Saccharomyces cerevisiae 单倍体交配效率的测定

摘要

本研究描述了一种用于定量酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）交配效率的可靠方法。该方法在物种形成研究中对合子前隔离屏障的定量分析尤为有用。

摘要

Saccharomyces cerevisiae 是遗传学、进化和分子生物学研究中广泛使用的模式生物。近年来，它也成为研究物种形成相关问题的热门模式生物。酵母的生活周期包括无性和有性两种繁殖阶段。由于进化实验操作简便且世代时间短，该生物可用于研究生殖隔离屏障的进化过程。两种交配型（a 和 α）结合形成 a/α 二倍体的效率被称为交配效率。单倍体之间交配效率的任何下降均表明存在合子前隔离屏障。因此，为了量化两个单倍体之间生殖隔离的程度，需要一种可靠的交配效率定量方法。为此，本文介绍了一种简单且高度可重复的实验方案。该方案包括四个主要步骤：将单倍体菌株点种在 YPD 平板上，等量混合两种单倍体细胞，梯度稀释后涂布以获得单菌落，最后根据缺失培养基平板上的菌落数量计算交配效率。实验中使用营养缺陷型标记以明确区分单倍体与二倍体。

引言

Saccharomyces cerevisiae（通常称为芽殖酵母）是一种单细胞真核生物。它具有两种交配型：a 和 α，并表现出无性和有性两种生殖周期。a 和 α 交配型均为单倍体，在周围环境中不存在另一种交配型时，可通过有丝分裂进行增殖，此过程代表酵母的无性生殖周期。当两种交配型彼此靠近时，它们将停止有丝分裂，并融合形成一个二倍体细胞。当营养充足时，二倍体酵母可通过有丝分裂进行增殖；而在氮源缺乏且存在非发酵性贫碳源（如乙酸盐）的条件下，则会启动减数分裂¹。这一过程导致孢子的形成，孢子将保持休眠状态，直至出现适宜的生长条件。当这些孢子萌发并释放出两种单倍体细胞回到单倍体群体中时，其生命周期即告完成^2,3（图1）。

酵母细胞的交配过程包括多个步骤，例如凝集、交配突起（“shmoos”）的形成，随后是细胞融合和核融合^4,5。两种交配型....

方案

注意：该实验方案主要包括以下步骤：（1）将单倍体细胞点种到 YPD 平板的交配效率网格中，（2）在 30 °C 培养 24 小时后，将单倍体细胞等量混合，并让混合后的单倍体细胞进行数小时的交配（本研究中为 7 小时），（3）将混合后的细胞在 30 °C 培养 7 小时后涂布于 YPD 平板上，以分离单菌落，最后（4）利用营养缺陷型标记确定所形成的二倍体细胞数量。以下将详细讨论这些步骤（另见图 2）。

1. 在交配效率网格中对单倍体进行点种

1. 从冻存菌种中复苏单倍体a和α，在YPD琼脂平板（2%琼脂，2%葡萄糖，1%蛋白胨，0.5%酵母提取物）上划线，于30 °C培养48小时，以获得分离的单菌落。
2. 从YPD平板上挑取单菌落接种于5 mL YPD液体培养基（2%葡萄糖，1%蛋白胨，0.5%酵母提取物）中，于30 °C、250 rpm振荡培养48小时。此培养阶段结束后，细胞处于生长的稳定期。
3. 在新的YPD平板上绘制交配效率网格。将网格画成一个1 cm × 1.5 cm的矩形，均分为三个小格，每格尺寸为1 cm × 0.5 cm，如图2A所示。
4. 取两种交配类型的YPD培养物各5 µL，....

结果

两种交配类型交配效率的定量分析
本实验方案用于定量分析两种酵母菌株之间的交配效率，即 SK1AMa 与 SK1AMα 之间，以及 ScAMa 与 ScAMα 之间的交配效率（图3A）。在这些实验中，两种单倍体之间的交配至少重复了12次。每次实验重复中，至少将100个菌落划线接种于双缺培养基上。该实验方案具有良好的稳健性，能够清晰区分 SK1AM 与 ScAM 两种菌株之间的交配效率差异。SK1菌株表现出极高的交配效率，而 ScAM 菌株的交配效率相对较低（图3A）。这一结果或许并不意外，因为 ScAM 菌株来源于 S. cerevisiae 与 S. carlsbergensis 菌株之间的杂交交配³⁵。

.......

讨论

S. cerevisiae 的交配效率量化对于开展与交配通路相关基因的研究，或探讨外界环境对交配行为影响的研究至关重要。在过去二十年中，S. cerevisiae 也成为研究物种形成相关问题的常用模式生物^14,36,37,38。由于其具有两种交配型，且在实验室环境中易于进行遗传操作和培养，使其成为实时研究生殖隔离屏障进化的理想生物。交配效率的量化至关重要，因为它能够衡量合子前生殖隔离屏障的程度。因此，需要一种简便且高度可重复的实验方案。

利用上述方案，量化了两种表现出完全不同交配行为的菌株的交配效率。因此，该方案可适用于任何菌株，因为大多数实验室酵母菌株均携带可用于筛选的营养缺陷型标记。³⁹. 然而，使用本方案时需注意几个重要事项。初始YPD培养.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
腺嘌呤	Sigma Life Science	A8626
细菌学用普通级琼脂粉	SRL	19661 (0140186)
硫酸铵，Hi-AR	HiMedia	GRM1273
D-(+)-葡萄糖	Sigma Life Science	G8270
玻璃培养皿	HiMedia	PW008	90 mm x 15 mm 尺寸
L-精氨酸	Sigma Life Science	A8094
L-天冬氨酸	Sigma Life Science	A7219
L-组氨酸单盐酸一水合物	Sigma Life Science	H5659
L-异亮氨酸	Sigma Aldrich	I2752
L-亮氨酸	Sigma Life Science	L8912
L-赖氨酸	Aldrich	62840
L-甲硫氨酸	Sigma Life Science	M5308
L-苯丙氨酸	Sigma Life Science	P5482
L-苏氨酸	Sigma Aldrich	T8625
L-酪氨酸	Sigma Life Science	T8566
L-缬氨酸	Sigma Life Science	V0513
交配效率网格			在培养皿上绘制的 1 cm x 1.5 cm 矩形网格
微量离心管	Tarsons	500010
蛋白胨	HiMedia	RM001
尿嘧啶	Sigma Life Science	U0750
酵母提取物粉末	HiMedia	RM027
不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮源基础培养基	BD Difco	233520