本方案概述了用于免疫肿瘤学研究的人源化免疫系统（HIS）小鼠的构建方法。本文介绍了在此模型中移植人源肿瘤并用于测试人源免疫治疗药物的操作步骤和注意事项，重点在于表征人源免疫系统对肿瘤的应答反应。
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方法文章
在携带人源肿瘤的人源化小鼠模型中测试癌症免疫治疗药物
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
逆转肿瘤微环境的免疫抑制特性对于癌症免疫治疗药物的成功应用至关重要。小鼠癌症模型在多样性方面极为有限，且向临床转化的效果较差。为了提供一种更符合生理条件的免疫治疗前临床研究模型，本方案旨在评估在重建了人源免疫系统的小鼠体内对人类肿瘤的治疗效果。该独特方案展示了人源免疫系统（HIS，"人源化"）小鼠的构建过程，随后移植人类肿瘤，包括细胞系来源异种移植模型（CDX）或患者来源异种移植模型（PDX）。HIS小鼠通过向新生BRGS（BALB/c Rag2-/- IL2RγC-/- NODSIRPα）重度免疫缺陷小鼠体内注射从脐带血中分离的CD34+人源造血干细胞而获得，此类小鼠同时具备接受异种肿瘤移植的能力。本方案特别强调了人源免疫系统发育动力学及其特征，以及肿瘤移植时机与方式的重要性。最后，详细描述了利用流式细胞术对肿瘤微环境进行深入评估的方法。在多项采用该方案的研究中发现，个体肿瘤的微环境可在HIS-PDX小鼠中得以重现；"热"肿瘤表现出显著的免疫细胞浸润，而"冷"肿瘤则无此现象。该模型为多种人类肿瘤的联合免疫治疗提供了有效的测试平台，也是实现个体化医学目标的重要工具。
引言
小鼠癌症模型对于建立肿瘤生长和免疫逃逸的基本机制至关重要。然而，由于同源模型有限以及存在物种特异性差异，小鼠模型在癌症治疗研究中的临床转化效果较为有限1,2。随着免疫疗法成为控制肿瘤的主要手段，人们再次强调需要一种具备功能性人源免疫系统的小鼠in vivo模型。过去十年中，人源免疫系统小鼠（HIS小鼠）技术的进步使得在多种癌症类型和免疫治疗药物中进行in vivo肿瘤免疫学研究成为可能3,4,5,6。人源肿瘤模型，包括细胞系来源移植瘤和患者来源移植瘤（分别称为CDX和PDX），在HIS小鼠中生长良好，且在大多数情况下，其生长特征与在缺乏人源造血系统植入的免疫缺陷宿主中的生长几乎一致7,8。基于这一关键发现，研究人员已开始利用HIS小鼠模型研究人源免疫疗法，包括旨在改变肿瘤微环境（TME）以降低免疫抑制、从而增强免疫介导的肿瘤杀伤作用的联合疗法。这些临床前模型有助于解决人类癌症异质性的问题，同时也能预测治疗效果，....
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方案
所有动物实验均在科罗拉多大学丹佛分校机构动物照护与使用委员会（IACUC 协议 #00593 和 #00021）批准的动物实验方案下进行。所有动物实验均在科罗拉多大学丹佛安舒茨医学校区的实验动物资源办公室（OLAR）进行，该机构为美国实验动物护理评估与认证协会认证的设施。所有人类脐带血样本均来自匿名捐赠者，因此无需人类研究伦理委员会批准。
注意：本方案中提到的所有培养基和溶液的组成均包含在补充文件1中。图1展示了在HIS-BRGS小鼠中产生和分析肿瘤免疫应答的整体方案。
1. 人源化免疫系统小鼠的制备
- BALB/c小鼠的饲养管理Rag2null Il2RγCnull SirpαNOD (BRGS) 小鼠
注意：该品系免疫缺陷极为严重，缺乏T细胞、B细胞和NK细胞。因此，必须采取严格措施以防止机会性感染。将品系群体饲养在含有甲氧苄啶和磺胺嘧啶的饲料中，与正常饲料每两周交替一次。应将其饲养在最高级别的防护屏障环境中（例如，限制进入的淋浴式屏障设施）。- 维持 BALB/c 品系小鼠群体Rag2null Il2RγCnull....
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结果
遵循 flank 肿瘤实验方案及实验时间线（图1），在两种不同的人源结直肠癌（CRC）PDX模型中研究了肿瘤生长及对靶向酪氨酸激酶抑制剂（TKI）联合纳武利尤单抗治疗的免疫应答。既往TKI药物仅在免疫缺陷宿主中进行研究，以评估肿瘤生长情况29该模型可用于研究单独使用TKI以及更重要的是联合抗PD-1治疗时免疫反应的变化。本研究重点关注两个不同实验中接受联合治疗的队列，这两个实验分别代表了利用HIS-BRGS小鼠进行的成功评估和一项存在技术缺陷的实验。对于PDX CRC307P模型，联合治疗通过随时间测定的肿瘤生长体积、收获时的肿瘤重量以及SGR指标，显示出对肿瘤生长的抑制作用。图2A-C）。另一方面，在另一组HIS-BRGS小鼠中测试的、源自同一位患者转移性肿瘤的PDX模型CRC307M的生长，受到相同联合治疗的影响较小（图 2D).
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讨论
在过去的6年中，凭借我们在免疫学和人源化小鼠领域的专业知识，我们的研究团队开发出一种亟需的临床前模型，可用于在多种人类肿瘤上测试免疫疗法3,7,30,31本方案强调考虑模型的变异性，特别关注以免疫治疗为中心的人源T细胞群体。本文详细描述了人源化免疫系统小鼠（HIS小鼠）的构建方法，以及对其淋巴器官和肿瘤组织的免疫学分析。方案中还包含了适用于传统补偿型流式细胞仪和光谱流式细胞仪的流式细胞术检测流程。该临床前模型的重要优势在于能够检测大体积肿瘤样本及外周组织中免疫系统的动态变化。该系统的另一优势在于，可将携带相同独特人源肿瘤的多只小鼠分配至不同实验组，接受不同组合的免疫治疗药物处理，从而实现实质上的 "微型" 药物试验。综合而言，这两个因素使得研究人员能够深入探究拟议的（联合）免疫疗法的作用机制及耐药机制。该模型可用于在多种人类肿瘤中测试各种免疫靶向治疗方案的药物给药时机.......
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致谢
我们感谢动物研究设施（OLAR）对我们小鼠的悉心照料，同时也感谢本研究所癌症中心支持基金（P30CA046934）资助的流式细胞术共享资源在我们所有工作中提供的巨大帮助。我们还要感谢Gail Eckhardt和Anna Capasso，她们在我们最初开展的关于HIS-BRGS模型中人源PDX免疫疗法研究的合作中给予了支持。 本研究部分得到了美国国立卫生研究院癌症中心支持基金P30CA06934的资助，并使用了其中的PHISM（临床前人免疫系统小鼠模型）共享资源（RRID: SCR_021990）和流式细胞术共享资源（RRID: SCR_022035）。 本研究部分得到了美国国立卫生研究院NIAID根据合同编号75N93020C00058提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 注射器配针头 | McKesson | 1031815 | |
| 15 mL 离心管 | Grenier Bio-One | 188271 | |
| 2-巯基乙醇 | Sigma | M6250 | |
| 50 mL 离心管 | Grenier Bio-One | 227261 | |
| AutoMACS Pro 分离仪 | Miltenyi | 130-092-545 | |
| BD Golgi Stop 蛋白转运抑制剂（含莫能菌素） | BD生物科学 | BDB563792 | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600100 | |
| 细胞刺激混合液 | Life Technologies | 509305 | |
| Chill 15 样品架 | Miltenyi | 130-092-952 | |
| 带棉塞的玻璃移液管 | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
| Cultrex 基底膜提取物 | R&D Systems | 363200502 | |
| Cytek Aurora | Cytek | ||
| DNase | Sigma | 9003-98-9 | |
| eBioscience FoxP3/转录因子染色缓冲液套装 | Invitrogen | 00-5523-00 | |
| 胚胎干细胞 FCS | Gibco | 10439001 | |
| Eppendorf管；1.5 mL体积 | Grenier Bio-One | 616201 | |
| Excel | 微软 | ||
| FBS | 基准测试 | 100-106 500 mL | |
| Ficoll Hypaque | GE Healthcare | 45001752 | |
| FlowJo 软件 | BD 生物科学 | ||
| 镊子 - 精细 | Roboz Surgical | RS5045 | |
| 普通镊子 | Dumont | RS4919 | |
| 甲醛 | Fisher | F75P1GAL | |
| 磨砂玻璃片 | 康宁 | 1255310 | |
| Gentlemacs C-Tubes | Miltenyi | 130-096-334 | |
| GentleMACS 组织解离仪 | Miltenyi | 130-093-235 | |
| 玻璃移液管 | DWK生命科学 | 63A53 | |
| Glutamax | Gibco | 11140050 | |
| 含钙 HBSS &和 Mg | Sigma | 55037C | |
| HEPES | 康宁 | MT25060CI | |
| IgG 标准品 | Sigma | I2511 | |
| IgM 标准品 | Sigma | 401108 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Liberase DL | 罗氏 | 5466202001 | |
| LIVE/DEAD 可固定蓝色染料 | 赛默飞世尔科技 | L23105 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| MEM | Gibco | 1140050 | |
| 小鼠抗人 IgG-AP | Southern Biotech | JDC-10 | |
| 小鼠抗人IgG-未标记 | Southern Biotech | H2 | |
| 小鼠抗人IgM-AP | Southern Biotech | UHB | |
| 小鼠抗人IgM-未标记 | Southern Biotech | SA-DA4 | |
| MultiRad 350 | 精准X射线 | ||
| PBS | 康宁 | 45000-446 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 培养皿 | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| 对硝基苯基底物 | 赛默飞世尔科技 | 34045 | |
| PRISM | Graphpad | ||
| 重组人 FLT3L | R&D系统 | 308-FK-005/CF | |
| 重组人IL6 | R&D系统 | 206-IL-010/CF | |
| 重组人SCF | R&D 系统 | 255SC010 | |
| RPMI 1640 | 康宁 | 45000-39 | |
| 皂苷 | Sigma | 8047-15-2 | |
| 剪刀 | McKesson | 862945 | |
| 25 mL 血清移液管 | Fisher Scientific | 1367811 | |
| 无菌滤器 | Nalgene | 567-0020 | |
| 无菌分子水 | Sigma | 7732-18-5 | |
| Yeti 细胞分析仪 | 伯乐（Bio-Rad） | 12004279 | |
| Zombie Green | biolegend | 423112 |
参考文献
- Chulpanova, D. S., Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. Mouse tumor models for advanced cancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 4118(2020).
- Olson, B., Li, Y., Lin, Y., Liu, E. T., Patnaik, A. Mouse models for cancer imm....
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors
Posted by JoVE Editors on 5/25/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors. The Authors section was updated from:
Jordi M. Lanis1
Matthew S. Lewis1
Hannah Strassburger1
Stacey M. Bagby2
Adrian T. A. Dominguez2
Juan A. Marín-Jiménez3
Roberta Pelanda1
Todd M. Pitts2
Julie Lang1
1Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
2Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
3Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L’Hospitalet)
to:
Jordi M. Lanis1
Matthew S. Lewis1
Hannah Strassburger1
Kristina Larsen1
Stacey M. Bagby2
Adrian T. A. Dominguez2
Juan A. Marín-Jiménez3
Roberta Pelanda1
Todd M. Pitts2
Julie Lang1
1Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
2Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
3Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L’Hospitalet)
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