包埋的EBs转移至超低吸附6孔板中。如有必要，可从孔中取出1 mL液体，滴加到薄膜片上，以帮助液滴从膜上脱落。
    注意：嵌入后1天即可观察到重要的形态学变化；拟胚体从边缘光滑逐渐形成隆起的突起，进而发育成芽状结构（图2C).
  8. 培养2天后（DIV9），进行半量换液。操作过程中需小心，避免吸除或损伤膜基质液滴。
  9. 再过两天（DIV11），进行完全换液，向培养基中添加 3 µM CHIR99021（参见 材料表).
  10. 在DIV14时，将培养基更换为含维生素A的B27分化培养基（表1) 以实现类器官大小的逐渐增加。
  11. 在DIV16时，将培养板置于培养箱内的轨道摇床上，以90 rpm振荡。每2天更换一次培养基。
  12. 每40天，向每50 mL培养基中加入500 µL基底膜基质，以提供额外营养。

结果

整合PLGA纤维、凹坑包埋和振荡培养，可稳健地生成脑类器官，从而实现由iPSC衍生的类器官长期维持培养（图1）。

类器官形成示意图，iPSCs 分化，E6+SMAD，培养基更换，基底膜包埋。
图 1：本方法的工作流程与时间线示意图。 请点击此处查看该图的高清版本。

最初的神经诱导阶段与先前已发表的方案相当11。类胚体（EB）最初呈圆形聚集体（图2B），边缘呈白色或透明状。当在DIV7将EB从神经诱导培养基更换为神经维持培养基后，24小时内圆形组织上开始出现突起和芽状结构（图2C）。此外，随着类器官持续生长，PLGA纤维的表面积有助于类器官的伸长（图2D）。在成熟过程中，类器官的边缘需保持完整，这是细胞健康和正常发育的良好标志；否则必须补充额外的营养物质13（图2E）。通过震荡类器官培养物可进一步促进类器官的生长，因为这有助于营养物质的灌注。

细胞分化过程、干细胞培养、显微镜图像、生物学研究分析。
图 2：脑类器官的分化与成熟。（A）70%–80% 汇合度的诱导多能干细胞（iPSC）培养的代表性图像。（B）生成拟胚体（EBs），并诱导神经外胚层形成至 DIV7。随后将 EBs 包埋于基质膜中，进一步分化为脑类器官。（C）DIV10 时的类器官显示出明显的出芽结构。类器官可在基质膜中进一步成熟，采用（D）凹孔法或（E）夹心法包埋，图中显示为 DIV30。（F）长期培养显示脑类器官生长至显著大小（DIV70）。比例尺 = 500 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

类器官的尺寸和外部形态由其内部复杂的结构所补充。在分化第一阶段的第7天（DIV7）固定组织后，胚状体（EB）中的细胞表达SOX2，这是一种HMG盒转录因子，可作为多能性神经干细胞的标志物。21以及成对蛋白盒基因 Pax-6，提示为神经前体细胞（图3)。由TuJ1（class III β-微管蛋白）标记的未成熟神经元22 已经可以在组织中零星观察到。

在此阶段，类器官经历的自组织现象开始显现。这些被称为玫瑰花结样的径向结构的排列方式类似于神经管，其中SOX2+细胞位于玫瑰花结的中心。21 以及 PAX6 向玫瑰花结边缘分布。这些玫瑰花结向外迁移时分化为神经元。这些辐射状细胞最初同时表达神经干细胞/前体细胞标志物 Nestin23 和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）相似，类似于神经发生区域中发现的放射状胶质细胞 体内 脑。随着这些迁移中的神经元逐渐成熟，细胞骨架标志物也反映出这一变化22早期神经分化标志物 TuJ122 在莲座状结构的内圈可见，并转移至微管相关蛋白2（MAP2）24一种外周神经元特异性的成熟标志物。

免疫荧光染色细胞培养的复合图像；标记物：SOX2、TUJ1、PAX6、DAPI。
图3：体外培养第7天（DIV7）的胚状体显示结构组织化及未成熟特征。 DIV7时胚状体的全 mount 免疫组织化学图像。（A）胚状体的复合图像，显示（B）SOX2+ 神经玫瑰花结结构，（C）散布于整个胚状体中的未成熟神经元（TUJ1），（D）神经前体细胞（PAX6），以及（E）DAPI显示的细胞核。比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看该图的高清版本。

随着类器官的成熟，发育中神经元的结构组织和标志物开始模拟生理条件。在体外培养第30天（DIV30），可观察到许多形成神经发生区域的玫瑰花环样结构，这些区域相当于发育中的脑组织。25到第60天时，这些SOX2+神经发生区域已不复存在，取而代之的是成熟的MAP2和NeuN26，一种神经元分化标志物，以及阳性神经元（图4 和 图5).

荧光显微镜图像；复合图像，MAP2、NeuN、DAPI染色；细胞结构分析。
图4：体外培养至120天的类器官表现出成熟的神经元特征。 体外培养120天（DIV120）类器官切片的免疫组织化学图像。（A）显示成熟神经元标志物的复合图像，其中（B）为MAP2（紫色），（C）为NeuN（绿色）。（D）DAPI标记细胞核。比例尺 = 20 µm。请点击此处查看该图的高清版本。

微滴数字PCR结果，振幅与事件数，DNA定量，图谱分析。
图5：DIV120类器官的数字微滴PCR。 数字微滴PCR图显示了（A）MAP2（上方，蓝色）和（B）NeuN（下方，绿色）的绝对表达值。斜向黄色线条区分不同的iPSC系（A、B、C等），类器官已被分批归组。N = 5。 请点击此处查看该图的放大版本。

这些细胞骨架标记物可与其他终末分化标记物（如doublecortin）联合使用27 和突触素28）以探究突触可塑性及其他与年龄相关的功能衰退（图6），以及星形胶质细胞和胶质细胞等其他脑组织图7).

显示 MAP2、DCX、SYN 和 DAPI 蛋白表达的免疫荧光显微镜示意图。
图 6：突触终末分析示例。 器官样体在 DIV 120 时的免疫组织化学图像。（A）该切片的复合图像，分别显示（B）MAP2、（C）双皮质素（DCX）和（D）突触素 I（SYN）染色结果。（E）DAPI 显示细胞核。比例尺 = 200 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

脑组织荧光显微镜图像；Iba1、NeuN、DAPI染色；细胞鉴定；合并图像。
图 7：胶质细胞发育的证据。 器官样物在 DIV 120 时的组织切片免疫组织化学图像。（A）为该切片的复合图像，分别显示（B）钙离子结合接头分子1（Iba1）和（C）NeuN 的染色结果。（D）DAPI 显示细胞核。比例尺 = 100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

试剂终浓度体积（总体积 50 mL）
DMEM-F1250%25 mL
Neurobasal 培养基50%25 mL
N2 补充剂 (100x)1x0.25 mL
B27 补充剂 -/+ 维生素 A (50x)0.5x0.5 mL 
胰岛素0.25%12.5 µL
GlutaMAX (100x)1x0.5 mL 
MEM-NEAA (100x)0.5x0.25 mL
HEPES (1 M)10 mM0.5 mL 
抗生素/抗真菌剂 (100x)1x0.5 mL 
2-β-巯基乙醇50 µM17.5 µL
*注意：某些 DMEM-F12 已含有 GlutaMAX，无需额外添加。

表1：本研究中使用的分化培养基的成分。

讨论

类胚体（EBs）的标准化形成是多能干细胞可重复地转化为脑类器官的关键步骤。将干细胞强制聚集形成单一组织的过程可能因凹形孔板的几何形状、接种密度和孔板处理方式的不同而有所差异。尽管当前方法指出在培养6天后类胚体直径范围为500–600 µm，但该直径范围并不排除其他尺寸下也能成功形成类器官，因为已有许多其他尺寸被证实可行。然而，不同直径已被证明会影响分化速率和成功率29。为了保证实验的可重复性，建议直径变异控制在50 µm以下20。此外，神经诱导时间可从6天延长至10天，以允许类胚体进一步增大直径，因为已有研究表明，仅需暴露5天，SMAD抑制剂即可高效促进并维持神经外胚层的形成30。若不使用SMAD抑制剂，神经诱导结果可能不一致，因而需要更长的诱导周期。本文所引用的SMAD抑制剂效果最佳，但其他dorsomorphin和TGF-β小分子也可在有效浓度下使用。

基底膜基质为细胞生长提供了优良的基底，且可通过不同方式施用。早期对基质的应用包括将基底膜作为孔板包被材料31。然而，将基质用于组织包埋可显著改善这些组织的分化与成熟过程32。对于类器官而言，使用基质已被证明可促进胚胎体向类器官的分化，提升成熟度，并延长培养时间33。尽管在无基质条件下仍可形成类器官——许多研究团队已致力于实现无基质的组织培养34,35——但研究发现，基质包埋的类器官更有可能实现长期培养，且所需维护更少36。采用凹坑法进行包埋可使类器官表面获得均匀覆盖，确保相似的扩散条件、营养物质获取以及可重复的分化结果。 alternatively，也可采用穹顶法包埋以实现对类器官的完全包裹37。

将EBs转移至膜基质凹孔中是一个关键步骤。虽然1 mL移液器吸头的开口足够宽，可用于转移EBs，但更推荐使用200 µL吸头以方便操作。200 µL吸头需剪切以形成足够大的开口，并确保边缘平滑，以减少移液时产生的剪切应力。此外，也可使用宽孔型200 µL吸头以简化转移过程。移液操作应缓慢进行，因为快速移液可能破坏类器官外围结构，影响其正常生长。需特别注意确保转移足够的培养基以提供营养。培养基过少可能导致类器官干燥，引发坏死；而转移过多的培养基则会使基质过度稀释，无法牢固包封类器官。理想情况下，基质稀释程度不应超过50%，以确保其能够正常聚合，并发挥EBs的细胞外基质（ECM）功能。若包埋失败，EBs可被回收并重新包封。在任何阶段，均可将EBs重新包封于新鲜基质中，以提供类器官额外的支持。

与用于支架构建的基质包埋类似，PLGA纤维为三维生长提供了额外支持。最初引入PLGA纤维是为了促进类器官的伸长并增加表面积38，但后续研究逐步发现，PLGA纤维还可作为促进类器官分化与成熟的有效工具39。随着越来越多的实验室致力于减少基质使用甚至完全去除基质，由嵌入纤维所支持的类器官自组织特性已足以提供构建三维组织及实现分化的必要支架支持39。本研究中结合使用了这两种方法，以提高长期培养的成功率38,39。在初始细胞聚集阶段即引入纤维至关重要，因为后续阶段难以有效加入纤维。离心后，应检查是否有数根纤维与细胞聚集体共存，以确保胚胎体（EB）中成功嵌入纤维。若未观察到纤维嵌入，可轻柔吸除孔内液体后重新离心，以确保充分混合。

类器官培养中的另一个关键步骤是使用轨道摇床以改善培养基的灌注效果。在早期的类器官培养方案中，曾采用旋转式生物反应器来产生搅动11。在90 rpm转速下运行的轨道摇床可提供足够的搅动，同时不会破坏基质液滴或损伤类器官的形态。有些研究团队虽不使用基质支架，但仍保留摇床搅动以维持适宜的培养环境34。与所有实验方案一样，摇床转速需根据具体设备进行调整，以降低剪切应力。若采用穹顶式包埋法，可使用倾斜的摇床以进一步减少剪切应力11,34。

综上所述，多种选定技术的整合为诱导多能干细胞（iPSC）来源类器官的形成提供了一种稳健的方法。目前存在多种创建和维持类器官的方法，但其中许多方法主要关注早期分化过程。在本研究中，结合了多种不同的技术，以实现类器官的长期培养，使其超越分化阶段，进入可启动衰老表型发育的成熟期。采用这些技术可在无需外源性生物因子维持培养的条件下实现长期成熟，同时保留类器官的自我组织能力及自然的衰老进程。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由荷兰器官芯片计划（Netherlands Organ-on-Chip Initiative）资助，该计划为荷兰教育、文化与科学部资助的荷兰科学研究组织（NWO）引力项目（编号：024.003.001）。D.C.B. 感谢墨西哥国家科学技术理事会（Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, CONACyT）提供的博士奖学金资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-β-巯基乙醇Thermo Fisher Scientific31350010
4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）InvitrogenD13061:4000
6孔透明平底CELLSTAR细胞培养多孔板 Greiner Bio-One657185
6孔透明平底超低吸附培养板Corning3471
96孔透明圆底超低吸附微孔板Corning7007
96孔Nunclon Delta处理平底微孔板Thermo Fisher Scientific136101
AccutaseSigma-Aldrich46964细胞解离溶液 
抗生素-抗真菌剂（100倍浓缩液）Gibco15240062
B27添加剂（含维生素A）（50倍浓缩液）Gibco17504044
B27添加剂（不含维生素A）（50倍浓缩液）Gibco12587010
BD Vacutainer™ 玻璃单个核细胞分离管（CPT管）Thermo Fisher Scientific02-685-125
牛血清白蛋白 Sigma-AldrichA9418
离心机Eppendorf5810 R配备板架
CHIR99021Selleck ChemicalsS2924
CytoTune仙台病毒重编程载体Thermo Fisher ScientificA1378001
ddPCR引物 | 人源 | MAPTBio-RaddHsaCPE192234
ddPCR引物 | 人源 | RBFOX3 (NeuN) Bio-RaddHsaCPE5052108
DMEM/F12Thermo Fisher Scientific11320074
双皮质素（DCX）Santa Cruz BiotechnologySC-80661:500
Dulbecco’s磷酸盐缓冲液（DPBS）Thermo Fisher Scientific14190144不含钙、不含镁
Eppendorf离心管，1.5 mL Eppendorf0030 125.215
Essential 6GibcoA1516401
Essential 8GibcoA1517001
乙二胺四乙酸（EDTA） Invitrogen15575020
Falcon离心管，15 mL，锥形Greiner Bio-One188271-N
甲醛 Sigma-Aldrich25254937% 储存液，用PBS稀释至4%
Geltrex LDEV-Free低生长因子还原型基底膜基质Thermo Fisher ScientificA1413202
GlutaMax（100倍浓缩液）Gibco35050038
血细胞计数板细胞计数器Hausser scientific1490
HEPES缓冲液Thermo Fisher Scientific15-630-080
胰岛素Sigma-AldrichI9278
LDN 193189StemCell Technologies72147
MAP2Abcamab324541:200
Matrigel生长因子还原型（GFR）基底膜基质，LDEV-freeCorning356230基底膜基质
MEM-非必需氨基酸溶液（MEM-NEAA；100倍浓缩液）Thermo Fisher Scientific11140050
Multilabel Counter Victor 3微孔板读数仪Perkin Elmer 1420发光检测仪
MycoAlert支原体检测试剂盒LonzaLT07-318
N-2添加剂（100倍浓缩液）Thermo Fisher Scientific17502-048
NeuNMilliporeMAB3771:500
Neurobasal培养基Thermo Fisher Scientific21103049
Oct-3/4抗体（C-10）Alexa Fluor 647Santa Cruz Biotechnologysc-5279 AF6471:100
Parafilm封口膜BemisPM-996热塑性薄膜片
PAX6Thermo Fisher Scientific42-66001:200
青霉素/链霉素Gibco15070063
聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）微丝EthiconJ463
QX200数字微滴PCR系统Bio-Rad1864001
ROCK抑制剂（Y27632）Selleck ChemicalsS1049
SB431542 R&D Systems1614/50
SOX2单克隆抗体（Btjce），Alexa Fluor 488，eBioscienceInvitrogen53-9811-801:100
突触素I（SYN）Calbiochem5747771:200
Triton-X 100 Sigma-AldrichT8787
TUJ1Santa Cruz Biotechnologysc-80005β-3微管蛋白；1:500
XAV939Tocris Bioscience3748

参考文献

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