酿酒酵母中单倍体交配效率的测定

摘要

在这项工作中，描述了一种定量酿 酒 酵母交配效率的稳健方法。该方法对于物种形成研究中合子前屏障的定量特别有用。

摘要

酿酒酵母 是遗传学、进化和分子生物学中广泛使用的模式生物。近年来，它也成为研究物种形成相关问题的流行模式生物。酵母的生命周期涉及无性和有性生殖阶段。易于进行进化实验和生物体的短生成时间允许研究生殖屏障的进化。两种配接类型（a 和 α）配合形成 a/α 二倍体的效率称为配接效率。单倍体之间交配效率的任何降低都表明存在合子前屏障。因此，为了量化两个单倍体之间的生殖隔离程度，需要一种可靠的方法来量化交配效率。为此，这里提出了一个简单且高度可重复的协议。该方案涉及四个主要步骤，包括修补YPD板上的单倍体，将等数量的单倍体混合，稀释和接种单个菌落，最后，根据脱落板上的菌落数量计算效率。使用营养标记来清楚地区分单倍体和二倍体。

引言

酿酒酵母，通常称为出芽酵母，是一种单细胞真核生物。它有两种交配类型， a 和 α， 并表现出无性和有性生殖周期。 a 和 α 交配类型是单倍体，可以在周围环境中没有其他交配类型的情况下进行有丝分裂，这代表了酵母的无性循环。当两种交配类型非常接近时，它们停止有丝分裂并融合形成二倍体细胞。二倍体酵母可以在营养物质存在时有丝分裂，也可以在存在不可发酵的不良碳源（例如乙酸盐¹）的情况下在氮饥饿的条件下进行减数分裂。这导致孢子的形成，孢子保持休眠状态，直到有有利的生长条件。当这些孢子萌发并且两种单倍体类型被释放回单倍体池^2，3 时，生命周期就完成了（图1）。

酵母细胞的交配包括几个步骤，例如凝集，形成交配投影或"shmoo"，然后是细胞和核融合^4，5。两种配接类型 a 和 α分别产生 a<....

方案

注意:该协议广泛涉及以下步骤:（1）在YPD板上修补交配效率网格中的单倍体，（2）孵育24小时后将等数量的单倍体混合，并给混合单倍体几个小时的交配时间（本研究中为7小时），（3）将混合细胞接种在YPD上，以便在30°C下7小时后分离单个菌落， 最后，（4）确定使用营养不足标记物形成的二倍体的数量。下面将详细讨论这些步骤（另请参阅 图 2）。

1. 拼接效率网格中的单倍体

1. 通过在YPD琼脂平板（2%琼脂，2%葡萄糖，1%蛋白胨，0.5%酵母提取物）上划线，从冷冻储液中恢复单倍体 a 和α ，并让它们在30°C下生长48小时以获得分离的单菌落。
2. 将YPD板中的单个菌落接种在5mL YPD培养基（2%葡萄糖，1%蛋白胨，0.5%酵母提取物）中，并在30°C下以250rpm振荡孵育48小时。在此孵育期之后，细胞处于生长的固定阶段。
3. 在新鲜的YPD板上绘制配接效率网格。将网格绘制为一个 1 cm x 1.5 cm 的矩形，分为三个框，每个框的尺寸为 1 cm x 0.5 cm，如图 2A 所示。
4. 最左侧和最右侧矩形上两种配对类型的 YPD 培养物的补丁 5 μL（

结果

两种插拔类型配接效率的量化
此处描述的方案用于量化两种酵母菌株之间的交配效率 - SK1AM a 和 SK1AMα 之间以及 ScAMa 和 ScAMα 之间的交配效率（图 3A）。在这些实验中，两个单倍体之间的交配重复至少12次。在实验的每个重复中，至少有100个菌落在双脱落培养基上划线。该方案的稳健性使得SK1AM和ScAM两种菌株之间的交配效率变得容易。虽然SK1菌株以非常高的效率配接，但ScAM菌株的配接效率相对较低（图3A）。这也许并不奇怪，因为ScAM菌株起源于酿酒酵母和S. carlsbergensis菌株之间的杂交交配³⁵。

除了区分菌株之间的交配效率外，该方法还可用于量化不同环境下菌株交配效.......

讨论

酿酒酵母交配效率的量化对于开展与交配途径相关基因相关的研究或研究外部环境对交配行为的影响至关重要。在过去的二十年中，酿酒酵母也已成为解决与物种形成¹⁴，^36，37，38相关的问题的流行模型。两种交配类型的存在以及在实验室环境中易于进行遗传操作和维护，使其成为实时研究生殖屏障进化的合适生物体。交配效率的量化至关重要，因为它可以衡量合子前生殖屏障。因此，需要一种具有高重现性的便捷方案。

使用上述协议，量化了表现出完全不同的交配行为的两种不同菌株的交配效率。因此，该方案可以应用于任何菌株，因为大多数实验室酵母菌株都带有可用于选择³⁹的营养。但是，使用此协议时有一些重要的注意事项。初始YPD培养物到达固定相所需的时间取决于菌株。生长缓慢的菌株可能需要在3.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
腺嘌呤	Sigma Life Science	A8626
琼脂粉 常规级细菌学	SRL	19661 （0140186）硫酸
铵，Hi-AR	HiMedia	GRM1273
D-（+）-葡萄糖	Sigma Life Science	G8270
玻璃培养皿	HiMedia	PW008	尺寸为 90 mm x 15 mm
的 L-精氨酸	Sigma 生命科学	A8094
L-天冬氨酸	Sigma 生命科学	A7219
L-一氯化组氨酸	Sigma 生命科学	H5659
L-异亮氨酸	Sigma Aldrich	I2752
L-亮氨酸	Sigma 生命科学	L8912
L-赖氨酸	Aldrich	62840
L-蛋氨酸	Sigma 生命科学	M5308
L-苯丙氨酸	Sigma 生命科学	P5482
L-苏氨酸	Sigma Aldrich	T8625
L-酪氨酸	Sigma 生命科学	T8566
L-缬氨酸	Sigma 生命科学	V0513
交配效率网格			1 cm x 1.5 cm 在培养皿板上绘制的矩形网格
微量离心管	Tarsons	500010
蛋白胨	HiMedia	RM001
尿嘧啶	Sigma 生命科学	U0750
酵母提取物粉末	HiMedia	RM027
酵母氮基，不含氨基酸和硫酸	铵BD 迪夫科	233520