方法文章

从新生小鼠肩胛间脂肪组织基质血管组分中分化与成像棕色脂肪细胞

DOI：

10.3791/64604

⸱

2023年2月3日

 ,  ,  , 
1Department of Nutrition, Diabetes and Metabolism, Pontificia Universidad Católica de Chile

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

前脂肪细胞从小鼠肩胛间棕色脂肪组织的基质血管组分中分离获得，并分化为能够积累脂滴、表达分子标志物并呈现成熟棕色脂肪细胞线粒体形态的细胞。这些细胞进一步通过免疫荧光和透射电子显微镜进行分析。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

棕色脂肪组织（BAT）仅存在于哺乳动物中，具有产热功能。棕色脂肪细胞的特征是具有多房性细胞质，内含多个脂滴，细胞核位于中央，线粒体含量丰富，并表达解偶联蛋白1（UCP1）。由于棕色脂肪组织能够将代谢能量以热量形式耗散，因此被认为可能是治疗肥胖及其相关代谢性疾病的一个潜在靶点。为了研究棕色脂肪组织的功能与调控机制，体外培养棕色脂肪细胞至关重要。本实验方案优化了组织处理和细胞分化步骤，用于培养新生小鼠的棕色脂肪细胞。此外，还展示了利用共聚焦免疫荧光显微镜和透射电子显微镜对分化后的脂肪细胞进行成像的操作流程。采用本方案所述技术所分化得到的棕色脂肪细胞保留了经典棕色脂肪组织的主要特征，包括高水平的UCP1表达、增加的线粒体数量，以及脂滴与线粒体之间极为紧密的物理接触，这使得该方法成为棕色脂肪组织研究中的有力工具。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

白色脂肪组织与棕色脂肪组织在解剖位置、细胞起源、功能、形态以及总质量上均存在差异。白色脂肪组织（WAT）是机体主要的生理能量储存库，其高度特化的细胞内含有一个巨大的脂滴，占据细胞体积的大部分，并大量储存三酰甘油（TAG）1。TAG 的脂解作用释放出游离脂肪酸，这些脂肪酸进入体循环，以满足禁食或其他负能量平衡状态下的能量需求。此外，WAT 分泌多种蛋白质和脂质产物，分别称为脂肪因子（adipokines）和脂因子（lipokines），具有调节代谢、免疫和生殖功能的作用，因此 WAT 是人体最大的内分泌组织2。

棕色脂肪组织（BAT）是一种体积较小的器官，其主要生理功能是通过非寒战性产热防止体温过低。在小鼠和新生儿中，BAT 是一个解剖位置明确的器官，位于肩胛间区。成年人缺乏肩胛间棕色脂肪组织（iBAT）；然而，其体内可形成成簇的类棕色脂肪细胞，这些细胞分布于以白色脂肪组织（WAT）为主的脂肪储存部位中。这些 "棕色化白色脂肪" （米色）脂肪细胞在形态学和分子特征上与经典的棕色脂肪组织（iBAT）脂肪细胞相似，但其细胞来源不同3,4.

与白色脂肪细胞不同，棕色脂肪细胞具有多个较小的脂滴和丰富的线粒体5。解偶联蛋白1（UCP1，也称为产热素）特异性表达于棕色脂肪细胞和米色脂肪细胞中，可介导线粒体内膜（IMM）中的质子泄漏，从而解除电子传递与ATP合成之间的偶联，产生热量。棕色脂肪组织（BAT）中的非颤抖性产热由去甲肾上腺素（NE）激活，NE由棕色脂肪组织中的交感神经末梢在寒冷刺激下释放6。NE与棕色脂肪细胞表面的β-肾上腺素能受体（主要是β3受体）结合，触发细胞内cAMP介导的信号级联反应。这导致三酰甘油（TAG）的脂解、线粒体脂肪酸的β-氧化，并在UCP1激活后产生热量3。棕色脂肪细胞中脂滴与线粒体之间密切的功能关系也具有结构上的对应特征，例如这些细胞器在较大区域存在非常紧密的物理接触7,8。

棕色脂肪组织（iBAT）含有丰富的血管和交感神经末梢9。这些结构与前脂肪细胞、免疫细胞、成纤维细胞以及细胞外基质分子共同构成脂肪组织的基质血管组分（stromal vascular fraction, SVF）10。已有多种实验方案被报道用于从前脂肪细胞诱导生成成熟脂肪细胞11,12,13,14,15（补充表1）；然而，这些方法在组织处理过程及分化培养基的组成上存在极大差异。本文所述方案可实现棕色脂肪细胞高效且可重复的分化，所得细胞具有以下特征：（1）表达关键的脂肪生成转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）和CCAAT/增强子结合蛋白α（C/EBPα）；（2）表达成熟脂肪细胞标志物perilipin1（PLIN1）和簇分化抗原36（CD36）；（3）积累大量脂滴；（4）线粒体含量丰富，且氧化磷酸化复合物（OXPHOS）高度表达；（5）具有产热潜能，表现为解偶联蛋白1（UCP1）高水平表达；（6）呈现与成熟棕色脂肪细胞表型相关的线粒体形态学改变。该方法可用于研究全身性脂肪营养不良症的分子机制15,16,17。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

动物实验程序已获得智利天主教大学机构动物护理与使用委员会的批准。本研究使用来自C57BL/6J和129J品系混合背景的出生0.5天（P0.5）的新生小鼠，雌雄均有。

1. 组织提取

  1. 使用70%乙醇溶液清洁并消毒工作台，并使用无菌外科材料。
  2. 根据机构批准的方案，使用手术剪对出生后0.5天的新生幼鼠进行断头处死。
  3. 将小鼠置于俯卧位（面部朝下），用锋利的剪刀在其背部中段皮肤做一条长约1 cm的切口，小心剥离皮肤。
    注意：此步骤至关重要，因为若皮肤未充分去除，可能撕裂并损伤肩胛间棕色脂肪组织（iBAT），从而影响基质血管组分（SVF）的优化制备。
  4. 使用小型剪刀将iBAT从尸体上外科分离。
    ​注意：iBAT表现为两个可独立移除的脂肪叶状结构。
  5. 使用带弯曲尖端的镊子分别夹取并收获两个iBAT叶。
  6. 将两个叶置于含有1.5 mL室温无菌PBS的塑料管中。在完成所有所需幼鼠的组织提取前，保持各组织分别存放于独立管中。

2. 组织消化

  1. 在生物安全柜中，将 300 µL 胶原酶 II 型消化缓冲液（含 0.2% II 型胶原酶的缓冲液 [25 mM KHCO3、1.2 mM MgSO4、120 mM NaCl、5 mM 葡萄糖、12 mM KH2PO4、4.8 mM KCl、1.2 mM CaCl2、2.5% BSA 和 1% 青霉素/链霉素，pH 7.4]）分装至 1.5 mL 离心管中（表 1）。
    注意：根据需提取的独立组织数量准备足够数量的离心管。本研究中使用了七支离心管，对应一窝七只幼鼠。
  2. 转移至实验台，将肩胛间棕色脂肪组织（iBAT）叶放入 II 型胶原酶消化缓冲液中，以降解细胞外基质。
  3. 将 iBAT 组织在 37 °C 条件下孵育 45 分钟，同时以 800 rpm 持续轻柔振荡（图 1）。

3. 组织处理

注意：消化后，所有后续步骤均须在 II 级层流生物安全柜中进行。

  1. 为每个样品准备并标记两组1.5 mL塑料离心管。
  2. 使用P1,000移液器和滤芯吸头，通过反复吹打，机械破坏胶原酶II消化缓冲液中的组织悬液。每个样品使用新的吸头。
    注意：此步骤至关重要。务必使用吸头进行机械性组织解离，并反复吹打直至肉眼观察下达到完全均质化。
  3. 将解离后的组织分别通过100 µm细胞筛（参见材料表），滤入新的1.5 mL离心管中。
  4. 向过滤后的组织样品中加入500 µL ACK缓冲液（参见材料表），将离心管颠倒4–5次，室温孵育4分钟。
    注意：孵育时间不得超过，以免损伤目标细胞。
  5. 将组织样品在室温下以300 x g离心5分钟。
  6. 通过倒置离心管弃去上清液，并将沉淀重悬于1 mL培养基（DMEM-F12，含10% FBS、1%抗生素-抗真菌剂，pH 7.2）中（参见材料表）。
  7. 使用P1,000移液器和滤芯吸头，将悬液通过40 µm细胞筛滤入新的1.5 mL离心管中。
  8. 将样品在室温下以300 x g离心5分钟。
    注意：沉淀物即为含前脂肪细胞的基质血管组分（SVF）。
  9. 通过倒置离心管弃去上清液，并用移液器将沉淀重悬于1 mL培养基中。
  10. 为每个样品准备一个15 mL离心管，加入5 mL培养基。
  11. 将每个重悬的沉淀物加入对应含有5 mL培养基的15 mL离心管中，颠倒混匀4–5次，使细胞充分混合。
  12. 将每个样品的悬液接种至24孔培养板的六个孔中，每孔加入1 mL悬液（图1）。

4. 基质血管组分（SVF）培养

  1. 每隔一天更换一次培养基，直至细胞达到100%融合度。
    注意：在此期间，非贴壁细胞将被去除，从而获得富含含前脂肪细胞的基质血管组分（SVF）的原代培养物。
  2. 当细胞达到100%融合时，移除培养基，并用800 µL无菌PBS洗涤细胞。
  3. 向每个孔中加入150 µL 0.25%胰蛋白酶-EDTA（参见材料表），并将培养板放入培养箱中孵育3分钟，以使细胞脱落。
    注意：使用相差显微镜确认细胞是否已脱落。
  4. 通过向每孔加入850 µL培养基以终止胰蛋白酶的消化作用。
  5. 收集第3.12步接种的六个孔中的细胞，并转移至一个15 mL离心管中。
  6. 加入6 mL培养基，使总体积达到12 mL，轻轻倒置混匀4–5次。
  7. 将1 mL细胞悬液接种至12孔板的每个孔中。每隔一天更换培养基，直至细胞达到融合状态。
  8. 当细胞达到100%融合时，按照与步骤4.3相同的孵育条件，使用150 µL 0.25%胰蛋白酶-EDTA使细胞脱落，并根据实验所需孔的表面积进行接种。
  9. 在按照步骤8固定细胞后，进行高分辨率成像。
    注意：建议后续实验采用35,000个细胞/cm²的接种密度（用于蛋白质和总RNA提取：330,000个细胞[6孔板中的1个孔]；免疫荧光[IF]：10,500个细胞[96孔板中的1个孔]）。

5. 脂肪向分化

  1. 将细胞在诱导培养基（DMEM-F12，含10% FBS、1% 抗生素-抗真菌剂，pH 7.2，添加500 nM 地塞米松、125 nM 吲哚美辛、0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 [IBMX]、5 µM 罗格列酮、1 nM T3 和 20 nM 胰岛素）（表1）中孵育72小时（第0天至第2天）（图2）。
    注意：培养基必须每隔一天更换一次；因此，首次换液应在初始诱导后的第2天进行。
  2. 在第3天更换为维持培养基（DMEM-F12，含10% FBS、1% 抗生素-抗真菌剂，pH 7.2，添加5 µM 罗格列酮、1 nM T3 和 20 nM 胰岛素）（表1），并持续使用该维持培养基至第7天（图2）。
    ​注意：应在第5天和第7天更换维持培养基。通过相差显微镜可在分化第3天观察到小脂滴；在分化第7天可明显看到大脂滴。分化过程超过7天会导致细胞因脱落而丢失，可能是由于富含脂质的细胞浮力较高所致。

6. 细胞匀浆制备

  1. 在分化第0天和第7天移除培养基，并用无菌PBS洗涤细胞3次。
  2. 最后一次清洗后，向每个孔中加入1.3 mL无菌PBS。
    注意：在完成最后一块板的清洗前，需将细胞保持在冰上。
  3. 使用细胞刮从一个6孔板的单孔中机械收集细胞（约330,000个细胞），并将细胞悬液转移至1.5 mL离心管中。
  4. 在4 °C条件下，以2,800 × g离心5分钟。
  5. 用移液器移除PBS，并将离心管保持在冰上。
  6. 用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液（参见材料表）重悬细胞沉淀，冰上孵育30分钟。
    注意：裂解细胞沉淀时，70–80 µL已足够。
  7. 在4 °C条件下，以21,000 × g离心15分钟。
  8. 小心将上清液转移至新的1.5 mL离心管中，弃去沉淀。
    注意：上清液即为细胞匀浆液。
  9. 使用二喹啉甲酸（BCA）法测定细胞匀浆液的蛋白浓度，用于总蛋白的比色检测与定量18,19。

7. 蛋白质印迹

  1. 取30 µg细胞匀浆液（来自步骤6.8），加入市售的SDS-PAGE上样缓冲液（参见材料表）。
  2. 根据各蛋白质的分子量，在聚丙烯酰胺凝胶电泳-SDS20（PAGE-SDS）中进行分离。
    注意：PPARγ、C/EBPα、PLIN1、CD36和UCP1使用10% PAGE-SDS，OXPHOS使用12% PAGE-SDS，TOM20使用15% PAGE-SDS（参见材料表）。
  3. 在350 mA电流下，将蛋白质电转至PVDF膜（参见材料表）上，持续2小时。
    注意：冰浴容器需在1小时后更换。整个过程中需将转膜装置置于冰上。
  4. 根据抗体说明书推荐，使用含5% BSA或脱脂奶粉的Tris缓冲盐水（TBS）含0.1% Tween 20（TBS-T）溶液封闭膜，封闭时间为2小时。
  5. 在4 °C条件下，用一抗（本研究中所用抗体详见材料表）孵育过夜。
    注意：本研究中所有抗体均以封闭液按1:1,000比例稀释。
  6. 用0.1% TBS-T洗涤膜3次，随后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（参见材料表），室温孵育2小时。
  7. 用0.1% TBS-T洗涤膜3次，再用1× TBS进行最后一次洗涤。将膜保存于1× TBS中直至显影。建议保存时间不超过1小时。
  8. 通过化学发光法20或其他偏好的方法对膜进行显影。

8. 高分辨率成像

  1. 按照以下步骤进行免疫荧光实验。
    1. 将来自 P0.5 新生小鼠的原代棕色前脂肪细胞培养物（按照步骤 4.8）接种并在含光学底的 96 孔板中进行分化（参见材料表）。
    2. 在分化第 0 天和第 7 天，用 4% 多聚甲醛固定细胞 20 分钟，并用无菌 PBS 洗涤 3 次。
    3. 用 0.1% Triton X-100 透化细胞 15 分钟，然后在室温下用 3% 鱼明胶（参见材料表）封闭 1 小时。
    4. 用无菌 PBS 洗涤 3 次，随后在湿盒中加入 PLIN1 抗体（1:400，参见材料表），溶于 1% BSA/PBS 中，4 °C 过夜孵育。
    5. 用无菌 PBS 洗涤 3 次，然后加入荧光标记的二抗（1:1,000，溶于 1% BSA/PBS）（参见材料表），室温孵育 1 小时。
    6. 用 1 µg/mL Hoechst 33342 对细胞核染色，同时用 1 µg/mL BODIPY 对脂滴染色，室温孵育 30 分钟。
      注：使用细胞成像系统采集荧光图像（参见材料表）。每个孔采集 9 或 16 张图像，使用两到三个通道，放大倍数为 20x。
  2. 按照以下步骤进行透射电子显微镜观察。
    1. 在 35 mm × 10 mm 细胞培养皿中培养并分化棕色前脂肪细胞。
    2. 在分化第 0 天和第 7 天，移除培养基，并用含 2.5% 戊二醛的 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.0）固定细胞 1 小时（参见材料表）。
    3. 用 0.05 M 二甲胂酸钠缓冲液洗涤细胞 3 次，每次 10 分钟，然后用 1% 水溶液四氧化锇（参见材料表）处理 15 分钟。
    4. 用双蒸水洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟，然后用 1% 水溶液醋酸铀（参见材料表）处理 15 分钟。
    5. 依次使用 30%、50%、70%、95% 和 100% 的乙醇梯度溶液进行脱水，每次 5 分钟。
    6. 先用 1:1 的环氧树脂（epon）/乙醇溶液预包埋 30 分钟，再用纯环氧树脂包埋 1 小时（参见材料表）。
      注：将新鲜的环氧树脂加入培养皿中，直接覆盖整个细胞单层以完成包埋。将样品置于 60 °C 烤箱中聚合 24 小时。
    7. 将细胞培养皿浸入液氮中 2 分钟，然后用钳子敲击使其破裂，从而松动塑料包埋块。
    8. 将带有细胞的包埋块片段粘附至树脂块上，以便在超薄切片机中（参见材料表）获得平行于表面的精细切片（厚度 80 nm）。
    9. 根据 Reynolds 等人的方法21，用 1% 水溶液醋酸铀染色 4 分钟，再用柠檬酸铅染色 5 分钟。
    10. 在电子显微镜下观察载网（参见材料表）。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脂肪生成受到一个转录因子网络的调控，这些转录因子不仅负责调控诱导棕色脂肪细胞形成和功能的关键蛋白的表达22，包括经典的脂肪生成调控因子如PPARγ和C/EBPα23,24,25，还调控成熟脂肪细胞的标志物26,27。通过测试不同浓度的罗格列酮以获得产热型棕色脂肪表型，本文所述方法可实现从出生0.5天（P0.5）小鼠肩胛间棕色脂肪组织（iBAT）的基质血管组分（SVF）中分离出的前脂肪细胞向成熟棕色脂肪细胞的分化。在诱导和维持培养基中添加5 µM罗格列酮，与较低浓度的该PPARγ激动剂（1 nM）相比，在分化第7天显著提高了脂肪生成调控因子及UCP1的蛋白水平（图3）。未分化的前脂肪细胞（第0天）中PPARγ、C/EBPα、PLIN...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案是一种简单且可重复的两阶段分化流程（图2），用于生成具有成熟棕色脂肪细胞分子和形态特征的细胞。iBAT的手术采集是第一个关键步骤，因为组织撕裂会严重限制起始材料的存活率。组织处理同样至关重要，因为无碎片的均一细胞悬液可显著提高可培养的基质血管组分（SVF）的产量。在本研究中，使用100 µm和40 µm细胞筛网进行两次过滤，而其他方案通常仅使用100 µm细胞筛网11,12,13,14。

对于基质血管组分（SVF）培养，进行了两轮传代以扩增可用于实验的细胞数量。该标准化操作有助于提高SVF分化结果的可重复性。相比之下，另一项已发表的方案12建议在新生小鼠数量有限的情况下采用可变的传代次数。这种做法并不推荐，因为细胞的...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

VC 获得了 FONDECYT（1181214 和 1221146）以及 Anillos（ACT210039）的资助，AMF 获得了 ANID 博士奖学金 21171743，FS 获得了 ANID 博士奖学金 21150665。我们感谢 Alejandro Munizaga 在样品处理以及透射电子显微镜技术方面的指导与帮助。插图使用 BioRender 制作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10x Tris/甘氨酸缓冲液BioRad1610734
16% 甲醛水溶液Electron Microscopy Sciences15710
35 mm 细胞培养处理型易握式培养皿Falcon353001
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）Calbiochem410957
40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液，37.5:1BioRad1610148
6孔板 SPL Life Science -
96孔光学黑色带盖无菌细胞培养板Thermo Scientific165305
AccuRuler RGB Plus 预染蛋白Marker Maestrogen02102-250
ACK裂解缓冲液 GibcoA10492-01
过硫酸铵 BioRad1610700
抗生素-抗真菌剂Gibco 15240062
抗小鼠IgG HRP标记抗体Cell Signaling7076
抗兔IgG HRP标记抗体  Cell Signaling7074
印迹级封闭剂 BioRad170-6404
BODIPY 493/503 InvitrogenD3922
BSASigmaA1470
C/EBPα 抗体Cell Signaling2295
CaCl2Calbiochem 208291
CD36抗体InvitrogenPA1-16813
细胞筛，100 µm，尼龙Falcon352360
细胞筛，40 µm，尼龙Falcon352340
II型胶原酶Gibco17101-015
Cytation 5 细胞成像多功能读板仪Biotek
地塞米松 SigmaD4902
DMEM/F-12，粉末Gibco12500062
EMBed-812 包埋试剂盒（Epon）Electron Microscopy Sciences14120
无水乙醇Merck 100983 
胎牛血清 Gibco16000-044
冷水鱼皮明胶SigmaG7041
葡萄糖Gibco 15023-021
25% 戊二醛水溶液Electron Microscopy Sciences16210
山羊抗兔IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11012
Halt 磷酸酶抑制剂混合液（100X） Thermo Scientific78427
Halt 蛋白酶抑制剂混合液（100X） Thermo Scientific78429
Hoechst 33258InvitrogenH1398
Immun-Blot PVDF膜 BioRad1620177
吲哚美辛 Sigma I7378 
胰岛素 SigmaI3536
KClCalbiochem 529552
KH2PO4Calbiochem529568
KHCO3Sigma60339
Lane Marker 还原型上样缓冲液 Thermo Scientific39000
MgSO4SigmaM2643
无菌MilliQ水 --
Mitoprofile Total OXPHOS Rodent WB 抗体混合液Abcam MS604
NaClMerck 1064041000
OmniPur 10x PBS 液体浓缩液Calbiochem6505-OP
四氧化锇 Electron Microscopy Sciences19100
Perilipin 1 抗体Cell Signaling9349
PPARγ (81B8) 抗体Cell Signaling2443
RIPA裂解缓冲液 Thermo Scientific89901
罗格列酮Merck557366
碳酸氢钠 SigmaS5761
醋酸钠缓冲液Electron Microscopy Sciences12300
十二烷基硫酸钠 BioRad1610301
T3SigmaT6397
Talos F200C G2Thermo Scientific
TEMED BioRad1610800
TOM20 抗体Cell Signaling42406
Tris缓冲盐水（TBS-10X）Cell Signaling12498
Triton X-100 Sigma93443
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）Gibco25200056
Tween 20，分子生物学级Promega H5152
UCP1 抗体Cell Signaling14670
Ultracut RLeica 
醋酸铀Electron Microscopy Sciences22400
Westar Sun CyanagenXLS063
Westar Supernova CyanagenXLS3

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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