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方法文章

Saccharomyces cerevisiae 单倍体交配效率的测定

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⸱

DOI：

10.3791/64596

⸱

2022年12月2日

 ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Indian Institute of Technology Bombay, 2Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of Michigan, Ann Arbor

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究描述了一种用于定量酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）交配效率的可靠方法。该方法在物种形成研究中对合子前隔离屏障的定量分析尤为有用。

摘要

Saccharomyces cerevisiae 是遗传学、进化和分子生物学研究中广泛使用的模式生物。近年来，它也成为研究物种形成相关问题的热门模式生物。酵母的生活周期包括无性和有性两种繁殖阶段。由于进化实验操作简便且世代时间短，该生物可用于研究生殖隔离屏障的进化过程。两种交配型（a 和 α）结合形成 a/α 二倍体的效率被称为交配效率。单倍体之间交配效率的任何下降均表明存在合子前隔离屏障。因此，为了量化两个单倍体之间生殖隔离的程度，需要一种可靠的交配效率定量方法。为此，本文介绍了一种简单且高度可重复的实验方案。该方案包括四个主要步骤：将单倍体菌株点种在 YPD 平板上，等量混合两种单倍体细胞，梯度稀释后涂布以获得单菌落，最后根据缺失培养基平板上的菌落数量计算交配效率。实验中使用营养缺陷型标记以明确区分单倍体与二倍体。

引言

Saccharomyces cerevisiae（通常称为芽殖酵母）是一种单细胞真核生物。它具有两种交配型：a 和 α，并表现出无性和有性两种生殖周期。a 和 α 交配型均为单倍体，在周围环境中不存在另一种交配型时，可通过有丝分裂进行增殖，此过程代表酵母的无性生殖周期。当两种交配型彼此靠近时，它们将停止有丝分裂，并融合形成一个二倍体细胞。当营养充足时，二倍体酵母可通过有丝分裂进行增殖；而在氮源缺乏且存在非发酵性贫碳源（如乙酸盐）的条件下，则会启动减数分裂1。这一过程导致孢子的形成，孢子将保持休眠状态，直至出现适宜的生长条件。当这些孢子萌发并释放出两种单倍体细胞回到单倍体群体中时，其生命周期即告完成2,3（图1）。

酵母细胞的交配过程包括多个步骤，例如凝集、交配突起（“shmoos”）的形成，随后是细胞融合和核融合4,5。两种交配型a和α分别产生a-因子和α-因子，以启动交配过程。这些因子是多肽信息素，可与相反交配型细胞表面存在的受体（Ste2和Ste3）结合5。信息素与受体的结合会启动信息素应答通路，即丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号转导通路6,7,8。这会导致细胞周期停滞在G1期，从而进入代谢活跃的静止期9。随后，细胞停止有丝分裂，并合成交配所需的蛋白质。由于单倍体细胞无法主动相互移动，因此会朝向交配伴侣方向形成交配突起（“shmoo”）。当细胞相互接触时，细胞壁被降解，细胞质内容物融合，最终完成交配并形成二倍体细胞10,11。单倍体细胞之间的交配效率已被用作衡量实验室进化菌株以及现存物种之间物种形成程度的指标12。

酵母作为一种简单的真核生物，是研究与复杂真核生物相关众多科学问题的首选模式生物。其中一个研究问题是物种形成以及生殖隔离机制的演化13,14。对于有性生殖的生物而言，物种的定义通常依据恩斯特·迈尔（Ernst Mayr）提出的生物学物种概念（BSC）15。根据该概念，若一个群体中的两个个体无法杂交并存在生殖隔离，则被视为属于不同物种。有性生殖周期的中断（包括配子融合形成合子、合子发育为后代，以及后代达到性成熟）会导致生殖隔离。如图1所示，S. cerevisiae的生活周期与有性生殖周期相似：a）两种交配型a和α的融合类似于有性生殖生物中配子的融合；b）二倍体细胞进行有丝分裂的能力相当于合子发育为后代的过程；c）二倍体细胞发生孢子形成的过程则类似于配子发生过程14。

当观察到同种交配偏好时，会发生合子前隔离。在两种遗传背景不同的a型细胞具有同等交配机会的情况下，一种α型细胞会优先选择其中一种进行交配，反之亦然14。在单倍体细胞于不同环境中进化的实验中，可通过交配实验来确定是否存在交配前隔离屏障。与祖先菌株相比，若交配效率下降，则表明已进化出交配前屏障。合子后隔离可能源于二倍体细胞无法有效进行有丝分裂和/或无法形成单倍体孢子14。这两方面可通过分别测量二倍体的生长速率和计算孢子形成效率来进行量化。因此，为研究生殖隔离屏障的进化，需要建立可靠的方法来量化：(a) 交配效率，(b) 二倍体的有丝分裂生长能力，以及 (c) 二倍体的孢子形成效率。本研究报道了一种用于定量酵母菌株交配效率的可靠方法。

在实验室实验中，检测交配发生的方法之一是利用营养缺陷型标记来互补营养需求。当两种交配型分别对两种不同的氨基酸具有营养缺陷时，只有由这两种交配型融合形成的二倍体细胞才能在缺乏这两种氨基酸的培养基上生长。因此，营养缺陷型标记可用于定性和定量地检测交配。在减数分裂后鉴定菌株交配型时，定性检测即可满足需求16。而在研究交配途径相关基因时，若需确定交配能力的降低，则必须进行定量检测17,18。此外，随着酵母在物种形成研究中的应用日益广泛，建立一种简便且可重复的交配检测方法变得十分必要，因为交配效率的量化是衡量合子前隔离屏障的重要指标。

两种酵母交配类型之间的交配效率此前已有定量研究16,19,20。以往使用的方法在设计上大多相似，仅存在少数差异16,21,22,23,24,25。其中一些方法采用对数早期培养物，而另一些则采用单倍体菌株的对数中期培养物。两种交配类型混合时的比例也有所不同。几乎所有方案均使用硝酸纤维素膜。将来自预先培养的两种交配类型菌悬液混合后，过滤至置于YPD平板上的硝酸纤维素膜上。在该方案的一种变体中，单倍体菌悬液被直接点种到YPD平板上21。在研究涉及两种交配类型信息素生成相关基因的实验中，制备两种交配类型菌悬液时会外源添加信息素24。

将单倍体细胞混合后孵育数小时（通常约为5小时），随后将细胞从膜上洗脱，进行稀释并涂布于选择性培养基上。在1973年报道的一种早期方法中，通过血细胞计数板在显微镜下计数出芽细胞、未出芽细胞以及交配成对的细胞数量，从而计算合子形成或交配的效率26。然而，后续报道的大多数方法均采用营养缺陷型标记来区分单倍体与二倍体细胞。交配效率的计算方式为：在细胞群体中，二倍体细胞数量占二倍体与单倍体细胞总数的百分比16,21,23。

然而，尽管已有大量研究报告使用酵母作为模式生物来研究物种形成，但迄今为止，文献中尚未报道用于计算交配效率的标准化方案。处于对数生长期的细胞可能并不适合用于交配效率的定量分析。在交配过程中，两个单倍体细胞的细胞周期会停滞，因此交配期间的细胞并不进行分裂9。由于已知在静止期细胞中细胞周期同样会发生停滞27，因此使用此类细胞可提高实验方案的可重复性。静止期细胞可在YPD平板（即营养丰富的环境）上混合并铺板进行交配。传统操作流程还需使用硝酸纤维素膜，并需对细胞进行洗涤，使整个过程繁琐且容易因操作不当而产生误差。此外，迄今所使用的方案均以单一单倍体为基础来量化交配效率。然而，在测量生殖隔离时，交配效率应针对特定的单倍体组合进行量化，而非仅针对单个单倍体。

为了解决这些问题，本文报道了一种用于定量酵母交配效率的稳健方法，该方法具有高度可重复性且易于使用。此外，本研究所采用的该方法及酵母菌株也可用于探讨基因流对交配屏障进化影响的相关研究。

本研究使用了两种不同的 S. cerevisiae 菌株。其中一种菌株来源于 SK1 背景；该菌株由本实验室通过在 MAT 位点附近添加营养缺陷型标记进行改造。单倍体菌株的相应基因型见表128,29,30。在 SK1 菌株中，a 型单倍体在 MAT 位点附近插入了 TRP1 基因，而 α 型单倍体在 MAT 位点附近插入了 LEU2 基因。在 ScAM 菌株中，TRP1 和 URA3 基因分别插入到 a 和 α 型单倍体中。插入位点位于 III 号染色体（Chr III: 197378..197609）的 ARS 区域。对于本报告所述的实验方案，基因组上任何位置的营养缺陷型标记均可满足要求。然而，将营养缺陷型标记置于 MAT 位点附近，意味着这些菌株还可用于研究基因流对物种形成影响的相关实验31,32。将标记插入 MAT 位点附近是为了防止因重组导致标记发生重排。因此，本实验方案既可用于量化物种形成研究中的交配效率，也可用于研究交配通路相关蛋白时鉴定交配效率的变化。

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方案

注意：该实验方案主要包括以下步骤：（1）将单倍体细胞点种到 YPD 平板的交配效率网格中，（2）在 30 °C 培养 24 小时后，将单倍体细胞等量混合，并让混合后的单倍体细胞进行数小时的交配（本研究中为 7 小时），（3）将混合后的细胞在 30 °C 培养 7 小时后涂布于 YPD 平板上，以分离单菌落，最后（4）利用营养缺陷型标记确定所形成的二倍体细胞数量。以下将详细讨论这些步骤（另见图 2）。

1. 在交配效率网格中对单倍体进行点种

  1. 从冻存菌种中复苏单倍体a和α，在YPD琼脂平板（2%琼脂，2%葡萄糖，1%蛋白胨，0.5%酵母提取物）上划线，于30 °C培养48小时，以获得分离的单菌落。
  2. 从YPD平板上挑取单菌落接种于5 mL YPD液体培养基（2%葡萄糖，1%蛋白胨，0.5%酵母提取物）中，于30 °C、250 rpm振荡培养48小时。此培养阶段结束后，细胞处于生长的稳定期。
  3. 在新的YPD平板上绘制交配效率网格。将网格画成一个1 cm × 1.5 cm的矩形，均分为三个小格，每格尺寸为1 cm × 0.5 cm，如图2A所示。
  4. 取两种交配类型的YPD培养物各5 µL，分别点种于最左侧和最右侧的小格内（图2B）。该体积大约对应于每个区域铺展约5 × 105个单倍体细胞。将平板于30 °C培养24小时。
    注意：设置网格的目的是使实验测量更加精确（例如实验中细胞数量的控制）。网格尺寸足够小，便于实验操作，同时又足够大，易于处理（如从网格中转移细胞），并减少漂移或偶然事件的影响。

​2. 单倍体混合与交配

注意：24小时后（图2C），将两种单倍体类型的等量细胞分别从两个网格上刮下，混合后置于中心矩形区域（图2D）。

  1. 为了混合等量的细胞，使用无菌牙签从外侧方格中移除约三分之一的菌斑，并将每种单倍体细胞分别重悬于无菌1.5 mL离心管中的20 µL水中。
  2. 取5 µL上述悬液加入2 mL水中稀释。使用分光光度计在600 nm波长下测定该稀释悬液的OD值。根据OD值以及该特定菌株在1 OD时对应的细胞数（个/mL），从两种菌株中取等量细胞进行混合。计算所需混合体积，并从剩余的15 µL单倍体悬液中吸取相应体积。
    注意：中心矩形区域接种的细胞数量应使细胞形成单层。假设酵母细胞为半径2.58 µm的球体33，则1 cm × 0.5 cm的矩形区域约需1.7 × 106个细胞才能形成单层。操作时应注意确保用于交配的中心区域细胞与两侧单倍体细胞网格之间无物理接触。由于需要混合等量的两种单倍体细胞，因此每种菌株各加入8.5 × 105个细胞。细胞数量根据OD测定结果计算，通常认为在600 nm波长下1 OD约相当于1 × 107个细胞34。例如，若a型单倍体悬液的OD600为0.17，而α型单倍体为0.11，则可计算出5 μL每种单倍体悬液中的细胞数。为确保每种单倍体类型均含有8.5 × 105个细胞，需混合1.25 μL的a型单倍体悬液和1.93 μL的α型单倍体悬液。
  3. 将所需体积的两种单倍体悬液加入新的无菌1.5 mL离心管中，用移液器充分混匀。此悬液的终体积通常约为6–8 µL。将该混合悬液接种至中心网格区域。将培养板置于30 °C孵育7小时，使单倍体细胞充分完成交配过程（图2E）。

3. 在YPD琼脂培养基上接种混合细胞

  1. 孵育7小时后，使用牙签或移液器吸头从中心矩形区域刮取细胞，并用2 mL无菌水稀释。随后将细胞悬液涂布于YPD琼脂平板上以获得单菌落。为确定获得单菌落所需的稀释倍数，需测量刮取细胞后加入的第一管溶液的OD值。每种细胞类型/菌株所需的特定稀释倍数需单独确定。
    注意：例如，OD600为0.15时相当于2 mL悬液中含有3 × 10⁶个细胞（按1 OD = 1 × 10⁷个细胞/mL计算）。为了在YPD平板上获得数百个菌落，可将细胞悬液连续进行两次1:20的系列稀释，然后取100 μL最终稀释液进行涂布。
  2. 涂板后，将YPD平板置于30 °C培养36–48小时，直至出现单菌落。每次交配实验应获得数百个独立菌落用于筛选，以确保数据中可检测到统计学显著性（图2F）。

4. 利用营养缺陷型标记筛选二倍体

  1. 确定所获得的菌落中二倍体所占的比例。为了在平板上鉴定二倍体菌落，通过划线法将单个菌落分别转移至缺乏菌株所需氨基酸的双缺失培养基平板（2% 葡萄糖、0.66% 氮源基础培养基、0.05% 双缺失氨基酸混合物和 2% 琼脂）上，如图 2G所示。将平板在 30 °C 下培养 48 小时。
    注意：也可使用影印平板法将菌落转移至双缺失培养基上。本研究中，在定量 SK1AM 菌株的交配效率时使用色氨酸和亮氨酸缺失培养基（trp− leu−），而在定量 ScAM 菌株时使用色氨酸和尿嘧啶缺失培养基（trp− ura−）。只有二倍体菌落能够在双缺失培养基上生长，因为它们同时含有两种营养缺陷型标记：SK1AM 菌株中的 TRP1 和 LEU2 基因，以及 ScAM 菌株中的 TRP1 和 URA3 基因。
  2. 此外，将菌落划线或影印至单缺失培养基（trp− 或 leu− 或 ura−）上，以定量群体中两种单倍体各自的频率。
  3. 按以下方式计算交配效率 η：
    单倍体交配效率公式：η = （发生交配的单倍体数量 / 单倍体总数）    公式 (1)
    其中，发生交配的单倍体数量等于在双缺失平板上鉴定出的二倍体数量的两倍（因为每个二倍体由两个单倍体交配形成）。单倍体总数等于划线的单倍体数量加上划线的二倍体数量的两倍。
    注意：例如，若将 100 个菌落划线或影印至双缺失培养基后仅有 60 个菌落生长，则交配效率可定量为 75%（因为 60 个二倍体由 60 × 2 = 120 个单倍体交配形成，另有 40 个单倍体未发生交配）。

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结果

两种交配类型交配效率的定量分析
本实验方案用于定量分析两种酵母菌株之间的交配效率，即 SK1AMa 与 SK1AMα 之间，以及 ScAMa 与 ScAMα 之间的交配效率（图3A）。在这些实验中，两种单倍体之间的交配至少重复了12次。每次实验重复中，至少将100个菌落划线接种于双缺培养基上。该实验方案具有良好的稳健性，能够清晰区分 SK1AM 与 ScAM 两种菌株之间的交配效率差异。SK1菌株表现出极高的交配效率，而 ScAM 菌株的交配效率相对较低（图3A）。这一结果或许并不意外，因为 ScAM 菌株来源于 S. cerevisiae 与 S. carlsbergensis 菌株之间的杂交交配35。

...

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讨论

S. cerevisiae 的交配效率量化对于开展与交配通路相关基因的研究，或探讨外界环境对交配行为影响的研究至关重要。在过去二十年中，S. cerevisiae 也成为研究物种形成相关问题的常用模式生物14,36,37,38。由于其具有两种交配型，且在实验室环境中易于进行遗传操作和培养，使其成为实时研究生殖隔离屏障进化的理想生物。交配效率的量化至关重要，因为它能够衡量合子前生殖隔离屏障的程度。因此，需要一种简便且高度可重复的实验方案。

利用上述方案，量化了两种表现出完全不同交配行为的菌株的交配效率。因此，该方案可适用于任何菌株，因为大多数实验室酵母菌株均携带可用于筛选的营养缺陷型标记。39. 然而，使用本方案时需注意几个重要事项。初始YPD培养...

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披露

作者声明本研究不存在任何利益冲突。作者愿意为所有非营利性用途提供SK1衍生菌株。

致谢

本工作由 DBT/Wellcome Trust（印度联盟）基金（IA/S/19/2/504632）资助，授予 S.S.。P.N. 是由 DBT/Wellcome Trust（印度联盟）基金（IA/S/19/2/504632）支持的研究员。A.M. 受印度政府科学与工业研究委员会（CSIR）资助，为高级研究员（09/087(0873)/2017-EMR-I）。作者感谢 Paike Jayadeva Bhat 的讨论与建议。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
腺嘌呤Sigma Life ScienceA8626
细菌学用普通级琼脂粉SRL19661 (0140186)
硫酸铵，Hi-ARHiMediaGRM1273
D-(+)-葡萄糖Sigma Life ScienceG8270
玻璃培养皿HiMediaPW008 90 mm x 15 mm 尺寸
L-精氨酸Sigma Life ScienceA8094
L-天冬氨酸Sigma Life ScienceA7219
L-组氨酸单盐酸一水合物Sigma Life ScienceH5659
L-异亮氨酸Sigma AldrichI2752
L-亮氨酸Sigma Life ScienceL8912
L-赖氨酸Aldrich62840
L-甲硫氨酸Sigma Life ScienceM5308
L-苯丙氨酸Sigma Life ScienceP5482
L-苏氨酸Sigma AldrichT8625
L-酪氨酸Sigma Life ScienceT8566
L-缬氨酸Sigma Life ScienceV0513
交配效率网格在培养皿上绘制的 1 cm x 1.5 cm 矩形网格
微量离心管Tarsons500010
蛋白胨HiMediaRM001
尿嘧啶Sigma Life ScienceU0750
酵母提取物粉末HiMediaRM027
不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮源基础培养基BD Difco233520

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单倍体交配酵母物种形成营养缺陷型标记YPD 琼脂二倍体鉴定光密度基因流生殖隔离
Saccharomyces cerevisiae 单倍体交配效率的测定
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