本实验方案描述了一种方法，可用于对在植物质外体中生长的Pseudomonas syringae群体进行单细胞基因表达分析。
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方法文章
单细胞表达分析 Pseudomonas syringae 植物组织中的基因
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摘要
摘要
大量致病性微生物持续攻击植物。Pseudomonas syringae 物种复合体包含多种对众多宿主具有特殊重要性的革兰氏阴性植物病原菌。P. syringae 从叶片表面侵入植物，并在质外体中迅速增殖，形成占据细胞间隙的微菌落。通过细菌组成型表达荧光蛋白，可在显微水平下可视化观察这些微菌落并监测感染进程。近年来单细胞分析技术的进步揭示了克隆同基因型细菌群体所达到的高度复杂性。这种被称为表型异质性的复杂性，源于细菌群体中个体细胞间基因表达的差异（与遗传差异无关）。为了在单细胞水平上分析特定基因座的表达，转录融合荧光蛋白的方法已被广泛应用。在胁迫条件下（例如植物质外体定殖过程中所遇到的环境），P. syringae 会根据关键毒力基因（如Hrp III型分泌系统）的异质性表达分化为不同的亚群体。然而，由于接种及细菌提取过程中机械破碎会释放大量细胞碎片，从植物组织中回收的任何特定 P. syringae 群体的单细胞分析均面临挑战。本报告详细描述了一种用于监测 P. syringae 在拟南芥和菜豆植株定殖过程中目标基因在单细胞水平上表达情况的方法。文中介绍了使用真空室进行植物准备及制备接种用细菌悬浮液的步骤，同时也说明了通过提取质外体液从感病叶片中回收内生细菌的方法。该细菌接种与提取方法均经过经验性优化，以最大程度减少植物和细菌细胞的损伤，从而获得适用于显微观察和流式细胞术分析的理想细菌样品。
引言
致病菌在多种表型上表现出差异，从而导致遗传背景相同的种群内形成亚群。这一现象被称为表型异质性，被认为是在细菌与宿主相互作用过程中的一种适应性策略1。近年来，共聚焦显微镜的光学分辨率、流式细胞术和微流控技术的进步，结合荧光蛋白的应用，推动了对细菌种群的单细胞水平分析2。
革兰氏阴性菌Pseudomonas syringae因其重要的学术和经济价值，是典型的植物病原细菌3。P. syringae的生命周期与水循环密切相关4。P. syringae通过气孔或伤口等自然开口进入叶肉细胞之间的细胞间隙，即植物叶片的质外体5。一旦进入质外体，P. syringae便依赖III型分泌系统（T3SS）以及III型分泌效应子（T3E）来抑制植物免疫反应，并操控植物细胞功能以利于病原菌的生存与繁殖6。T3SS和T3E的表达依赖于主调控因子HrpL，该因子是一种替代σ因子，可结合至靶基因启动子区域的hrp-box序列上，从而启动相关基因的转录7。
通过在目标基因下游构建染色体定位的荧光蛋白基因转录融合，可以在单细胞水平上根据荧光强度监测基因表达8。利用该方法已证实，hrpL基因的表达在实验室培养的细菌群体中以及从植物质外体回收的细菌群体中均呈现异质性8,9。尽管单细胞水平的基因表达分析通常在实验室培养基中生长的细菌培养物中进行，但此类分析也可在植物体内生长的细菌群体中实施，从而提供有关自然环境下亚群形成的宝贵信息。从植物中提取细菌群体进行分析的一个潜在局限在于，传统的通过注射器加压浸润将菌液注入质外体，随后通过研磨叶片组织提取细菌的方法，通常会产生大量植物细胞碎片，干扰后续分析10。这些细胞碎片大多为具有自发荧光的叶绿体片段，其荧光信号与GFP荧光重叠，导致结果产生误导。
本实验方案描述了在两个模式病害系统中分析单细胞基因表达异质性的过程：其一是由丁香假单胞菌番茄致病变种（P. syringae pv. tomato）菌株DC3000与拟南芥（Arabidopsis thaliana，Col-0）组成的系统，另一个是由丁香假单胞菌菜豆致病变种（P. syringae pv. phaseolicola）菌株1448A与菜豆（Phaseolus vulgaris 品种 Canadian Wonder）植株组成的系统。本方案提出一种基于真空室和真空泵的真空浸润接种方法，可快速且无损伤地实现整片叶片的浸润。此外，相较于传统实验流程，本方案采用了一种更为温和的方法从质外体提取细菌群体，显著减少了组织破坏；该方法通过注射器内施加正负压力循环，利用少量液体提取质外体液。
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方案
1. 植物准备
- 按照以下步骤准备拟南芥Col-0植株。
- 将蛭石与植物基质按1:3比例混合（见材料表），预先润湿后填入直径10 cm的花盆中，并用一块1.6 mm × 1.6 mm孔径的15 cm × 15 cm金属网覆盖花盆。用橡皮筋将金属网固定在湿润的土壤表面（图1A）。
- 用湿润的牙签将拟南芥种子播入金属网的孔洞中。在花盆内相距较远的位置各放入3至4粒种子（图1B、C）。
- 用塑料罩盖住花盆以维持较高的相对湿度，并在4 °C下黑暗处理72小时进行春化处理。
注：春化处理（如上所述在高湿度和低温条件下孵育）可提高种子的萌发率和同步性。 - 将花盆转移至植物培养箱中，在短日照条件下培养（8小时光照/16小时黑暗，21 °C，光照强度：100 µmol·m−2·s−1，相对湿度：70%）。
- 种子萌发后（8–10天），使用镊子去除大部分幼苗，仅在花盆的每个播种位置保留一株幼苗（共六株/盆）（图1D）。移除塑料罩以暴露花盆。
注：植株在萌发后4–5周即可用于实验。
- 准备菜豆Phaseolus vulgaris（品种Canadian Wonder）植株。
- 在培养皿底部铺一张湿润的纸巾，将菜豆种子放置其上。用医用胶带密封培养皿，并在28 °C下孵育3–4天（图2A）。
- 将已萌发的种子转移至装有湿润蛭石与植物基质（1:3）混合物的直径10 cm花盆中。
- 在植物培养箱中长日照条件下孵育（16小时光照/8小时黑暗，23 °C，光照强度：100 µmol·m−2·s−1，相对湿度：70%）。
注：植株在萌发后10天即可用于实验（图2B）。
2. 拟南芥和豆科植物的接种
注意：在本研究中，菌株 P. syringae pv.番茄DC3000和 P. syringae pv. phaseolicola 1448A 被使用。
- 准备P. syringae接种液。
- 从−80 °C甘油保藏菌种中挑取目标P. syringae菌株，划线接种于LB平板（含10 g/L胰蛋白胨、5 g/L NaCl、5 g/L酵母提取物和16 g/L细菌琼脂，参见材料表），并添加适当的抗生素。在28 °C下培养40–48小时。
注：若目标菌株携带质粒或基因组抗性基因，建议使用抗生素。P. syringae推荐使用的抗生素浓度如下：卡那霉素（15 µg/mL）、庆大霉素（10 µg/mL）、氨苄青霉素（300 µg/mL）（参见材料表）。 - 刮取细菌生物量，悬浮于5 mL 10 mM MgCl2溶液中。测定OD600 值，并用10 mM MgCl2调节至0.1。
注：P. syringae菌液的OD600 值为0.1时，相当于5 × 107 CFU·mL−1。 - 用10 mM MgCl2 进行系列稀释，使最终接种液浓度达到5 × 105 CFU·mL−1。为拟南芥植株准备200 mL接种液，为菜豆植株准备50 mL接种液。
- 接种前立即加入表面活性剂Silwett L-77（参见材料表），菜豆接种时终浓度为0.02%，拟南芥接种时为0.01%。注意Silwett对拟南芥组织有一定不利影响。
- 从−80 °C甘油保藏菌种中挑取目标P. syringae菌株，划线接种于LB平板（含10 g/L胰蛋白胨、5 g/L NaCl、5 g/L酵母提取物和16 g/L细菌琼脂，参见材料表），并添加适当的抗生素。在28 °C下培养40–48小时。
- 进行真空渗透。
- 进行拟南芥渗透时，在花盆上方交叉放置两根木棍（图1E），将花盆倒置在直径14 cm、盛有200 mL接种液的培养皿上（图1F）。
- 对菜豆叶片进行接种时，将叶片放入盛有接种液的50 mL锥形离心管中（图2C）。
- 将浸没在接种液中的植株置于真空室中（图1G和图2D），施加500 mbar真空脉冲30秒，使叶片充分渗透。重复抽真空2–3次，直至叶片完全渗透（图1H和图2E）。
- 用滤纸吸除多余的接种液，然后将植株放回相应的生长培养箱中。
3. 从植物胞间空间提取细菌
- 接种后第四天，剪下拟南芥植株的地上部分或菜豆植株的接种叶片，并将其放入一支无针头的20 mL注射器中（图2G）。对于菜豆叶片，将其卷起，使远轴面朝外，如图2F所示。
- 加入足量蒸馏水以浸没组织（通常为10–15 mL）。
- 插入活塞，将注射器垂直放置，针头端朝上，轻轻敲击筒壁以排出注射器内的多余空气和气泡，使所有空气聚集在针头附近。然后推动活塞将空气排出。当注射器内空气尽可能少时，用石蜡膜封住注射器前端。
- 缓慢按压活塞以产生正压，直至组织颜色变深（图1I和图2H）。随后拉动活塞以产生负压（图1J和图2I）。重复此步骤3–5次。
- 取下石蜡膜和活塞，收集含有从质外体提取的细菌的液体，如图2J所示。
4. 胞外溶质提取细菌的单细胞分析
- 按照以下步骤通过共聚焦显微镜进行观察。
- 用蒸馏水配制1.5%的琼脂糖溶液。待完全融化后，取适量体积填充在并排放置的两张显微镜载玻片之间的空隙，并在其上方再放置一张载玻片（图3）。静置干燥15分钟，然后小心移除最上方的载玻片。使用刀片在使用前将琼脂糖垫切成5 mm × 5 mm的小片。
- 同时，将1 mL从质外体提取的细菌在室温下以12,000 × g 离心1分钟，用移液器小心吸除上清液，并将沉淀重悬于20 µL水中以浓缩细胞。取2 µL浓缩后的细胞悬液滴加到厚度为0.17 mm的盖玻片上，然后用步骤1中制备的5 mm × 5 mm琼脂糖小片覆盖液滴，如图3所示。
- 在共聚焦显微镜下观察细菌样品（见材料表）。为识别绿色荧光细菌，使用488 nm激发激光，并采用500 nm至550 nm的发射滤光片。为识别所有细菌，使用明场成像，并将明场与荧光图像合并。
- 使用Fiji软件处理共聚焦图像（见材料表）。具体操作时，使用MicrobeJ插件识别细菌细胞的轮廓，并测量其内部的荧光强度。
注：建议选择孤立（非聚集）的细菌进行图像采集以用于此分析。
- 通过流式细胞术进行分析。
- 取一份从质外体提取的细菌悬液，用于流式细胞仪分析。采集100,000个事件。
- 为区分细菌与植物碎片，需分析未接种植物质外体的提取物，并将其前向散射（FSC）细胞大小与侧向散射（SSC）细胞大小的散点图与质外体提取的细菌悬液的相应图谱进行比较。为识别非荧光细菌，应使用接种了非荧光同基因型细菌的植物质外体提取物，并比较其荧光信号。
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结果
III型分泌系统的表达对于细菌在植物体内的生长至关重要。T3SS基因的适时表达通过复杂的调控机制实现，其核心是胞外功能（ECF）σ因子HrpL，它是激活T3SS相关基因表达的关键调控因子。11. 表达分析的 hrpL 此前采用位于染色体上的转录融合，连接至下游无启动子的 gfp 基因，并通过共聚焦显微镜和流式细胞术追踪其表达模式9这些融合是通过同源重组介导的质粒编码结构整合而生成的，该结构通过PCR和传统克隆方法构建，包含目的基因开放阅读框（ORF）的最后500个碱基对（包括终止密码子）以及紧随其后的下游序列500个碱基对，这些序列侧翼位于核糖体结合位点和将要使用的荧光报告基因的开放阅读框两侧（在本例中， GFP），随后是一个抗生素抗性盒（在此情况下，为 NPT2 基因赋予卡那霉素抗性）。因此，已确定从质外体提取的 P. syringae 表达与III型分泌系统（T3SS）相关基因的群体，包括 hrpL，是异质的 活体植株中
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讨论
本文所述方法是一种非侵入性操作，可实现细菌向植物叶片组织的渗透，从而在尽量减少组织损伤的同时快速接种大量样品。P. syringae 物种复合体的特征之一是能够在植物胞间空间内以及植物表面作为附生菌存活和增殖14。因此，不能排除使用本方案提取的细菌仅来源于植物胞间空间的可能性。然而，先前已有研究通过共聚焦显微镜证实，与植物叶片内部的细菌生长量相比，叶片表面的细菌所占比例明显极低5。这一点可在提取前通过显微镜检查叶片表面加以验证。此外，本方案中用作模型的 P. syringae 菌株 Pto DC3000 和 Pph 1448A 已被证明附生能力较弱15，在所提取的细菌中仅占可忽略的比例。尽管如此，若将该方法应用于其他病害系统，则可能需要在本方案中增加叶片表面去污染的预处理步骤。
传统的接种方法，例如使用注射器进行叶片浸润16，会在接种位点造成较大且难以估量的...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由MCIN/AEI/10.13039/501100011033/资助的项目RTI2018-095069-B-I00以及"欧洲区域发展基金，欧洲发展之路"支持。J.S.R. 由安达卢西亚研究、发展与创新计划（PAIDI 2020）资助。N.L.P. 由安达卢西亚研究、发展与创新计划项目资助P18-RT-2398资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.17 mm 盖玻片 | 无特殊要求 | ||
| 1.6 x 1.6 mm 金属网 | Buzifu | 玻璃纤维筛网 | |
| 直径 10 cm 的花盆 | 无特殊要求 | ||
| 140 mm 培养皿 | 无特殊要求 | ||
| 20 mL 注射器 | 无特殊要求 | ||
| 50 mL 锥形管 | Sarstedt | ||
| 琼脂糖 | Merk | ||
| 氨苄青霉素钠 | GoldBio | ||
| 细菌学琼脂 | Roko | ||
| 共聚焦显微镜 Stellaris | Leica Microsystems | ||
| FACSVerse 细胞分析仪 | BD Biosciences | ||
| Fiji 软件 | |||
| 硫酸庆大霉素 | Duchefa | G-0124 | |
| 硫酸卡那霉素 | Phytotechnology | K378 | |
| MgCl2 | Merk | ||
| NaCl | Merk | ||
| Parafilm 封口膜 | Pechiney Plastic Packaging | ||
| 植物基质 | 无特殊要求 | ||
| Silwet L-77 | Cromton Europe Ltd | ||
| 牙签 | 无特殊要求 | ||
| 胰蛋白胨 | Merk | ||
| 镊子 | 无特殊要求 | ||
| 直径 25 cm 真空室 | Kartell | 554 | |
| 真空泵 | GAST | DOA-P504-BN | |
| 蛭石 | 无特殊要求 | ||
| 酵母提取物 | Merk |
参考文献
- Weigel, W. A., Dersch, P. Phenotypic heterogeneity: A bacterial virulence strategy. Microbes and Infection. 20 (9-10), 570-577 (2018).
- Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters. Microorganisms. 9 (11), 2277(2021).
- Mansfield, J., et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (6), 614-629 (2012).
- Morris, C. E., et al. The life history of the plant pathogen Pseudomonas syringae is linked to the water cycle. The ISME Journal. 2 (3), 321-334 (2008).
- Rufián, J. S., et al. Confocal microscopy reveals in planta dynamic interactions between pathogenic, avirulent and non-pathogenic Pseudomonas syringae strains. Molecular Plant Pathology. 19 (3), 537-551 (2018).
- Macho, A. P. Subversion of plant cellular functions by bacterial type-III effectors: Beyond suppression of immunity. New Phytologist. 210 (1), 51-57 (2016).
- Xiao, Y., Hutcheson, S. W. A single promoter sequence recognized by a newly identified alternate sigma factor directs expression of pathogenicity and host range determinants in Pseudomonas syringae. Journal of Bacteriology. 176 (10), 3089-3091 (1994).
- Rufián, J. S., et al. Generating chromosome-located transcriptional fusions to fluorescent proteins for single-cell gene expression analysis in Pseudomonas syringae. Methods in Molecular Biology. 1734, 183-199 (2018).
- Rufian, J. S., et al. Pseudomonas syringae differentiates into phenotypically distinct subpopulations during colonization of a plant host. Environmental Microbiology. 18 (10), 3593-3605 (2016).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. Arabidopsis Book. 1, 0039(2002).
- Fouts, D. E., et al. Genomewide identification of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 promoters controlled by the HrpL alternative sigma factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2275-2280 (2002).
- Huber, P. J. Robust Statistics. , Wiley. New York, NY. (1981).
- Freed, N. E., et al. A simple screen to identify promoters conferring high levels of phenotypic noise. PLoS Genetics. 4 (12), 1000307(2008).
- Hirano, S. S., Upper, C. D. Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on Pseudomonas syringae-a pathogen, ice nucleus, and epiphyte. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (3), 624-653 (2000).
- Lindeberg, M., Myers, C. R., Collmer, A., Schneider, D. J. Roadmap to new virulence determinants in Pseudomonas syringae: Insights from comparative genomics and genome organization. Molecular Plant Microbe Interactions. 21 (6), 685-700 (2008).
- Liu, X., et al. Bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae pathosystem. Journal of Visualized Experiments. (104), e53364(2015).
- O'Leary, B. M., Rico, A., McCraw, S., Fones, H. N., Preston, G. M. The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using Phaseolus vulgaris as an example. Journal of Visualized Experiments. (94), e52113(2014).
- Tornero, P., Dangl, J. L. A high-throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 28 (4), 475-481 (2001).
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