前脂肪细胞从小鼠肩胛间棕色脂肪组织的基质血管组分中分离获得，并分化为能够积累脂滴、表达分子标志物并呈现成熟棕色脂肪细胞线粒体形态的细胞。这些细胞进一步通过免疫荧光和透射电子显微镜进行分析。
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摘要
摘要
棕色脂肪组织（BAT）仅存在于哺乳动物中，具有产热功能。棕色脂肪细胞的特征是具有多房性细胞质，内含多个脂滴，细胞核位于中央，线粒体含量丰富，并表达解偶联蛋白1（UCP1）。由于棕色脂肪组织能够将代谢能量以热量形式耗散，因此被认为可能是治疗肥胖及其相关代谢性疾病的一个潜在靶点。为了研究棕色脂肪组织的功能与调控机制，体外培养棕色脂肪细胞至关重要。本实验方案优化了组织处理和细胞分化步骤，用于培养新生小鼠的棕色脂肪细胞。此外，还展示了利用共聚焦免疫荧光显微镜和透射电子显微镜对分化后的脂肪细胞进行成像的操作流程。采用本方案所述技术所分化得到的棕色脂肪细胞保留了经典棕色脂肪组织的主要特征，包括高水平的UCP1表达、增加的线粒体数量，以及脂滴与线粒体之间极为紧密的物理接触，这使得该方法成为棕色脂肪组织研究中的有力工具。
引言
白色脂肪组织与棕色脂肪组织在解剖位置、细胞起源、功能、形态以及总质量上均存在差异。白色脂肪组织（WAT）是机体主要的生理能量储存库，其高度特化的细胞内含有一个巨大的脂滴，占据细胞体积的大部分，并大量储存三酰甘油（TAG）1。TAG 的脂解作用释放出游离脂肪酸，这些脂肪酸进入体循环，以满足禁食或其他负能量平衡状态下的能量需求。此外，WAT 分泌多种蛋白质和脂质产物，分别称为脂肪因子（adipokines）和脂因子（lipokines），具有调节代谢、免疫和生殖功能的作用，因此 WAT 是人体最大的内分泌组织2。
棕色脂肪组织（BAT）是一种体积较小的器官，其主要生理功能是通过非寒战性产热防止体温过低。在小鼠和新生儿中，BAT 是一个解剖位置明确的器官，位于肩胛间区。成年人缺乏肩胛间棕色脂肪组织（iBAT）；然而，其体内可形成成簇的类棕色脂肪细胞，这些细胞分布于以白色脂肪组织（WAT）为主的脂肪储存部位中。这些 "棕色化白色脂肪" （米色）脂肪细胞在形态学和分子特征上与经典的棕色脂肪组织（iBAT）脂肪细胞相似，但其细胞来源不同3,4.
与白色脂肪细胞不同，棕色脂肪细胞具有多个较小的脂滴和丰富的线粒....
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方案
动物实验程序已获得智利天主教大学机构动物护理与使用委员会的批准。本研究使用来自C57BL/6J和129J品系混合背景的出生0.5天（P0.5）的新生小鼠，雌雄均有。
1. 组织提取
- 使用70%乙醇溶液清洁并消毒工作台，并使用无菌外科材料。
- 根据机构批准的方案，使用手术剪对出生后0.5天的新生幼鼠进行断头处死。
- 将小鼠置于俯卧位（面部朝下），用锋利的剪刀在其背部中段皮肤做一条长约1 cm的切口，小心剥离皮肤。
注意：此步骤至关重要，因为若皮肤未充分去除，可能撕裂并损伤肩胛间棕色脂肪组织（iBAT），从而影响基质血管组分（SVF）的优化制备。 - 使用小型剪刀将iBAT从尸体上外科分离。
注意：iBAT表现为两个可独立移除的脂肪叶状结构。 - 使用带弯曲尖端的镊子分别夹取并收获两个iBAT叶。
- 将两个叶置于含有1.5 mL室温无菌PBS的塑料管中。在完成所有所需幼鼠的组织提取前，保持各组织分别存放于独立管中。
2. 组织消化
- 在生物安全柜中，将 300 µL 胶原酶 II 型消化缓冲液（含 0.2% II 型胶原酶的缓冲液 [25 mM KHCO....
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结果
脂肪生成受到一个转录因子网络的调控，这些转录因子不仅负责诱导棕色脂肪细胞形成和功能的关键蛋白的表达22，包括经典的脂肪生成调控因子如PPARγ和C/EBPα23,24,25，还调控成熟脂肪细胞的标志物26,27。通过测试不同浓度的罗格列酮以获得产热型棕色脂肪表型，本文所述方法可诱导出生后P0.5小鼠肩胛间棕色脂肪组织（iBAT）基质血管组分（SVF）中存在的前体脂肪细胞分化为成熟的棕色脂肪细胞。在诱导和维持培养基中添加5 µM罗格列酮，与较低浓度的该PPARγ激动剂（1 nM）相比，在分化第7天显著提高了脂肪生成调控因子及UCP1的蛋白水平（图3）。未分化的前体脂肪细胞（第0天）中PPARγ、C/EBPα、PLIN1和CD36的蛋.......
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讨论
本方案是一种简单且可重复的两阶段分化流程（图2），用于生成具有成熟棕色脂肪细胞分子和形态特征的细胞。iBAT的手术采集是第一个关键步骤，因为组织撕裂会严重限制起始材料的存活率。组织处理同样至关重要，因为无碎片的均一细胞悬液可显著提高可培养的基质血管组分（SVF）的产量。在本研究中，使用100 µm和40 µm细胞筛网进行两次过滤，而其他方案通常仅使用100 µm细胞筛网11,12,13,14。
对于基质血管组分（SVF）培养，进行了两轮传代以扩增可用于实验的细胞数量。该标准化操作有助于提高SVF分化结果的可重复性。相比之下，另一项已发表的方案12建议在新生小鼠数量有限的情况下采用可变的传代次数。这种做法并不推荐，因为细胞的.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
VC 获得了 FONDECYT（1181214 和 1221146）以及 Anillos（ACT210039）的资助，AMF 获得了 ANID 博士奖学金 21171743，FS 获得了 ANID 博士奖学金 21150665。我们感谢 Alejandro Munizaga 在样品处理以及透射电子显微镜技术方面的指导与帮助。插图使用 BioRender 制作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10x Tris/甘氨酸缓冲液 | BioRad | 1610734 | |
| 16% 甲醛水溶液 | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 35 mm 细胞培养处理型易握式培养皿 | Falcon | 353001 | |
| 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX） | Calbiochem | 410957 | |
| 40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液，37.5:1 | BioRad | 1610148 | |
| 6孔板 | SPL Life Science | - | |
| 96孔光学黑色带盖无菌细胞培养板 | Thermo Scientific | 165305 | |
| AccuRuler RGB Plus 预染蛋白Marker | Maestrogen | 02102-250 | |
| ACK裂解缓冲液 | Gibco | A10492-01 | |
| 过硫酸铵 | BioRad | 1610700 | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Gibco | 15240062 | |
| 抗小鼠IgG HRP标记抗体 | Cell Signaling | 7076 | |
| 抗兔IgG HRP标记抗体 | Cell Signaling | 7074 | |
| 印迹级封闭剂 | BioRad | 170-6404 | |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | |
| BSA | Sigma | A1470 | |
| C/EBPα 抗体 | Cell Signaling | 2295 | |
| CaCl2 | Calbiochem | 208291 | |
| CD36抗体 | Invitrogen | PA1-16813 | |
| 细胞筛，100 µm，尼龙 | Falcon | 352360 | |
| 细胞筛，40 µm，尼龙 | Falcon | 352340 | |
| II型胶原酶 | Gibco | 17101-015 | |
| Cytation 5 细胞成像多功能读板仪 | Biotek | ||
| 地塞米松 | Sigma | D4902 | |
| DMEM/F-12，粉末 | Gibco | 12500062 | |
| EMBed-812 包埋试剂盒（Epon） | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| 无水乙醇 | Merck | 100983 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 16000-044 | |
| 冷水鱼皮明胶 | Sigma | G7041 | |
| 葡萄糖 | Gibco | 15023-021 | |
| 25% 戊二醛水溶液 | Electron Microscopy Sciences | 16210 | |
| 山羊抗兔IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11012 | |
| Halt 磷酸酶抑制剂混合液（100X） | Thermo Scientific | 78427 | |
| Halt 蛋白酶抑制剂混合液（100X） | Thermo Scientific | 78429 | |
| Hoechst 33258 | Invitrogen | H1398 | |
| Immun-Blot PVDF膜 | BioRad | 1620177 | |
| 吲哚美辛 | Sigma | I7378 | |
| 胰岛素 | Sigma | I3536 | |
| KCl | Calbiochem | 529552 | |
| KH2PO4 | Calbiochem | 529568 | |
| KHCO3 | Sigma | 60339 | |
| Lane Marker 还原型上样缓冲液 | Thermo Scientific | 39000 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| 无菌MilliQ水 | - | - | |
| Mitoprofile Total OXPHOS Rodent WB 抗体混合液 | Abcam | MS604 | |
| NaCl | Merck | 1064041000 | |
| OmniPur 10x PBS 液体浓缩液 | Calbiochem | 6505-OP | |
| 四氧化锇 | Electron Microscopy Sciences | 19100 | |
| Perilipin 1 抗体 | Cell Signaling | 9349 | |
| PPARγ (81B8) 抗体 | Cell Signaling | 2443 | |
| RIPA裂解缓冲液 | Thermo Scientific | 89901 | |
| 罗格列酮 | Merck | 557366 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma | S5761 | |
| 醋酸钠缓冲液 | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
| 十二烷基硫酸钠 | BioRad | 1610301 | |
| T3 | Sigma | T6397 | |
| Talos F200C G2 | Thermo Scientific | ||
| TEMED | BioRad | 1610800 | |
| TOM20 抗体 | Cell Signaling | 42406 | |
| Tris缓冲盐水（TBS-10X） | Cell Signaling | 12498 | |
| Triton X-100 | Sigma | 93443 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%） | Gibco | 25200056 | |
| Tween 20，分子生物学级 | Promega | H5152 | |
| UCP1 抗体 | Cell Signaling | 14670 | |
| Ultracut R | Leica | ||
| 醋酸铀 | Electron Microscopy Sciences | 22400 | |
| Westar Sun | Cyanagen | XLS063 | |
| Westar Supernova | Cyanagen | XLS3 |
参考文献
- Luo, L., Liu, M. Adipose tissue in control of metabolism. Journal of Endocrinology. 231 (3), 77-99 (2016).
- Gaspar, R. C., Pauli, J. R., Shulman, G. I., Muñoz, V. R. An update on brown adipose tissue biology: A discussion of recent findings.
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重印与许可
