丁香假单胞菌基因在植物组织中表达的单细胞分析

摘要

本协议描述了一种方法，该方法允许对植物质外体内生长的丁 香假单胞菌 种群进行单细胞基因表达分析。

摘要

大量的病原微生物不断攻击植物。 丁香假单胞 菌物种复合体包括与多种宿主特别相关的革兰氏阴性植物致病菌。 丁香假单胞 菌从叶表面进入植物，并在质外体内迅速繁殖，形成占据细胞间隙的微菌落。细菌对荧光蛋白的组成性表达允许微菌落的可视化和在微观水平上监测感染的发展。单细胞分析的最新进展揭示了克隆同基因细菌群体所达到的巨大复杂性。这种复杂性被称为表型异质性，是细菌群落之间基因表达的细胞间差异（与遗传差异无关）的结果。为了在单细胞水平上分析单个位点的表达，荧光蛋白的转录融合已被广泛使用。在胁迫条件下，例如在植物质外体定植期间发生的条件， 丁香假单胞菌 根据关键毒力基因（即 Hrp III 型分泌系统）的异质表达分化为不同的亚群。然而，由于接种和细菌提取过程中固有的机械破坏过程中释放的细胞碎片，因此对从植物组织回收的任何给定丁 香假单胞菌 种群的单细胞分析具有挑战性。本报告详细介绍了一种在拟南芥和豆类植物定植期间在单细胞水平上监测感兴趣的 丁香假单胞菌 基因表达的方法。描述了植物的制备和用于使用真空室接种的细菌悬浮液。这里还解释了通过质外体液提取从感染叶片中回收内生细菌的方法。细菌接种和细菌提取方法均经过经验优化，以最大限度地减少植物和细菌细胞损伤，从而产生最适合显微镜和流式细胞术分析的细菌制剂。

引言

致病菌在不同表型中表现出差异，导致在基因相同的种群中形成亚群。这种现象被称为表型异质性，并已被提出作为细菌-宿主相互作用期间的适应策略¹。共聚焦显微镜、流式细胞术和微流体的光学分辨率与荧光蛋白相结合的最新进展促进了细菌种群的单细胞分析²。

革兰氏阴性丁香假单胞菌是一种原型植物致病菌，由于其学术^{和经济重要性3}。丁香假单胞菌的生命周期与水循环⁴有关。丁香假单胞菌通过气孔或伤口等自然孔径进入叶肉细胞之间的细胞间空间，即植物叶质外体^5。一旦进入质外体，丁香假单胞菌依靠III型分泌系统（T3SS）和III型易位效应器（T3E）来抑制植物免疫并操纵植物细胞功能以造福病原体⁶。T3SS和T3E的表达取决于主调节因子HrpL，这是一种与^靶基因7启动子区域中hrp盒基序结合的替代西格玛因子。

通过产生与目的基因下游荧光蛋白基因的染色体定位转录融合，可以根据单细胞水平⁸发射的荧光水平监测基因表达。使用这种方法，已经确定 hrpL 的表达在实验室中生长的细菌培养物和从植物质外体^8，9中回收的细菌种群中都是异质的。虽然单细胞水平的基因表达分析通常在实验室培养基中生长的细菌培养物中进行，但这种分析也可以对植物内生长的细菌种群进行，从而为自然环境中亚群的形成提供有价值的信息。分析从植物中提取的细菌种群的潜在限制是，经典的接种方法通过注射器压力浸润到质外体中，然后通过浸渍叶组织进行细菌提取，通常会产生大量干扰下游分析的细胞植物碎片¹⁰。大多数细胞碎片由叶绿体的自发荧光片段组成，这些片段与GFP荧光重叠，导致误导性结果。

本协议描述了分析两个模型病理系统中单细胞基因表达异质性的过程:由 丁香假单胞菌 pv形成的病理系统。番茄菌株DC3000和 拟南芥 （Col-0），另一种由 丁香假单胞 菌PV组成。菜豆菌株1448A和豆类植物（菜豆 品种加拿大奇迹）。提出了一种基于真空渗透的接种方法，利用真空室和泵，形成了一种快速、无损的全叶浸润方法。此外，作为对传统方案的改进，使用一种更温和的方法从质外体中提取细菌群，从而显着减少组织破坏，基于通过在注射器内使用少量体积施加正压和负压循环来提取质外体液。

方案

1. 植物准备

1. 按照以下步骤准备拟南芥 Col-0 植物。
   1. 用先前浇水的1:3蛭石 - 植物基质混合物（见 材料表）填充直径10厘米的花盆，并用15厘米x 15厘米的金属网覆盖花盆，并带有1.6毫米x 1.6毫米的孔。使用橡皮筋将金属网调整到潮湿的土壤上（图1A）。
   2. 用湿牙签将拟南芥种子播种到金属网的孔中。将三到四颗种子放在花盆内远处（图1B，C）。
   3. 用塑料圆顶覆盖花盆以保持高相对湿度，并在4°C下孵育72小时以进行分层。
      注意:分层（如上所述在高湿度和低温下孵育）提高了种子的发芽率和同步性。
   4. 在短日照条件下（21°C下8小时光照/ 16小时黑暗，光强度:100μmol·m⁻²·^s-1，相对湿度:70%）将花盆转移到植物生长室中。
   5. 种子发芽（8-10天）后，使用镊子去除大部分幼苗，在花盆的每个位置保留一株幼苗（六株/盆）（图1D）。取下塑料圆顶以揭开花盆。
      注意:植物将在发芽后 4-5 周即可使用。
2. 准备 菜豆 （品种加拿大奇迹）植物。
   1. 用一张湿毛巾纸盖住培养皿的底部，然后将豆子放在上面。用手术胶带密封培养皿，并在28°C孵育3-4天（图2A）。
   2. 将发芽的种子转移到直径10厘米的盆中，盆中装满湿的1:3蛭石 - 植物基质混合物。
   3. 在植物生长室中孵育，在长日照设置下（23°C下16小时光照/ 8小时黑暗，光强度:100μmol·m⁻²·^s-1，相对湿度:70%）。
      注意:植物将在发芽后 10 天即可使用（图 2B）。

2. 拟南芥和豆类植物的接种

注意:在本研究中，菌株 P. 丁香科 pv. 番茄DC3000和 丁香假单 胞菌 pv.使用菜豆1448A。

1. 准备 丁香假单胞菌 接种物。
   1. 将感兴趣的 丁香假单胞菌菌 株从-80°C甘油原液中划出到补充有适当抗生素的LB平板（10 g / L胰蛋白胨，5 g / L NaCl，5 g / L酵母提取物和16 g / L细菌琼脂，参见 材料表）上。在28°C孵育40-48小时。
      注意:如果感兴趣的菌株携带质粒或基因组抗性基因，则建议使用抗生素。 丁香假单胞 菌的推荐抗生素浓度如下:卡那霉素（15微克/毫升）、庆大霉素（10微克/毫升）、氨苄青霉素（300微克/毫升）（见 材料表）。
   2. 刮出细菌生物质并重悬于 5 mL 的 10 mM MgCl₂ 中。测量OD_{600并通过添加10} mM MgCl₂调整为0.1。
      注意:丁香假单胞菌培养物的 OD₆₀₀ 为 0.1 对应于 5 x 10⁷ CFU·mL⁻¹。
   3. 连续稀释到 10 mM MgCl₂ 中，以达到 5 x 10⁵ CFU·mL⁻¹ 的最终接种物浓度。为拟南芥植物准备 200 mL 接种物，为豆类植物准备 50 mL 接种物。
   4. 在接种前，加入表面活性剂Silwett L-77（见 材料表），豆类接种的终浓度为0.02%，拟南芥的终浓度为0.01%。请注意，Silwett对拟南芥组织有些有害。
2. 进行真空渗透。
   1. 对于拟南芥浸润，将两根形成X的木棍放在锅上（图1E），并将锅朝下放在含有200mL接种物的14厘米直径培养皿上（图1F）。
   2. 对于豆叶接种，将叶子引入含有接种物的 50 mL 锥形离心管中（图 2C）。
   3. 将浸入接种液中的植物插入真空室（图1G 和 图2D），并给予500毫巴的脉冲30秒以渗透叶子。重复真空脉冲2-3次，直到叶子完全浸润（图1H 和 图2E）。
   4. 用一张纸排出多余的接种液，然后将植物放回相应的生长室。

3. 从质外体中提取细菌

1. 接种四天后，切下拟南芥植物的地上部分或从豆类植物接种的叶子，并将其放入没有针头的20mL注射器中（图2G）。对于豆叶，将叶子卷在自己身上，使远轴面向外，如图 2F所示。
2. 加入足够体积的蒸馏水以覆盖组织（通常为 10-15 mL）。
3. 插入柱塞，并将注射器置于垂直位置，尖端朝上，通过轻轻敲击桶直到所有空气都位于尖端附近，去除注射器内多余的空气和气泡。然后滑动柱塞以排出空气。一旦注射器内的空气尽可能少，用石蜡膜覆盖注射器桶的尖端。
4. 小心地按压柱塞以产生正压，直到组织变暗（图1I 和 图2H）。然后，拉动柱塞以产生负压（图1J 和 图2I）。重复此步骤 3-5 次。
5. 除去石蜡膜和柱塞，收集含有质外体提取细菌的液体，如图 2J所示。

4. 质外体提取细菌的单细胞分析

1. 按照以下步骤通过共聚焦显微镜进行可视化。
   1. 在蒸馏水中制备1.5%琼脂糖溶液。融化后，添加足够的体积以填充并排放置的两个显微镜载玻片之间的空间，并将另一张载玻片放在其顶部（图3）。让它们干燥15分钟，然后小心地取出放置在顶部的载玻片。使用刀片，在使用前将琼脂糖垫切成 5 毫米 x 5 毫米的碎片。
   2. 同时，在室温下以 12，000 x g 离心 1 mL 的质外体提取的细菌 1 分钟，使用移液管小心地除去上清液，并将沉淀重悬于 20 μL 水中以浓缩细胞。将 2 μL 液滴浓缩细胞滴到 0.17 mm 盖玻片上，并用先前在步骤 1 中获得的 5 mm x 5 mm 琼脂糖垫片覆盖液滴，如图 3 所示。
   3. 在共聚焦显微镜下可视化细菌制备（见 材料表）。要识别绿色荧光细菌，请使用 488 nm 的激发激光和 500 nm 至 550 nm 的发射滤光片。要识别所有细菌，请使用明场并合并两个场。
   4. 使用斐济处理共聚焦图像（见 材料表）。为此，请使用MicrobeJ插件来识别细菌细胞的轮廓并测量其中的荧光强度。
      注意:建议从分离的细菌（非聚集）采集图像以进行此分析。
2. 通过流式细胞术进行分析。
   1. 取等分试样的质外体提取的细菌悬浮液，使用流式细胞仪进行分析。获取 100，000 个事件。
   2. 为了区分细菌和植物碎片，分析从未接种的植物中提取的质外体，并将显示其前向散射（FSC）细胞大小与侧向散射（SSC）细胞大小的点图与质外体提取的细菌悬浮液进行比较。为了鉴定非荧光细菌，请使用从接种非荧光等基因细菌的植物中提取的质外体并比较它们的荧光发射。

结果

III型分泌系统的表达对于植物内的细菌生长至关重要。T3SS基因的及时表达是通过复杂的调控实现的，其中心是卵胞浆外功能（ECF）西格玛因子HrpL，它是T3SS相关基因表达的关键激活因子¹¹。先前使用染色体定位转录融合到下游无启动子gfp基因并通过共聚焦显微镜和流式细胞术9跟踪表达模式对hrpL的表达^{进行分析。}这些融合是通过PCR和传统克隆产生的质粒编码构建体的同源重组介导整合产生的，并携带目的基因ORF的最后500个碱基对（包括STOP密码子）和序列的500个碱基对，紧邻要使用的核糖体结合位点和荧光报告基因的ORF（在这种情况下， GFP），然后是抗生素耐药盒（在这种情况下，NPT2基因赋予卡那霉素耐药性）。因此，确定质外体提取的丁香假单胞菌群体表达T3SS相关基因（包括hrpL）在植物9中是异质的。根据这一先例，在叶质外体定植后分别从豆或拟南芥的叶中提取的模型菌株 P...

讨论

这里介绍的方法描述了一种非侵入性程序，它允许细菌渗透到植物叶面组织中，允许快速接种大量，同时最大限度地减少组织破坏。 丁香假单胞菌 物种复合体的特征之一是能够在植物质外体内和植物表面作为附生植物¹⁴存活和增殖。因此，不能排除使用本协议提取的细菌仅来自植物质外体的可能性。然而，以前使用共聚焦显微镜证明，与植物叶片内的细菌生长相比，叶子表面的细菌比例明显^较小5。这可以通过提取前对叶子表面的显微镜检查来检查。此外，在本协议中用作模型的 丁香假单胞菌菌 株Pto DC3000和Pph 1448A已被证明具有弱附生¹⁵的性能，代表了提取细菌的不相关比例。尽管如此，如果要使该方法适应其他病理系统，则可能必须在本协议中添加叶表面净化的先前步骤。

传统的接种方法，例如使用注射器¹⁶浸润叶片，在接种部位引起较大且难以估计的组织损伤，导致组织坏死。此外，不同接种点之间的损伤量差...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.17 mm 盖玻片			无特殊要求
1.6 x 1.6 mm 金属网	Buzifu		玻璃纤维筛网
直径 10 cm 罐			无特殊要求
140 mm 培养皿			无特殊要求
20 mL 注射器			无特殊要求
50 mL 锥形管	Sarstedt
琼脂糖	Merk
氨苄青霉素钠	GoldBio
细菌琼脂	Roko
共聚焦显微镜 Stellaris	Leica Microsystems
FACS虚拟现实细胞分析仪	BD Biosciences
斐济软件
硫酸庆大霉素	Duchefa	G-0124
卡那霉素一硫酸盐	植物技术	K378
MgCl2	Merk
NaCl	Merk
Parafilm	Pechiney 塑料包装
厂基材			无特殊要求
Silwet L-77	Cromton Europe Ltd
牙签			无特殊要求
胰蛋白胨
镊子			无特殊要求
室 直径 25 cm	Kartell	554
真空泵	GAST	DOA-P504-BN
蛭石			无特殊要求
酵母提取物	Merk