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方法文章

在携带人源肿瘤的人源化小鼠模型中测试癌症免疫治疗药物

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DOI：

10.3791/64606

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2022年12月16日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus, 2Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus, 3Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L'Hospitalet)

* These authors contributed equally

本文内容

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摘要

本方案概述了用于免疫肿瘤学研究的人源化免疫系统（HIS）小鼠的构建方法。本文介绍了在此模型中移植人源肿瘤并用于测试人源免疫治疗药物的操作步骤和注意事项，重点在于表征人源免疫系统对肿瘤的应答反应。

摘要

逆转肿瘤微环境的免疫抑制特性对于癌症免疫治疗药物的成功应用至关重要。小鼠癌症模型在多样性方面极为有限，且向临床转化的效果较差。为了提供一种更符合生理条件的免疫治疗前临床研究模型，本方案旨在评估在重建了人源免疫系统的小鼠体内对人类肿瘤的治疗效果。该独特方案展示了人源免疫系统（HIS，"人源化"）小鼠的构建过程，随后移植人类肿瘤，包括细胞系来源异种移植模型（CDX）或患者来源异种移植模型（PDX）。HIS小鼠通过向新生BRGS（BALB/c Rag2-/- IL2RγC-/- NODSIRPα）重度免疫缺陷小鼠体内注射从脐带血中分离的CD34+人源造血干细胞而获得，此类小鼠同时具备接受异种肿瘤移植的能力。本方案特别强调了人源免疫系统发育动力学及其特征，以及肿瘤移植时机与方式的重要性。最后，详细描述了利用流式细胞术对肿瘤微环境进行深入评估的方法。在多项采用该方案的研究中发现，个体肿瘤的微环境可在HIS-PDX小鼠中得以重现；"热"肿瘤表现出显著的免疫细胞浸润，而"冷"肿瘤则无此现象。该模型为多种人类肿瘤的联合免疫治疗提供了有效的测试平台，也是实现个体化医学目标的重要工具。

引言

小鼠癌症模型对于建立肿瘤生长和免疫逃逸的基本机制至关重要。然而，由于同源模型有限以及存在物种特异性差异，小鼠模型在癌症治疗研究中的临床转化效果较为有限1,2。随着免疫疗法成为控制肿瘤的主要手段，人们再次强调需要一种具备功能性人源免疫系统的小鼠in vivo模型。过去十年中，人源免疫系统小鼠（HIS小鼠）技术的进步使得在多种癌症类型和免疫治疗药物中进行in vivo肿瘤免疫学研究成为可能3,4,5,6。人源肿瘤模型，包括细胞系来源移植瘤和患者来源移植瘤（分别称为CDX和PDX），在HIS小鼠中生长良好，且在大多数情况下，其生长特征与在缺乏人源造血系统植入的免疫缺陷宿主中的生长几乎一致7,8。基于这一关键发现，研究人员已开始利用HIS小鼠模型研究人源免疫疗法，包括旨在改变肿瘤微环境（TME）以降低免疫抑制、从而增强免疫介导的肿瘤杀伤作用的联合疗法。这些临床前模型有助于解决人类癌症异质性的问题，同时也能预测治疗效果，并监测与免疫相关的药物毒性9,10。

通过引入人源造血干细胞构建具有人类免疫系统的小鼠模型，需要使用不会排斥异种移植物的免疫缺陷型小鼠作为受体。目前的人源化免疫系统（HIS）小鼠模型均源于30多年前报道的免疫缺陷小鼠品系。最早报道的免疫缺陷小鼠品系为SCID小鼠，其缺乏T细胞和B细胞11；随后出现了NOD-SCID杂交品系，该品系具有SIRPα多态性，可导致小鼠巨噬细胞对人源细胞产生耐受，原因是NOD型SIRPα等位基因与人源CD47分子之间的结合能力增强12,13。在21世纪初，将IL-2受体（IL-2Rγc）的共同γ链基因在BALB/c和NOD免疫缺陷小鼠品系中进行敲除，显著提高了人源细胞的植入效率，因为该基因缺失可阻断宿主自然杀伤（NK）细胞的发育14,15,16,17。其他替代模型如BRG和NRG小鼠，则通过敲除Rag1或Rag2基因实现T细胞和B细胞缺陷，这些基因对T细胞和B细胞受体基因的重排至关重要，从而影响淋巴细胞的成熟与存活18,19。本研究中使用的BRGS（BALB/c -Rag2nullIl2RγCnullSirpαNOD）小鼠，是在Rag2-/-遗传背景下，同时结合了IL-2Rγ链缺失和NOD型SIRPα等位基因，从而获得一种高度免疫缺陷的小鼠模型，其缺乏T细胞、B细胞和NK细胞，但仍具备足够的活力和健康状态，可支持超过30周的长期移植13。

可通过多种方式构建人源化免疫系统（HIS）小鼠，其中最直接的方法是注射人外周血单个核细胞（PBMC）15,18,20。然而，这类小鼠体内会显著扩增活化的人T细胞，导致在12周龄左右出现移植物抗宿主病（GVHD），从而限制了长期研究的开展。另一种替代方法是使用来自脐带血（CB）、骨髓或胎儿肝脏的人造血干细胞进行移植，以从头重建人类免疫系统de novo。在此模型中，造血干细胞可发育为多谱系的人类免疫系统，生成T细胞、B细胞及天然免疫细胞，并且重要的是，这些细胞对小鼠宿主具有耐受性，而PBMC模型小鼠则主要发育出T细胞。因此，GVHD在该系统中不存在或显著延迟，研究可延长至小鼠10月龄。脐带血提供了一种简便、易获取且无创的CD34+人造血干细胞来源，有助于建立多个具有遗传一致免疫系统的人源化小鼠模型17,18,20,21。近年来，HIS小鼠模型已被广泛用于免疫治疗和肿瘤微环境（TME）的研究3,4,5,6。尽管这些小鼠体内已发育出人类来源的免疫系统，人源异种移植肿瘤的生长速度仍与对照组免疫缺陷小鼠相似，且允许癌细胞与免疫细胞之间发生复杂的相互作用，这对于维持移植的患者来源异种移植瘤（PDX）的微环境至关重要3,7,8。本实验方案已用于开展超过50项研究，评估HIS-BRGS小鼠中PDX和CDX模型的治疗效果。一个重要结论是，HIS小鼠中的人类肿瘤保持了其独特的肿瘤微环境（TME），这一特性通过肿瘤组织相对于原始患者样本的分子特征以及免疫细胞浸润特征得以确认3,22,23。我们课题组专注于利用多参数流式细胞术，深入评估HIS小鼠免疫器官及肿瘤组织中的人源免疫系统。本文中，我们描述了一套完整的实验流程，包括BRGS小鼠的人源化、嵌合率评估、人源肿瘤移植、肿瘤生长监测、抗癌治疗给药以及通过流式细胞术对人源免疫细胞进行分析。

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方案

所有动物实验均在科罗拉多大学丹佛分校机构动物照护与使用委员会（IACUC 协议 #00593 和 #00021）批准的动物实验方案下进行。所有动物实验均在科罗拉多大学丹佛安舒茨医学校区的实验动物资源办公室（OLAR）进行，该机构为美国实验动物护理评估与认证协会认证的设施。所有人类脐带血样本均来自匿名捐赠者，因此无需人类研究伦理委员会批准。

注意：本方案中提到的所有培养基和溶液的组成均包含在补充文件1中。图1展示了在HIS-BRGS小鼠中产生和分析肿瘤免疫应答的整体方案。

1. 人源化免疫系统小鼠的制备

  1. BALB/c小鼠的饲养管理Rag2null Il2RγCnull SirpαNOD (BRGS) 小鼠
    注意：该品系免疫缺陷极为严重，缺乏T细胞、B细胞和NK细胞。因此，必须采取严格措施以防止机会性感染。将品系群体饲养在含有甲氧苄啶和磺胺嘧啶的饲料中，与正常饲料每两周交替一次。应将其饲养在最高级别的防护屏障环境中（例如，限制进入的淋浴式屏障设施）。
    1. 维持 BALB/c 品系小鼠群体Rag2null Il2RγCnull SirpαNOD (BRGS) 和 BALB/c Rag2null Il2RγCnull SirpaBalb/c 使用 (BRG) 纯合小鼠作为繁殖种鼠。
    2. Breed BRGSN/N×BRGB/B以生成BRGSB/N 幼鼠，用于接受人类干细胞移植。在此品系中，BRGSB/N 比BRGS更健康N/N，并以相当的水平植入（高于BRG）。
  2. 从脐带血中分离 CD34+ 人类干细胞
    注意：本实验步骤中不使用任何抗生素，因此必须采用严格的无菌操作技术。
    1. 在无菌生物安全柜（BSC）中放置一个50 mL锥形管架，以及3个15 mL和约10个50 mL锥形管。用70%乙醇喷洒血袋，并在生物安全柜内晾干。
    2. 计算用于脐带血密度梯度分离的50 mL锥形管数量 = 脐带血体积 / 15，结果向上取整并调整为偶数管数。计算每管血液体积 = 脐带血体积 / 管数。将血液从脐带血袋中小心倒入各锥形管中，每管最多不超过15 mL。使用自动移液器和25 mL血清移液管，以移液上下吹打的方式将血液与无菌PBS按1:1比例混匀。
    3. 使用自动移液器以低速配合10 mL血清学移液管，将室温（RT）下密度为1.077 g/mL的密度梯度溶液缓慢铺于血液下方（参见 材料表）时不要扰动界面，移液枪头避免接触管底。对所有管子重复此操作。然后以850 x g离心30分钟 g，于室温下不进行制动，以确保密度梯度的维持。
    4. 在1.077 g/mL密度梯度液上方观察到呈浑浊白色的细胞富集层（buffy coat）。使用25 mL刻度吸管和自动移液器，将血浆层移除并弃去，保留约10 mL血浆层于富集层上方。
    5. 用无菌移液管或血清移液管收集白膜层。将移液管当作刮铲使用，在缓慢释放移液球（或缓慢吸取）的同时，刮下锥形管壁上的细胞，并将细胞吸入管中。将两个50 mL锥形管中的白膜层合并至一个全新的50 mL锥形管中。
    6. 用含有 2% FBS 的无菌 HBSS 溶液 45 mL 冲洗细胞，加入每支锥形管中。在 360 x g 条件下离心 11 分钟 g 室温下
    7. 吸弃所有离心管中的洗涤液，保留沉淀。使用10 mL血清移液管和自动移液器，将第一个沉淀重悬于含2% FBS的10 mL HBSS中。将每个沉淀依次用同一份10 mL HBSS重悬，并用额外的10 mL HBSS冲洗每支离心管，以收集全部细胞至同一支离心管中。
    8. 在锥形管中加入45 mL含2% FBS的无菌HBSS，360 x g离心10分钟 g，在 4 °C.
    9. 吸去洗涤缓冲液，直至接近细胞沉淀，然后将沉淀重悬于20 mL磁性细胞分选缓冲液中（参见 材料表). 取少量等分试样，用亚甲蓝按1:20稀释后，使用血细胞计数板进行细胞计数。计数蓝色和白色细胞的总数。在360 x g，10分钟，10,000 × g离心 4 °C.
      注意：本方案采用磁珠技术（参见 材料表该方案可进行调整，以适用于任何细胞分离技术，从而获得足够纯度和得率的CD34+干细胞。
    10. 吸弃上清液，并将从脐带血中分离出的CD34+细胞沉淀重悬于 300 µL 每1 × 10⁶细胞使用磁性细胞分选缓冲液8 细胞。加入 100 µL 先加入 FcR 封闭试剂，然后 100 µL 每1×10个细胞使用CD34+磁珠8 细胞。在指定条件下孵育 4 °C 30分钟（无需冰浴）。
    11. 每 1 × 10⁶ 个细胞加入 5 mL 磁性细胞分选缓冲液8 细胞并在 360 x g 10 分钟 4 °C重复洗涤步骤，并将沉淀重悬于 500 µL 每1 × 10⁶细胞使用磁性细胞分选缓冲液8 15 mL 圆底管中标记为“未分级”的细胞
    12. 标记另外两个15 mL离心管，分别标注为“CD34-”和“CD34+”。将三个15 mL离心管（未分选、CD34- 和 CD34+）分别置于冷却架的A1、B1和C1位置（参见 材料表）。使用自动磁性细胞分选仪上的双柱阳性分选程序分离细胞（参见 材料表在生物安全柜中，根据仪器制造商的说明书操作。
  3. 扩增与冻存 CD34+ 人类干细胞
    1. 等分试样 10 µL 在血细胞计数板上加入 2 mL 回收的 CD34+ 细胞悬液，于 10 倍显微镜下计数细胞。将细胞计数值乘以 2 × 10，计算 CD34+ 细胞总数。4将总的CD34+细胞数量除以250,000，以计算需要冻存的冻存管数量（每只新生小鼠接种50,000个细胞） 体外 扩增）
    2. 制备含10%胎牛血清的CB培养基Iscove's（额外添加1 mL以补偿过滤损耗），并补充40 ng/mL干细胞因子、20 ng/mL Flt3L和10 ng/mL IL-6，随后通过一个 0.22 µm 过滤。将CD34+细胞以每毫升脐带血培养基重悬至100,000个细胞，孵育于 37 °C第3天，向含有细胞和含细胞因子的CB培养基的培养瓶中加入等体积的不含细胞因子的CB培养基。
      注意：在CB培养基中添加这些细胞因子可促进CD34+细胞的存活与扩增，同时抑制其分化。
    3. 第5天收获扩增的CD34+细胞。用移液器将细胞悬液吹打混匀，收集至50 mL锥形管中。加入足量的CB培养基覆盖培养瓶底部。使用细胞刮刀刮取培养瓶整个底部，将全部培养基收集至同一50 mL离心管中，于360 x g 11 分钟
    4. 将细胞重悬于 2 mL CB 培养基中。将移液器中的最后一滴液体保留并转移至 96 孔板中用于计数。用台盼蓝按 1:1 比例稀释细胞后加入 10 µL 将细胞悬液加入血细胞计数板，计数四个象限的细胞并取平均值。将细胞计数结果乘以 4 × 10，计算 CD34+ 细胞的总数。4，记录细胞活力。
    5. 配制 n+1 mL 冻存液，其中 n 为步骤 1.3.1 中计算出的冻存管数量。通过将 10%（v/v）DMSO 加入 FBS 中制备冻存液，并置于冰上保存。用 CB#、CD34+ d5 和日期标记冻存管。
    6. 以 360 x g 离心 CD34+ 细胞 g 10 分钟 4 °C吸弃培养基至沉淀处，用冻存液重悬细胞沉淀。将1 mL细胞悬液分装至每个冻存管中，并将剩余液体均匀分配至各管。将冻存管放入预冷至指定温度的异丙醇细胞冻存盒中 4 °C，置于 -80 °C，并转移至液氮中保存以备后续使用 >90 天
  4. 小鼠仔鼠照射
    1. 收集 BRGSB/N 出生后1至3天的幼崽放入已灭菌的塑料盒中，并加入少量垫料。用笼号和幼崽数量标记盒子。
    2. 设置照射器（参见 材料表) 以300 rad剂量照射。将幼鼠盒放入照射仪中，进行300 rad照射。照射后将幼鼠放回笼中，堆叠在一起，并覆盖垫料。
  5. 幼鼠注射与CD34+细胞制备
    1. 辐照后约3小时开始CD34+细胞制备。在50 mL锥形管中预热10 mL脐血培养基。所有操作均在无菌生物安全柜中进行。
    2. 取出一瓶 体外 每四到六只幼鼠注射扩增并冻存的CD34+细胞，快速解冻 55 °C，直至仅剩少量冰晶可见，立即将细胞加入预热的CB培养基中（冻存管仍应触感微凉）。每管用1 mL培养基冲洗，并在360 x g 12 分钟 4 °C.
      注意：在 55 °C 细胞存活率更高（90%–95%），优于解冻于 37 °C.
    3. 小心吸除培养基。将（少量）沉淀物重悬于 2 mL CB 培养基中，轻轻混匀，并加入约30 µL 将细胞悬液加入计数板的单个孔中。用台盼蓝1:1稀释后，再加入 10 µL 使用血细胞计数板，计数四个象限的细胞并取平均值。
    4. 通过将细胞计数乘以 4 x 10 计算 CD34+ 细胞的总数4 然后记录存活率。以360 x g 12 分钟 4 °C.
    5. 小心吸除培养基，并将细胞沉淀重悬于 100 µL 每只待注射的仔鼠按 n+1 的比例加入无菌 PBS，使每只小鼠获得 250,000–450,000 个 CD34+ 细胞。将锥形管置于运输容器中的冰上，运送至动物房进行仔鼠注射。
    6. 将加热灯、尿布、1 mL注射器、18 G针头、30 G针头以及无菌容器中的CD34+细胞制剂带至动物房生物安全柜（BSC）中。在加热灯下方约2英尺处放置一张无菌尿布。取出待注射幼崽所在的笼子，并放入生物安全柜内。
    7. 将注射器与18 G斜面针头组装。将锥形管的角度与针头斜面匹配，轻柔混匀并吸取细胞悬液。将幼鼠置于尿布上保温（注意防止过热）。排出注射器中的空气，将18 G针头更换为30 G针头，然后小心推动注射器，使细胞悬液刚好到达针尖处。
      注意：也可使用胰岛素注射器。
    8. 一次取一只幼鼠，将其移至远离热源的尿布边缘。用拇指和食指从侧面固定幼鼠，使其面部清晰可见。注意观察耳部下方脸颊处的血管。将针头浅刺入靠近眼睛的静脉（IV），缓慢注射 50 µL 细胞数量。
    9. 检查皮下注射时是否有气泡形成。如有，将针头插入更深后继续注射细胞。成功时可见少量血液或血肿。
      注意：请参考 Gombash Lampe 等人的实验步骤。24 关于幼鼠注射。
    10. 幼崽仍处于固定状态时，用另一器具进行肝内注射（IH） 50 µL 细胞数量（100 µL 每只幼鼠的总注射量（IV+IH）。肝脏可呈现为白色乳糜带与胸廓之间的深色斑点。将已注射的幼鼠放置在远离未注射幼鼠和热源的尿布上。
      注意：与单独使用IH注射相比，IV注射可实现更佳的长期嵌合率25但静脉注射并不总是成功，因此将注射液分次通过静脉和颅内途径给药，可确保在更大比例的小鼠体内实现移植定植。
    11. 对所有幼鼠重复进行面静脉和IH注射。清除任何血液，将幼鼠放回笼中巢穴，并用垫料覆盖。

2. 检测血液中的人类嵌合现象

  1. 在人源化免疫系统小鼠（HIS小鼠）10周龄和14周龄时检测血液中的嵌合率。采集 50 µL 血液 通过 眼后静脉或采用其他经IACUC批准的方法。
    1. 对于眶后静脉丛采血，使用异氟烷麻醉机将浓度设为5，对小鼠麻醉1-2分钟，随后将麻醉机浓度调至4。根据需要调节麻醉机浓度，使小鼠在麻醉期间保持足够的氧合状态。小鼠接受异氟烷麻醉的时间不得超过5分钟。
    2. 将麻醉后小鼠的鼻部放入异氟烷麻醉机的鼻罩接头中，并在眼睛上滴加一滴镇痛剂（0.5% 盐酸丙帕卡因眼科用溶液，USP）。
    3. 1分钟后，使用无菌纱布去除丙美卡因，外翻眼球，将75 mm肝素化血细胞比容管经眼后眶插入以采集 50 µL 血液。将血液排入含有1.5 mL微量离心管中 50 µL 肝素，轻轻混匀。
    4. 用无菌纱布捏住眼睛使其闭合以止血，并滴加一滴丙帕卡因。将小鼠移出异氟烷环境，置于清洁的笼子中恢复。
  2. 从小鼠血液中分离PBMC
    1. 轻轻吹打混匀血液与肝素，然后缓慢地叠加于其上 500 µL 密度为1.077 g/mL的密度梯度，注意不要扰动界面。将试管在1,220 x g 室温下静置20分钟，不使用刹车。
    2. 将细胞富集层视为位于血浆下方、1.077 g/mL 密度梯度液上方的一层浑浊层。用移液管尽可能吸出富集层中的细胞 200 µL 移液并加入含有新 1.5 mL 离心管中 750 µL 收获培养基。在360 x g 室温下持续11分钟。
    3. 吸除培养基至指定体积 50 µL 并用缓冲液重悬沉淀物 750 µL 收获培养基。在360 x g 10 分钟 4 °C，并再次向下抽吸 50 µL细胞已准备好重悬于表面染色液中。
  3. 表面染色与流式细胞术分析
    1. 填写染色面板工作表（表1；“光谱流式溢出对照板”工作表）记录小鼠编号，并通过将所有荧光抗体加入染色缓冲液中配制抗体染色混合液（补充文件 1）。在96孔U型底板上设计加样布局，使用永久性记号笔标记各孔底部。染色前采用标准流程对抗体进行滴定，以确定合适的抗体浓度26.
    2. 添加 62 µL 将表面染色混合液加入96孔U型底板的每孔中。重悬各孔中的细胞。 50 µL 留在管中，并将每个样本加入对应的孔中。设置一个阳性染色对照孔（人PBMCs + 小鼠脾细胞，1 x 106 细胞各）与样品同时进行染色。用移液器吹打混匀，将混合物于15分钟内孵育 4 °C.
    3. 680 × g 离心 g 3 分钟 4 °C将培养板轻磕至水槽中以弃去上清液，然后通过重悬细胞进行洗涤 150 µL 用移液枪轻柔吹打约10次以重悬于染色缓冲液中。离心后，将每孔重悬于 150 µL 染色缓冲液
    4. 获取数据 100 µL 每份样品在流式细胞仪上进行检测（参见 材料清单）并导出.fcs文件。将.fcs文件导入流式数据编辑软件（参见 材料表). 在FSC-A × SSC-A图上绘制多边形门，圈定细胞并排除碎片。选择门内细胞（参见 表1；“光谱流溢出门控”工作表）。
    5. 将坐标轴更改为（FSC-A × FSC-H），圈选位于线性对角线上且排除从该线突出的双联体的细胞。选中这些细胞后，将坐标轴更改为（hCD45 × mCD45）。
    6. 对hCD45+细胞群应用多边形门控，并命名为“human”；对mCD45+细胞群应用多边形门控，并命名为“mouse”。分别为human和mouse细胞群创建计数统计。
    7. 选择人类细胞群体，并将坐标轴更改为（CD19 × CD3）。对CD19+细胞应用多边形门控，命名为“B细胞”。对CD3+细胞群体应用多边形门控，命名为“T细胞”。对双阴性群体应用多边形门控，命名为“NonTB”。
    8. 选择T细胞群体，并将坐标轴更改为（CD8 × CD4）。对CD4和CD8阳性群体应用多边形门，分别命名为“CD4+”和“CD8+”。
    9. 选择非TB群体，并将坐标轴更改为（CD56 × 髓系）。对包含双阳性事件在内的全部CD56阳性群体应用多边形门控，命名为“NK细胞”。对CD56阴性且髓系阳性群体应用多边形门控，命名为“髓系”。
    10. 创建所有群体的百分比和计数统计表，并导出至电子表格软件（参见 材料表）。计算 %hCD45 嵌合率 = %hCD45 / (%hCD45 + mCD45)。
    11. 排除HIS小鼠 <20% hCD45+（占mCD45+hCD45的百分比）用于后续实验。
      注意：本研究中，采用密度为1.077 g/mL的梯度离心法分离PBMCs，以实现更彻底的红细胞去除。该方法可将人和小鼠的粒细胞排除在PBMC层之外。 alternatively，也可使用红细胞裂解法。

3. 将肿瘤注射到小鼠体内

  1. 在肿瘤注射前，根据第14周采血数据确认T细胞数量。若T细胞数量符合要求，则注射肿瘤，使其在20至26周之间达到可收获状态 >20%，若T细胞在24至28周之间 <占总免疫细胞群体的20%。该注射时间可确保小鼠在实验结束时年龄为20至28周，并具有足够数量的T细胞。
  2. 细胞系来源异种移植瘤注射
    注意：本实验以 MDA-MB-231 乳腺腺癌细胞为例进行描述（参见 材料清单）作为示例。
    1. 解冻一份冻存细胞，加入10 mL含10% FBS、1%青霉素-链霉素和1%非必需氨基酸的DMEM培养基重悬细胞，洗涤1次，360 x g离心 g 10 min 4 °C吸弃培养基，加入10 mL DMEM重悬细胞，DMEM中添加10% FBS、1%青霉素-链霉素和1%非必需氨基酸，接种于T25培养瓶中，于37°C、5% CO₂培养箱中培养 37 °C 含5% CO2.
      注意：通过 PCR 对细胞系进行鉴定，以确保细胞类型正确；细胞上清液需进行支原体检测。 通过 注射前的生化检测。
    2. 在细胞处于对数生长期且融合度约为80%时进行传代和扩增。
      1. 吸弃培养基，用 5–10 mL 无菌 PBS（pH 7.2）洗涤细胞，加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，孵育 1–5 分钟，直至细胞从培养瓶脱落。
      2. 加入5 mL相同的DMEM，通过上下吹打混匀。将全部6 mL细胞悬液传代至一个新的经组织培养处理的T75培养瓶中（1:3稀释），再额外加入10 mL DMEM。
      3. 每2-3天在细胞融合度达到80%时，以1:3的传代比例在DMEM中进行传代培养，以扩增细胞。
    3. 在传代六次以内的对数生长期，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化收集细胞，并用PBS洗涤。将PBS与基底膜提取物混合（见 材料表) 按1:1比例混合，加入细胞中，终浓度为5 x 107 cells/mL
    4. 用异氟烷麻醉小鼠，操作步骤如2.1.1所述。皮下注射 100 µL (5 × 106 使用23 G针头将肿瘤细胞悬液的细胞接种于每侧 flank。
  3. 使用套管针对患者来源的异种移植瘤（PDX）进行接种。PDX模型的接种操作及其他建模与维护说明详见相关文献27.

4. 肿瘤生长的测量

  1. 移植后每周通过触诊小鼠 flank 区域检查一次肿瘤进展。当肿瘤可触及后，使用异氟烷对小鼠进行麻醉（如步骤 2.1.1 所述），并用电推剪剃除两侧 flank 的毛发，操作时需注意避开肿瘤区域，防止肿瘤生长过程中发生溃疡。
    注意：可在肿瘤接种前预先剃毛，以避免肿瘤周围皮肤受损；然而，毛发再生速度可能会影响肿瘤的测量。
  2. 每周使用游标卡尺测量肿瘤长度和宽度两次，并以 mm 为单位记录测量结果。根据公式 静态平衡公式，V=(w2)(l/2)，图示平衡概念。 计算并报告肿瘤体积（mm3）。注意单个肿瘤体积不得超过 2,000 mm3，总肿瘤体积不得超过 3,000 mm3。
    注意：小鼠在癌症研究中的使用指南因地区而异，请参考研究人员所在机构的动物护理与使用政策。

5. 药物处理

  1. 根据hCD45嵌合率、hCD3嵌合率和hCD8嵌合率将HIS小鼠分配至相应的治疗组。当肿瘤平均体积达到100 mm3时，开始给药治疗。
    注：每组小鼠数量取决于由脐带血生成的HIS小鼠数量，建议每组至少四只小鼠。可使用非二分多组匹配方法（例如R-vivo Manila软件）进行分组28。
  2. 给药途径与频率
    1. 单药治疗时，每周1次或每周2次腹腔注射抗PD-1抑制剂（nivolumab、pembrolizumab），剂量分别为30 mg/kg或20 mg/kg；联合治疗时，每周2次，剂量为10–15 mg/kg。
    2. 根据实验设计给予联合治疗，如靶向治疗、化疗或放疗。靶向治疗和化疗可通过灌胃、腹腔注射或饲料给药。
      ​注：剂量可根据已发表数据和肿瘤模型进行调整和优化。通常在开展HIS小鼠研究前，先在免疫缺陷受体小鼠中进行剂量探索研究。
  3. 每周至少监测小鼠健康状况3次，观察体重减轻、粪便松软、弓背姿势、活动减少及脱毛等变化。部分症状可能提示药物毒性或移植物抗宿主病（GVHD），此时可能需要减少或停止给药。根据动物护理与使用政策，必要时实施安乐死。

6. 研究结束时小鼠组织和肿瘤的采集

  1. 根据机构和兽医指南，使用压缩 CO₂ 单独处死小鼠2 以2.75 L/min的流速通入气体。监测置于CO中的小鼠2 死亡后持续1分钟，然后实施颈椎脱位作为二次安乐死方法。
  2. 血液采集
    1. 采集血液 通过 心脏穿刺。将小鼠保持直立姿势，使用带25 G针头的1 mL注射器，从腹中线偏左侧、肋骨下方的位置直接插入心脏。尽可能通过一次连续抽吸采集血液，并转移至已标记的1.5 mL离心管中。
      注意：可谨慎地进行额外的针头插入，从肺腔角落采集更多血液。
    2. 将血液静置 4 °C 孵育1小时，然后在微型离心机中以7,800 x g离心6分钟 g. 收集血液界面以上的澄清液体（血清）至第二个洁净且已标记的1.5 mL离心管中。将血清储存在 -20 °C 用于下游分析，例如人和小鼠炎症性细胞因子或免疫球蛋白滴度。
  3. 组织解剖
    1. 在小鼠体内注射并培养肿瘤细胞，给予药物治疗后，采集组织。将小鼠置于泡沫解剖板上，用图钉固定其身体，四肢伸展 45° 角度。从靠近骨盆处开始，沿躯干中线向上切至下巴，做一切口，注意尽量避免切到腹膜（尽管这并非必需）。将皮肤拉向边缘，用针固定在适当位置。
    2. 使用精细镊子按以下顺序取出淋巴结（LNs）：腹股沟、腋窝、颈部、肠系膜、膈肌裂孔。
      注意：在HIS小鼠中，淋巴结通常非常小，类似于原基，或呈现与野生型小鼠不同的“炎症样”外观。因此，需从每个解剖位置采集疑似淋巴结的组织。外周淋巴结常表现为充满液体的“球状”结构，而肠系膜淋巴结则更为致密。肠系膜淋巴结最为明显且形态一致，通常表现为一个或两个独立的致密结节，而非串珠状排列。
    3. 将淋巴结置于培养皿中含8 mL收获培养基的磨砂玻璃片的一侧。手持载玻片使其呈垂直方向，磨砂边缘朝内，轻轻按压组织，直至细胞内容物释放。
    4. 将玻片反复推拉数次以充分冲洗，尽可能释放出最多的细胞。用5英寸玻璃移液管收集细胞，经9英寸棉塞移液管过滤后，转入已标记的15 mL锥形管中。
    5. 使用两把镊子或一把镊子和剪刀，从腹腔左上侧取出脾脏。根据脾脏大小估算重悬介质的体积。采用磨砂玻璃片通过机械消化法收集并过滤脾脏，方法与淋巴结处理相同。
      注意：可用于制备单细胞悬液的任何组织处理技术。
    6. 按照下述方法对组织样本中的细胞进行计数和重悬。
      1. 将淋巴细胞在 360 x g 10 分钟 4 °C吸弃液体，将细胞沉淀重悬于1 mL含有DNase的收获培养基中。
      2. 用3 mL ACK裂解缓冲液在室温下孵育脾细胞3分钟以去除红细胞，随后加入10 mL收获培养基/DNase。再次离心脾细胞，吸除上清液，并根据脾脏大小将细胞重悬于1–10 mL收获培养基/DNase中（例如，非常小的脾脏使用1 mL，最大的脾脏可使用至10 mL）。
      3. 添加一个 10 µL 细胞悬液等分试样至 90 µL 离心收集淋巴结和脾脏细胞，吸除上清液，用收获培养基重悬细胞，调整细胞浓度至1 x 10⁶8 细胞/毫升，或至少 80 µL.
    7. 取出肿瘤。
      1. 用镊子夹住肿瘤，同时用解剖剪缓慢剪除开放侧腹的肿瘤边缘，将肿瘤切除。
      2. 肿瘤切除后，称重并取其 1/4 用于 RNA 和免疫组织化学（IHC）处理。将这 1/4 肿瘤组织平分为两份，取其中一半（即整个肿瘤的 1/8）放入冻存管中，液氮速冻2，并于 -80 °C 用于下游基因组学研究。
      3. 将另外1/8的肿瘤组织放入含有10%甲醛的已标记标本管中。次日，用70%乙醇冲洗并重悬组织，以备后续使用。将剩余3/4的肿瘤组织放入6 cm培养皿中，用手术刀片切成约1 mm大小的组织块。
      4. 将肿瘤组织块转移至解离管中（参见 材料清单），用 5 mL 不完全肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）培养基冲洗培养皿，并加入解离管中。
        注意：对于重量为 >0.4 g，用10 mL TIL不完全培养基冲洗培养皿，然后加入解离管中。
      5. 加入胶原酶溶液（参见 材料表) 加入终浓度为 50 mg/mL 的组织解离管中。使用机械解离法对组织进行解离 37 °C 30分钟至1小时，具体时间取决于肿瘤的硬度。
      6. 消化后，将悬液通过一个 100 µm 过滤至50 mL锥形管中，并用10 mL含血清的TIL完全培养基冲洗滤膜。该培养基中的血清可终止胶原酶反应，保护细胞免受进一步降解。
      7. 将单细胞悬液在360 x g下离心 g 10 min 4 °C将沉淀重悬于适量含有DNase的收获培养基中，使细胞悬液能够轻松通过P1000移液器吸头，并记录体积以用于后续分析。
        注意：较小的体积可增加肿瘤免疫细胞的收集量，但更容易导致流式细胞仪堵塞。

7. 细胞染色与流式细胞术分析

  1. 染色制备与细胞接种
    1. 制备染色混合液：在收获当天，将样本数量添加至染色工作表中（表2；“常规流式A面板”、“光谱流式B面板”和“常规流式C面板”工作表）中的所有染色剂并打印。在染色缓冲液（SB）中分别配制染色剂A和B的表面染色混合液，每种抗体均使用新的枪头单独加入，边加边标记已添加的试剂，并将混合液置于 4 °C 直至需要时使用。将适当的活率染料配制于无叠氮化钠的 PBS 中，并储存于 4 °C 待使用前保存（使用前恢复至室温）。在第2天，于SB中配制表面染色C混合液，同时在其各自的透化缓冲液中配制胞内染色B和C。
    2. 为染色工作表中的所有样本创建板布局并进行分装 100 µL 向孔中加入无叠氮化物的 PBS。每种组织和染料均需设置未染色对照（用于光谱流式细胞术）。
    3. 将细胞加入含有96孔板中 50 µL PBS。对于染色A，根据染色工作表上注明的体积，将每组组织重悬于相应体积的溶液中，并储存于 4 °C 直至当天在流式细胞仪上进行检测。对于染色B和C，添加 25 µL 淋巴液的 60 µL 将非淋巴组织细胞悬液加入含PBS的孔中。
    4. 执行 体外 使用染料C通过细胞内染色法检测细胞因子的刺激
      1. 将步骤 7.1.3 中的染色 C 96 孔板在 680 x g 条件下离心 g 3 分钟 4 °C添加 200 µL 加入TIL完全培养基（RPMI 1640，10 mM HEPES [pH 7]，10% FBS）至每孔。将含有细胞悬液的培养板保存于 4 °C 过夜。
      2. 次日清晨，稀释细胞刺激剂（参见 材料表) 1:500 加入完全TIL培养基中。将含有细胞悬液的培养板于680 x g 离心收集细胞并弃去上清液。用培养基重悬细胞 200 µL 制备好的细胞刺激混合液，并于 37 °C 1小时。
      3. 添加 25 µL 含莫能菌素的蛋白转运抑制剂溶液以1:1,000比例加入完全TIL培养基中，混匀细胞后于 37 °C 再孵育4小时，以促进细胞内细胞因子的积累。
    5. 进行细胞染色。
      1. 对于染色A和染色B（第1天），以及染色C（第2天），在680 x g下离心 g 3 分钟 4 °C轻敲培养板，向各孔中加入适量的活细胞染料。使用多通道移液器轻轻吹打混匀，室温避光孵育15分钟。
      2. 离心培养板（同步骤 7.1.5.1），然后向培养板中加入适当的表面染料，使用多通道移液器轻轻吹打混匀。在 37 °C 下孵育 15 分钟 4 °C 再次离心。轻弹培养板，用移液器轻轻吹打细胞进行洗涤。 150 µL SB的溶液，离心。
      3. 轻弹培养板，通过轻轻吹打洗涤液上下混合重复洗涤 150 µL SB 的，并在 680 × g 下离心 3 分钟 4 °C对于染色A，根据染色工作表上注明的体积，将每组组织重悬于相应体积的溶液中，并储存于 4 °C。对于染色B，使用FoxP3转录因子检测试剂盒中的固定剂进行固定（参见 材料表) 在室温下孵育30分钟。对于染色C，用含1% (v/v) 多聚甲醛的SB缓冲液在室温下固定30分钟。
      4. 将固定后的培养板在480 x g下离心 g 3 分钟 4 °C用SB缓冲液洗涤1次。对于染色B，细胞可置于室温过夜。
      5. 透化细胞：将各孔中的细胞重悬于 150 µL FoxP3转录因子检测试剂盒的破膜缓冲液用于染色B，以及在SB中加入0.5%（w/v）皂苷用于染色C。室温孵育15分钟。将固定后的板在480 x g 3 分钟 4 °C.
      6. 轻弹培养板，分别加入用于染色B和染色C的细胞内染色缓冲液。室温孵育30分钟。
      7. 将固定后的培养板在480 x g下离心 g 3 分钟 4 °C 并轻敲培养板。用缓冲液洗涤细胞 150 µL 对应破膜缓冲液（染色B：FoxP3转录因子检测试剂盒破膜缓冲液；染色C：皂苷）
      8. 轻弹培养板，并通过上下吹打进行洗涤 150 µL SB的离心条件为480 × g 3 分钟 4 °C轻弹培养板，根据染色工作表上注明的相应体积，按组织组别用SB重悬细胞。
        注意：样本现已准备好用于光谱流式细胞术检测。
      9. 设置流式细胞仪（参见 材料表) 使用每种染色对应的单染对照以及每种组织组的未染色样本，以校正解混过程中自发荧光的差异。根据染色工作表中定义的参数，采集每种组织组所需的适当体积。表2）并导出 .fcs 文件。
  2. 流式细胞术数据分析
    1. 使用流式细胞术分析软件（参见 材料表），创建一个新的工作区。为每个器官（LN、脾脏和TIL）创建新的分组。将每个器官的.fcs文件导入相应的分组中。
    2. 创建双变量点图，设置坐标轴为（FSC-A × SSC-A），对细胞事件应用多边形门控，避开边缘事件（全细胞门）。选择细胞事件，将坐标轴更改为（FSC-A × FSC-H），对位于线性对角线上的事件应用多边形门控，排除偏离对角线的事件，生成“单细胞”门。选择“单细胞”门，将坐标轴更改为（hCD45 × mCD45），对hCD45和mCD45阳性事件分别应用多边形门控，并将其命名为“人源”和“鼠源”。
    3. 选择人细胞群体，并将Y轴改为Live/Dead Aqua。对Live/Dead阴性、hCD45阳性群体应用多边形门控，命名为“活人细胞”。选择小鼠细胞群体，并将X轴改为Live/Dead Aqua。对Live/Dead阴性、mCD45阳性群体应用多边形门控，命名为“活小鼠细胞”。
    4. 以类似方式，根据“常规流式A设门”、“光谱流式B设门”和“常规流式C设门”工作表中所述，选择父门以及X轴和Y轴表 2) 以分离指定的细胞群（例如，人B细胞、活化T细胞）。
      注：每种染色（渗漏、A、B、C）的代表性设门示意图已包含在内 补充文件 2。
    5. 在流式细胞术分析软件中为所有细胞群创建计数和频率导出表格，并导出至电子表格软件。频率分析的父代细胞群在下文中标明 表 2.
    6. 根据实验处理组的数据生成图表。
      注意：数据也可使用分析软件中的 R 软件包进行分析。可利用拼接功能将所有待分析样本生成一个 .fcs 文件。该数据可通过 t-SNE 算法进行降维处理，同时添加组织类型和处理组别的关键词参数。随后可使用 FlowSOM 算法对细胞群进行聚类，并利用 ClusterExplorer 工具识别不同细胞群。通过此方法可鉴定出新的细胞群体，并在不同处理组之间或不同组织内进行可视化比较和定量分析。
    7. 将同一治疗组内肿瘤的免疫参数与其肿瘤生长情况相关联，以定义与肿瘤生长抑制相关的免疫类型。通过该肿瘤的特定生长率（SGR）来量化肿瘤生长，SGR是一种考虑了在特定时间内肿瘤体积变化的测量指标。该指标可校正因小鼠健康状况和治疗起始时间不同而在不同时间点收获肿瘤所导致的差异。
      静态生长率公式，使用自然对数计算SGR；用于科学分析的方程。

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结果

遵循 flank 肿瘤实验方案及实验时间线（图1），在两种不同的人源结直肠癌（CRC）PDX模型中研究了肿瘤生长及对靶向酪氨酸激酶抑制剂（TKI）联合纳武利尤单抗治疗的免疫应答。既往TKI药物仅在免疫缺陷宿主中进行研究，以评估肿瘤生长情况29该模型可用于研究单独使用TKI以及更重要的是联合抗PD-1治疗时免疫反应的变化。本研究重点关注两个不同实验中接受联合治疗的队列，这两个实验分别代表了利用HIS-BRGS小鼠进行的成功评估和一项存在技术缺陷的实验。对于PDX CRC307P模型，联合治疗通过随时间测定的肿瘤生长体积、收获时的肿瘤重量以及SGR指标，显示出对肿瘤生长的抑制作用。图2A-C）。另一方面，在另一组HIS-BRGS小鼠中测试的、源自同一位患者转移性肿瘤的PDX模型CRC307M的生长，受到相同联合治疗的影响较小（图 2D).

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讨论

在过去的6年中，凭借我们在免疫学和人源化小鼠领域的专业知识，我们的研究团队开发出一种亟需的临床前模型，可用于在多种人类肿瘤上测试免疫疗法3,7,30,31本方案强调考虑模型的变异性，特别关注以免疫治疗为中心的人源T细胞群体。本文详细描述了人源化免疫系统小鼠（HIS小鼠）的构建方法，以及对其淋巴器官和肿瘤组织的免疫学分析。方案中还包含了适用于传统补偿型流式细胞仪和光谱流式细胞仪的流式细胞术检测流程。该临床前模型的重要优势在于能够检测大体积肿瘤样本及外周组织中免疫系统的动态变化。该系统的另一优势在于，可将携带相同独特人源肿瘤的多只小鼠分配至不同实验组，接受不同组合的免疫治疗药物处理，从而实现实质上的 "微型" 药物试验。综合而言，这两个因素使得研究人员能够深入探究拟议的（联合）免疫疗法的作用机制及耐药机制。该模型可用于在多种人类肿瘤中测试各种免疫靶向治疗方案的药物给药时机...

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致谢

我们感谢动物研究设施（OLAR）对我们小鼠的悉心照料，同时也感谢本研究所癌症中心支持基金（P30CA046934）资助的流式细胞术共享资源在我们所有工作中提供的巨大帮助。我们还要感谢Gail Eckhardt和Anna Capasso，她们在我们最初开展的关于HIS-BRGS模型中人源PDX免疫疗法研究的合作中给予了支持。 本研究部分得到了美国国立卫生研究院癌症中心支持基金P30CA06934的资助，并使用了其中的PHISM（临床前人免疫系统小鼠模型）共享资源（RRID: SCR_021990）和流式细胞术共享资源（RRID: SCR_022035）。 本研究部分得到了美国国立卫生研究院NIAID根据合同编号75N93020C00058提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mL 注射器配针头McKesson1031815
15 mL 离心管Grenier Bio-One188271
2-巯基乙醇SigmaM6250
50 mL 离心管Grenier Bio-One227261
AutoMACS Pro 分离仪Miltenyi130-092-545
BD Golgi Stop 蛋白转运抑制剂（含莫能菌素）BD生物科学BDB563792
BSAFisher ScientificBP1600100
细胞刺激混合液Life Technologies509305
Chill 15 样品架Miltenyi130-092-952
带棉塞的玻璃移液管Fisher Scientific13-678-8B
Cultrex 基底膜提取物R&D Systems363200502
Cytek AuroraCytek
DNaseSigma9003-98-9
eBioscience FoxP3/转录因子染色缓冲液套装Invitrogen00-5523-00
胚胎干细胞 FCSGibco10439001
Eppendorf管；1.5 mL体积Grenier Bio-One616201
Excel微软
FBS基准测试100-106 500 mL
Ficoll HypaqueGE Healthcare45001752
FlowJo 软件BD 生物科学
镊子 - 精细Roboz Surgical RS5045
普通镊子DumontRS4919
甲醛FisherF75P1GAL
磨砂玻璃片康宁1255310
Gentlemacs C-TubesMiltenyi   130-096-334
GentleMACS 组织解离仪Miltenyi130-093-235
玻璃移液管DWK生命科学63A53
GlutamaxGibco11140050
含钙 HBSS &和 MgSigma55037C
HEPES康宁MT25060CI
IgG 标准品SigmaI2511
IgM 标准品Sigma401108
IMDMGibco12440053
Liberase DL罗氏5466202001
LIVE/DEAD 可固定蓝色染料赛默飞世尔科技L23105
MDA-MB-231ATCCHTB-26
MEMGibco1140050
小鼠抗人 IgG-APSouthern BiotechJDC-10
小鼠抗人IgG-未标记Southern BiotechH2
小鼠抗人IgM-APSouthern BiotechUHB
小鼠抗人IgM-未标记Southern BiotechSA-DA4
MultiRad 350精准X射线
PBS康宁45000-446
青霉素-链霉素Gibco15140122
培养皿Fisher ScientificFB0875713A
对硝基苯基底物赛默飞世尔科技34045
PRISMGraphpad
重组人 FLT3LR&D系统308-FK-005/CF
重组人IL6R&D系统206-IL-010/CF
重组人SCFR&D 系统255SC010
RPMI 1640康宁45000-39
皂苷Sigma8047-15-2
剪刀McKesson862945
25 mL 血清移液管Fisher Scientific1367811
无菌滤器Nalgene567-0020
无菌分子水Sigma7732-18-5
Yeti 细胞分析仪伯乐（Bio-Rad）12004279
Zombie Greenbiolegend423112

参考文献

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Formal Correction: Erratum: Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors
Posted by JoVE Editors on 5/25/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors. The Authors section was updated from:

Jordi M. Lanis1
Matthew S. Lewis1
Hannah Strassburger1
Stacey M. Bagby2
Adrian T. A. Dominguez2
Juan A. Marín-Jiménez3
Roberta Pelanda1
Todd M. Pitts2
Julie Lang1
1Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
2Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
3Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L’Hospitalet)

to:

Jordi M. Lanis1
Matthew S. Lewis1
Hannah Strassburger1
Kristina Larsen1
Stacey M. Bagby2
Adrian T. A. Dominguez2
Juan A. Marín-Jiménez3
Roberta Pelanda1
Todd M. Pitts2
Julie Lang1
1Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
2Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
3Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L’Hospitalet)

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