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在老年人群中应用微创方法评估能量底物利用与昼夜节律

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DOI：

10.3791/64628

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2024年1月5日

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1Department of Physiology and Aging, University of Florida, 2Department of Clinical and Health Psychology, College of Public Health and Health Professions, University of Florida, 3Department of Health Outcomes and Bioinformatics, University of Florida

本文内容

摘要

本文介绍了一种新颖且微创的方案，利用外周血单个核细胞评估燃料利用与昼夜节律对老年人群的协同影响。

摘要

衰老伴随着多种生理变化，这些变化协同且独立地导致身体功能障碍以及慢性疾病风险的增加。尽管与年龄相关的身体功能障碍的病因复杂且为多因素所致，但线粒体功能的下降似乎与许多老年人功能衰退的进展相吻合。衰老过程中线粒体功能下降的原因仍不明确，但新兴科学表明，能量代谢和昼夜节律均可影响线粒体功能。

近期研究表明，昼夜节律会随着衰老而紊乱，而紊乱的昼夜节律会对线粒体功能产生病理影响，并与多种与年龄相关的慢性疾病重叠。目前用于直接评估线粒体功能的定量方法具有侵入性，通常需要进行肌肉活检，鉴于参与者对潜在疼痛和风险的担忧，这可能会影响受试者的招募和研究依从性。因此，本研究采用了一种创新且相对非侵入性的方案，用于评估老年人细胞水平的线粒体功能变化及其昼夜节律模式。具体而言，采用实时代谢通量分析仪，在不同底物供应条件下评估白细胞的线粒体生物能量功能。

还分析了白细胞中昼夜节律钟基因的表达，以与线粒体生物能量学及昼夜节律结果进行交叉相关性分析。这些创新的方法学手段有望为未来临床试验提供支持，通过提供微创方法来研究老年人群中线粒体底物偏好及昼夜节律特征。

引言

过去一个世纪的进步使得人类预期寿命延长，老年人口数量增加。展望未来，预计到2050年，美国65岁及以上成年人所占比例将比2020年上升5%1。然而，寿命的延长并不意味着健康寿命——即能够独立生活的生命阶段——也随之延长。事实上，衰老伴随着无数影响细胞代谢和生理功能的生物学变化，导致认知能力和身体功能逐渐下降2,3。随着人类预期寿命持续增加，如何在 aging 过程中维持功能能力和独立性变得愈发重要4。

长期以来人们已经认识到，随着年龄增长，身体功能和独立性的下降是多因素共同作用的结果，尽管这种情况通常与慢性疾病的发生以及急性诱发事件有关5。相反，已有研究表明，身体机能和肌肉特征的下降与年龄相关的功能障碍发展有关，而并非明确地与某一种特定疾病相关6。由于难以明确慢性疾病和身体功能障碍的确切病因，人们认为线粒体功能障碍可能与老年人慢性疾病的发生和发展以及身体功能的丧失同时出现7,8。

线粒体提供了大多数细胞过程所必需的三磷酸腺苷（ATP）9。 高氧化性组织依赖线粒体进行充分的能量生成；随着年龄增长，氧化能力及线粒体ATP合成能力下降。这种下降部分归因于线粒体DNA（mtDNA）受到的氧化损伤，从而导致mtDNA突变和缺失的逐步累积10。mtDNA突变和缺失的累积会导致功能性电子传递链蛋白的合成减少，进而使细胞产生ATP的能力降低。与年龄相关的线粒体功能下降在高氧化性组织中尤为显著，例如心脏和骨骼肌11。研究表明，与年轻样本相比，老年大鼠腓肠肌线粒体的ATP生成量和含量大约减少了50%12。此外，已有研究显示，人体骨骼肌中线粒体ATP生成能力每十年大约下降8%13。这些发现提示，线粒体功能的年龄相关性下降可能导致生物体能量生成减少。

线粒体活性的一个关键调控因子被认为是过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）共激活因子-1（PGC-1α）14。PGC-1α活性的下降或其表达量的减少会导致线粒体氧化活性降低，从而引起能量生成受损。此外，线粒体质量的下降 可能影响骨骼肌质量，并进而导致肌少症、肌无力症以及功能能力下降的发生或加重15,16。与年龄相关的线粒体功能和骨骼肌质量同步下降的证据提示，线粒体功能障碍与功能衰退的发病机制之间存在关联17。最近的研究在社区居住的功能性老年人群中证实，骨骼肌线粒体代谢的降低可预测该人群的活动能力下降18。 尽管导致线粒体随年龄增长而衰退的确切机制尚不明确，但近期证据强调了昼夜节律钟与线粒体功能之间存在相互调控关系，这种关系对线粒体燃料利用和生物合成具有重要影响19。

能量底物利用
线粒体功能似乎受到骨骼肌组织细胞水平上能量代谢及所利用底物类型的影响11。在能量底物耗竭期间，特别是人体内碳水化合物耗竭时，（线粒体）能量生成的底物偏好会发生改变。当葡萄糖水平较低时，底物偏好会从葡萄糖转向脂肪酸以及由脂肪酸衍生的酮体。这种代谢转换的特征是脂肪细胞中脂质代谢上调，随后酮体向血液中的释放增加4。在生酮饮食条件下，能量底物利用从葡萄糖转向酮体，似乎对线粒体活性氧的产生、抗氧化防御、ATP合成以及线粒体生物发生具有有益影响20。

当环境中的营养供应不足且糖原储备耗尽时，机体的代谢会从碳水化合物代谢转变为脂质代谢。在此代谢转换启动后，储存的甘油三酯被分解为甘油和游离脂肪酸：甘油作为糖异生的底物，而游离脂肪酸则被转运至肝脏进行氧化 通过 β-氧化生成乙酰辅酶A（acetyl CoA）。酮体主要在肝脏中合成，通过三分子乙酰辅酶A经两步缩合反应生成β-羟基-β-甲基戊二酰辅酶A（β-hydroxy-β-methylglutaryl-CoA），随后进一步转化为包括乙酰乙酸和3-β羟基丁酸在内的酮体。21这些酮体被分布到全身各组织，其中以心脏、大脑和骨骼肌的消耗量最高21随着年龄增长，线粒体脂肪酸氧化功能受损，从而影响代谢转换22已有研究提出，线粒体燃料利用障碍会导致线粒体功能进一步受损，进而促进与年龄相关疾病的发生及功能衰退23.

外周血单个核细胞（PBMCs）线粒体耗氧量的变化已被用于研究与功能障碍和血管生成相关的模式。Hartman et al. 开展了一项研究，旨在确定耗氧量与多种介导的血管舒张之间的相关性，结果表明线粒体功能障碍与血管平滑肌细胞功能障碍之间存在关联24。在其他器官方面，通过呼吸测定法发现，PBMCs 与较高的认知功能和脑功能相关25。因此，PBMCs 的生物能量状态和呼吸能力可作为评估全身各器官或组织功能状态的潜在生物标志物。

昼夜节律
另一个影响线粒体健康的重要因素是昼夜节律。昼夜节律是指在缺乏环境线索的情况下，生物行为和生理活动呈现出的大约24小时的周期性振荡26。这些节律以预测性方式发挥作用，以维持系统和组织的稳态。昼夜节律的内在机制是一种称为昼夜钟的转录-翻译反馈环路27。过去15年的研究表明，这种昼夜钟机制几乎存在于全身所有细胞中28。除了维持时间节律外，分子钟机制还参与调控基因表达的每日程序，被称为昼夜钟输出29。这些钟输出基因在不同组织类型中各具特异性，并在功能上与细胞代谢、自噬、修复和稳态相关的重要通路密切相关。最近的研究证据表明，线粒体健康依赖于昼夜钟的功能，并影响线粒体的各项功能，包括线粒体生物发生、能量底物利用以及线粒体自噬30。

越来越多的临床前和临床研究证据表明，在整个衰老过程中，昼夜节律会出现紊乱31。这些紊乱包括正常的睡眠-觉醒周期被打乱、核心体温节律的振幅降低，以及对相位变化的适应能力延迟31。例如，一项研究通过将光照周期改变6小时，来挑战成年和老年（20个月以上）小鼠的昼夜节律系统，结果发现老年小鼠重新调整其活动模式以适应新的光照周期所需的时间更长32。与昼夜节律行为的改变一致，对组织生物钟的分析发现，衰老群体中的中枢和外周组织生物钟功能均受到损害。

最近，多个研究团队对不同组织在衰老过程中的生物钟及其输出信号进行了转录组学分析33。这些研究结果表明，随着年龄增长，生物钟输出信号发生了大规模的重编程。这意味着，尽管核心生物钟仍维持其时间调控功能，但其调控的每日节律性表达基因却发生了显著变化。例如，已有两项研究对人类受试者的肌肉组织每4小时采集一次活检样本，持续24小时，结果显示，昼夜节律基因在夜行性啮齿类动物与昼行性人类之间的表达高峰和低谷呈现相反模式34,35,36。这表明，若仅依据活动期与休息期（而非光照与黑暗）来比较节律基因的表达，则不同物种间肌肉组织中的节律基因表达模式几乎相同。有研究提出，这种与年龄相关的生物钟输出改变会导致若干已知衰老标志相关通路的调控功能受损，包括线粒体功能、DNA损伤与修复以及自噬等37。

研究依据
线粒体功能与身体功能衰退之间的关联已得到充分证实。然而，导致线粒体功能障碍的根本原因仍存在争议。近期研究表明，细胞能量底物利用和昼夜节律可能在这一过程中发挥作用。评估线粒体功能的传统方法，例如通过肌肉活检样本测量线粒体耗氧量，常被视为具有疼痛性和侵入性，可能降低受试者的参与意愿，尤其是在肌肉量较低的人群中，如虚弱和肌肉减少症成人38。

鉴于这些局限性，亟需一种侵入性更小的方法来评估老年人细胞燃料利用和昼夜节律的变化。本研究旨在评估一种新型的、微创的方案，可用于评估该人群的燃料代谢和昼夜节律。本研究的结果将有助于更好地理解与年龄相关的变化以及对医学或行为干预的反应，为该领域未来的研究所借鉴。

方案

涉及人类参与者的实验程序已获得研究伦理委员会（佛罗里达伦理政策 1.0104）和佛罗里达大学机构审查委员会的批准。

1. 线粒体功能

  1. 外周血单个核细胞（PBMCs）的分离
    1. 使用特殊的8 mL采血管（16 mm × 125 mm；含0.1 M柠檬酸钠抗凝剂或肝素钠抗凝剂）采集PBMCs（见 材料表).
      注意：采血管内含有由触变性聚酯凝胶和梯度介质组成的血液分离介质（参见 材料清单以增强白细胞的分离效果。
    2. 在采集后2小时内处理8 mL细胞制备管，以获得有活力的结果。
    3. 采血后立即轻轻颠倒混匀或使用混匀器混匀采血管，并在室温（RT）下保存，时间不得超过2小时。
    4. 将采血管在匹配的摆出式转子中以 2,000 × g 15 分钟（或相当于 30,000 G·min；不得超过 2,000 × g室温下。
      注意：这些离心管比标准的15 mL离心管更长，因此必须格外注意使用正确的转子。
    5. 吸弃约80%的血浆层，弃入生物危害废物容器中，用移液管将血液采集管中的细胞层收集至15 mL离心管中。
      注意：使用15 mL离心管时，加入7 mL细胞层，并用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）定容至14 mL，细胞与PBS的体积比应为1:1。必要时可使用多个离心管。通过轻柔颠倒混匀。
    6. 在水平转子离心机中以 900 × g 在室温下离心5分钟（或相当于4,500 G·min）。
    7. 轻轻吸去PBS溶液，切勿扰动细胞沉淀，并将废液弃入生物危害废物容器中。
    8. 将细胞沉淀重悬于1 mL基础培养基（BM；参见 材料表通过轻柔吹打进行重悬。将骨髓细胞悬液补至总体积10 mL，并通过轻柔颠倒混匀。进行细胞计数。
    9. 在水平转子离心机中离心细胞悬液，900 × g 室温下孵育5分钟。
      注意：若细胞在同日用于生物能量评估，则继续进行步骤 1.1.10；若细胞需冷冻保存，则继续进行步骤 1.1.13。
    10. 计算测定培养基（AM；参见 材料表用于重悬下一个细胞沉淀，以达到所需细胞浓度。
      注意：例如，当接种密度为每孔150,000个细胞（50 µL）时，细胞悬液所需浓度为3百万个细胞/mL。
    11. 小心吸出上清液并弃入生物危害废物容器中，注意不要扰动细胞沉淀。
    12. 轻轻重悬细胞沉淀于1 mL或更少的AM中。加入AM至达到目标细胞浓度所需的总体积。此时细胞已准备好接种至包被的细胞培养板中（参见 材料表).
      注意：以下步骤适用于细胞冻存以备储存（1.1.13–1.1.16），不适用于当天操作流程。
    13. 冻存细胞时，吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀，并将上清液弃入生物危害废物容器中。
    14. 轻轻将细胞重悬于冻存培养基中（参见 材料表) 至所需浓度（5–10 × 10⁶ 个细胞/mL）。将所需体积分装至已标记的冻存管中。
    15. 使用冻存容器对细胞悬液进行慢速冷冻（参见 材料表在 -80 °C 下冷冻至少 4 小时或过夜。
    16. 4小时后或次日早晨，将冻存管转移至液氮罐中储存，应置于气相中。
    17. 测量前一天，将细胞培养微孔板的孔底进行包被（参见 材料表）与细胞粘附剂（参见 材料表）。按照生产商说明书配制黏附剂，推荐浓度为22.4 µg/µL，用0.1 M碳酸氢钠（pH 8.0）稀释适量体积的黏附剂储备液。向每孔细胞培养微孔板中加入25 µL黏附剂。
    18. 20分钟后，用移液管吸出每个孔中的剩余液体，并用200 µL无菌纯化水洗涤孔两次。将酶标板置于生物安全柜中干燥（约2小时）。
    19. 用铝箔包裹该板或将其放入密闭的次级容器中，并于4 °C冰箱中保存。
  2. 利用实时代谢通量分析仪对PBMCs进行生物能量评估
    注意：使用通量分析仪和多功能酶标仪（参见 材料表确定了最佳接种密度为每孔150,000个PBMCs，解偶联剂羰基氰化物-4（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）的终浓度为2 µM，Hoechst 33342的终浓度为4 µM（注射后孵育时间至少20分钟）。
    1. 为了 用 Hydrobooster 水合传感器芯片，从盒中取出带有工具板的传感器盒，并将该盒放置 "传感器开启" 在实验台上。用移液器吸取 200 µL 校准液（参见 材料表) 加入工具板的每个孔中，将 Hydrobooster 牢固地放置在工具板上，随后放上传感器盒。检查并去除任何滞留的气泡，然后置于 37 °C 非 CO₂2 培养箱中孵育过夜。
    2. 打开通量分析仪，然后启动检测分析软件（参见 材料表将温度设置为 37 °C。使仪器保持开启过夜，以确保设定温度稳定。
      注意：以下编程步骤（1.2.4–1.2.10）可在实验前一天或实验当天进行
    3. 要设置分析软件程序（参见 材料表）文件，打开 模板 对于 底物氧化应激测试. 前往 组别定义，打开 注射策略 标签，编辑 抑制剂 + 亚氧化应激测试 到 依托莫西 + 亚氧化应激测试，并增加两种注射策略： UK5099 + 亚氧化应激测试 和 BTPES + 亚氧化应激测试在每种注射策略内部， 注射条件 窗口，单击 A 用于 端口 A 并输入 相应抑制剂的终浓度 (依替莫西尔：4 µM；UK5099：2 µM；BTPES：3 µM).
    4. 点击 端口 B、C 和 D，并输入相应的终浓度（端口 B: 寡霉素浓度 [1.50 µM], 端口 C: FCCP [2.0 µM]; 端口 D: 鱼藤酮 + 抗霉素 A [0.5 µM]). 加入 Hoechst 33342, 4 µM 到 化合物 窗口用于 端口 D.
    5. 打开 预处理 标签并选择 预处理（如适用）。例如： 对照, 实验的, 或 习惯的 例如， 基线 和 随访）。如有需要，可在下方窗口中添加描述。
    6. 打开 的 检测培养基 标签和从 媒体 下拉菜单，选择 RPMI 培养基，pH 7.4，输入 批号, 准备培养基的人员, 制备时间，以及 添加至培养基的补充剂 （10 mM 葡萄糖，2 mM 谷氨酰胺，1 mM 丙酮酸；参见 材料表).
    7. 打开 细胞类型 制表符和回车 PBMC-受试者编号 作为 名称, 外周血单个核细胞 作为 细胞类型, 150000 作为 接种密度, 受试者编号 作为 来源, 制备细胞的人员, 制备日期，以及 细胞解冻日（如适用）。
    8. 点击 生成分组，前往 孔板布局图，并将96孔板的各孔分配至相应组别。保留各孔 A1, A12, H1，以及 H12 指定为 背景孔.
    9. 前往 实验方案，检查 平衡 框（默认设置），并输入以下信息： 基线：五个测量循环：3 分钟混匀，0 分钟等待，3 分钟测量； 培养基或抑制剂（Port A）: 六次测量循环：3 分钟混匀，0 分钟等待，3 分钟测量； 寡霉素（Port B）：三次测量循环：3 分钟混匀，0 分钟等待，3 分钟测量； FCCP（C孔）: 三次测量循环：3 分钟混匀，0 分钟等待，3 分钟测量； 鱼藤酮 + 抗霉素 A + Hoechst 33342（Port D）三 测量循环：3 分钟混匀，0 分钟等待，3 分钟测量。
    10. 在进行生物能量评估当天，从冰箱中取出包被的细胞培养微孔板，置于生物安全柜中使其升至室温。
    11. 将97 mL预热的BM与补充剂混合配制检测培养基（AM）：1 mL丙酮酸盐（终浓度：1 mM）、1 mL葡萄糖（终浓度：10 mM）和1 mL谷氨酰胺（终浓度：2 mM）。将AM置于37 °C、非CO₂环境条件下预热2 孵育器中保存，直至使用。
    12. 接种细胞时，除以下情况外，向每个孔中加入 50 µL 含 150,000 个 PBMC 的细胞悬液（来自步骤 1.1.12）： A1, H1, A12，以及 H12 （指定为 背景孔).
      关键：最佳接种密度此前已确定。
    13. 用培养板盖盖好细胞板，在生物安全柜中室温静置60分钟，以促进细胞均匀分布。
      关键步骤：在显微镜下观察细胞，以确保细胞在孔内均匀分布。
    14. 进行细胞成像时，打开多功能酶标仪（参见 材料表在首次细胞孵育前几小时；等待读取仪的启动程序完成后，再打开成像软件（参见 材料表）。打开成像软件并设置 预热温度 到 37 °C. 
    15. 为配制检测用试剂，按照检测试剂盒说明书进行试剂的重悬，具体步骤稍作修改，详见下文 表1.
      关键：FCCP 和 Hoechst33342 的最佳终浓度此前已确定。
    16. 60分钟细胞静置后，使用细胞培养显微镜观察各孔，记录任何可见异常现象，例如细胞聚集。
    17. 在室温下，使用配备适用于微孔板的摆动转子的离心机，以60 × g离心细胞培养板。 g 1分钟，最低加速度和最低刹车；翻转培养板，再次于40 × g 1分钟。将加速度和刹车设为最小。在37 °C条件下孵育细胞25-30分钟，无需CO₂环境。2 培养箱
      注意：进行细胞成像时，应将细胞培养板置于预热的多功能酶标仪中孵育（参见 材料表），并在该孵育期间（第一次细胞孵育）对每个孔拍摄明场图像。
    18. 使用条形码扫描仪扫描细胞培养板的条形码（参见 材料表），选择 开始明场扫描将细胞培养板放置于板架上，启动板架缩回。选择含细胞的孔进行扫描，并开始扫描。
    19. 在第一次细胞孵育期间， 加载传感器盒的端口 如所指示，使用试剂 表1：端口（A）：20 µL AM（对照组）、依托莫西（etomoxir，长链脂肪酸进入线粒体的抑制剂）、UK 5099（2-氰基-3-(1-苯基-1H-吲哚-3-基)-2-丙烯酸，线粒体丙酮酸载体抑制剂）或 BPTES（双-2-(5-苯乙酰胺基-1,3,4-噻二唑-2-基)乙基硫醚，谷氨酰胺转化为谷氨酸的抑制剂）； 端口（B）：22 µL 寡霉素（ATP合酶抑制剂）； 端口（C）25 µL FCCP（解偶联剂羰基氰化物-4-（三氟甲氧基）苯腙）； 端口（D）：27 µL 鱼藤酮/抗霉素A/ Hoechst 33342（分别为线粒体复合物I和III的抑制剂及细胞核染料）。将传感器 cartridge 放回 37 °C 无 CO₂ 培养箱中2 孵育箱中继续孵育5分钟。
      注意：请遵循制造商关于端口加载的说明。
    20. 从培养箱或酶标仪中取出细胞培养板（首次孵育后，以及完成细胞成像后，如适用），向每孔加入预热的AM培养基，使每孔终体积为180 µL。将细胞培养板置于37 °C、非CO₂2 在培养箱中继续孵育15–25分钟（第二次细胞孵育）。
    21. 启动 代谢检测 通过在第二次细胞孵育期间启动传感器校准。 点击 运行检测 当检测准备就绪，即可开始对传感器盒进行校准。 当提示时，将传感器 cartridge 从 37 °C 非 CO₂2 将培养箱中的细胞板转移至通量分析仪托盘，并启动校准程序。根据检测分析软件的提示，在校准完成后，将工具板更换为细胞板。
      注意：校准过程大约需要 20 分钟。
    22. 代谢检测结束后，根据软件提示，从仪器中取出传感器板和细胞板。将传感器板从细胞板上取下，并用细胞板盖将其盖好。
    23. 在初步实验确定Hoechst染料孵育时间后，扫描板条形码，并根据软件提示，使用多功能读板仪获取每个含细胞孔的荧光图像。
      ​注意：成像与检测分析软件已连接，可将细胞计数数据导入检测分析数据文件，以实现基于细胞数量的数据归一化。

2. 昼夜节律钟基因表达

注意：将通过使用RNA血液试剂盒（见材料表）提取PBMC中RNA，检测受试者钟基因的表达情况。

  1. 直接将3 mL受试者的血液抽入含有6 mL稳定剂的RNA管（参见材料表）中。涡旋振荡10秒以充分混匀。
    注意：如果稳定剂未与受试者血液样本充分混合，则研究误差的风险将增加。
  2. 将1.0 mL稳定后的血液样本转移至一个15 mL离心管中，并加入5 mL红细胞裂解缓冲液。在冰上孵育10–15分钟。孵育期间涡旋振荡管子2次。在4 °C、400 × g条件下离心10分钟。
  3. 识别沉淀物，小心倾去含有裂解红细胞的上清液。加入2 mL红细胞裂解缓冲液（参见材料表），重悬细胞，短暂涡旋振荡，然后在4 °C、400 × g条件下离心10分钟。
  4. 倾去上清液，将离心管倒置在吸水纸上静置1–2分钟。在进行下一步操作前，用干净的纸巾吸去管口边缘的任何液体。
  5. 小心加入600 µL RNA裂解缓冲液（参见材料表）。按照制造商的说明书，加入β-巯基乙醇并重悬沉淀物。
  6. 将裂解物直接用移液器转移至置于2 mL收集管中的一次性细胞裂解物匀浆柱（参见材料表），并在最大转速下离心2分钟以完成匀浆。弃去一次性细胞裂解物匀浆柱，保留匀浆后的裂解物。
  7. 向匀浆后的裂解物中加入等体积（600 µL）的70%乙醇，并通过移液混匀。小心地将样品（包括可能形成的任何沉淀）移入置于2 mL收集管中的新离心柱中，但不要润湿管口边缘。在>8,000 × g条件下离心15秒。
  8. 将离心柱（参见材料表）转移至一个新的2 mL收集管中。向离心柱中加入700 µL严格洗涤缓冲液（参见材料表），并在>8,000 × g条件下离心15秒以进行洗涤。弃去穿流液。
  9. 小心打开离心柱，加入500 µL温和洗涤缓冲液（参见材料表）。盖紧盖子，在全速（20,000 × g）下离心3分钟。
  10. 将离心柱转移至一个1.5 mL微量离心管中，直接将30–50 µL无RNase水移加到硅胶膜上。在>8,000 × g条件下离心1分钟以洗脱RNA。重复一次。
    ​注意：RNA可在-80 °C下保存。
  11. 使用无RNase的DNase试剂盒（参见材料表），按照制造商的说明书在柱上进行DNase处理。
  12. 使用500 ng总RNA和实时聚合酶链式反应（PCR）系统（参见材料表），按照制造商的说明书合成cDNA。将所有cDNA样品用无RNase水稀释1:25，并取4 mL用于定量逆转录PCR（qRT-PCR）。
  13. 采用引物添加法（参见材料表），使用表2中所示的每种引物各10 mM完成qRT-PCR。使用实时系统（参见材料表）完成qRT-PCR。
  14. 使用Rpl26 mRNA水平对所选基因的mRNA水平进行归一化处理。采用2-DDCt法计算相对定量值。
  15. 为确定特定mRNA的表达是否呈现昼夜节律性振荡，采用基于似然比的LR_rhythmicity39检验法（使用p≤ 0.01）来检测单一实验条件下是否存在昼夜节律性40。

3. 数据分析计划

注意：将使用药物清单根据用药情况对参与者进行分类43。

  1. 采用混合效应线性模型，其中应将年龄、性别、体重、身高、血压、心率及其他风险因素作为协变量纳入模型。
  2. 应包含一个随机效应项，以解释个体内部数据的相关性。
  3. 在模型拟合过程中，应采用遵循层级原则的向后变量选择法。
  4. 根据拟合后的模型，在控制所有协变量的条件下，测量从时间点1到时间点2的变化。

结果

本方案包含作为方法学验证的初步数据。该方案采用实时代谢通量分析仪检测线粒体功能和细胞燃料利用，并通过RNA提取和定量反转录PCR（qRT-PCR）分析昼夜节律相关基因（如 BMAL1、CLOCK、Nfil2、Nr1d1、Dbp、Cry1、Per2）。

在初次分析后的第10天，来自五名对照参与者的分离人外周血单个核细胞（PBMCs）的氧消耗率（OCR）如图1所示。该数据用于比较干预前后的数值，展示了在注射对照物、乙莫昔尔（etomoxir）、UK5099和BPTES后，基础呼吸、急性反应、最大呼吸和备用呼吸能力的平均值。值得注意的是，图1C显示在注射乙莫昔尔后出现显著的负向急性反应，但在基础呼吸、最大呼吸或备用呼吸能力方面未观察到显著影响。

细胞呼吸图谱；OCR分析；基础呼吸、急性呼吸、最大呼吸及备用呼吸能力比较。
图1：分离的人外周血单个核细胞（PBMCs）的耗氧量。（A）来自对照受试者的PBMCs的实时耗氧速率（OCR；pmol/(min∙150,000个细胞)），使用Flux分析仪并通过底物氧化测定法进行评估。细胞接种密度为150,000个细胞/孔。第一次注射为培养基（对照）或抑制剂（etomoxir、UK5099或BPTES；详见正文），在测量基础细胞呼吸速率后进行。线粒体底物限制的急性反应定义为注射抑制剂前后基础OCR的差值。寡霉素（ATP合酶抑制剂）抑制与ATP生成偶联的呼吸，从而得到质子漏呼吸。FCCP（解偶联剂）诱导最大解偶联呼吸；鱼藤酮和抗霉素A（分别为复合物I和III的抑制剂）抑制除非线粒体呼吸外的所有呼吸（详见正文）。（B-E）细胞呼吸的定量分析（n = 5；数据以均值 ± 标准差表示）。（B）注射抑制剂前的基础OCR，（C）对抑制剂的急性反应（相对于注射前基础OCR的变化），（D）最大OCR，以及（E）备用呼吸能力（最大OCR与第一次注射后基础OCR之间的差值）。etomoxir注射后的急性反应（C）可能提示在基础条件下，OCR对脂肪酸作为能量底物的依赖性高于其他底物组，而在高能量需求期间对OCR无明显影响（D）。请点击此处查看该图的放大版本。

化合物加入化合物的 AM 体积（μL）储备液浓度（μM）工作储备液所需储备液体积（μL）工作储备液所需 AM 体积（μL）工作储备液浓度（μM）工作储备液体积（μL）[端口]终浓度（μM）
Etomoxir70016050015004020 [A]4
UK50997008050015002020 [A]2
BPTES70012050015003020 [A]3
oligo42015030027001522 [B]1.5
FCCP72010060024002025 [C]2
Rot/AA/H540503002700527 [D]0.5

表1：底物氧化试验试剂的配制及储备液、工作液和终浓度。 所有试剂均来自细胞线粒体应激试验或底物氧化应激试验试剂盒。缩写：oligo = 寡霉素；FCCP = 解偶联剂羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙；Rot/AA/H = 鱼藤酮/抗霉素A/ Hoechst 33342。Etomoxir、UK5099、BTPES：分别为脂肪酸、葡萄糖和谷氨酰胺氧化的抑制剂。

Bmal1正向引物 – GCACGACGTTCTTTCTTCTGT
反向引物 – GCAGAAGCTTTTTCGATCTGCTTTT
Clock正向引物 – CGTCTCAGACCCTTCCTCAAC
反向引物 – GTAAATGCTGCCTGGGTGGA
Cry1正向引物 – ACTGCTATTGCCCTGTTGGT
反向引物 – GACAGGCAAATAACGCCTGA
Per1正向引物 – ATTCGGGTTACGAAGCTCCC
反向引物 – GGCAGCCCTTTCATCCACAT
Per2正向引物 – CATGTGCAGTGGAGCAGATTC
反向引物 – GGGGTGGTAGCGGATTTCAT
Rev-erb α正向引物 – ACAGATGTCAGCAATGTCGC
反向引物 – CGACCAAACCGAACAGCATC

表2：昼夜节律钟基因引物。

讨论

线粒体功能和昼夜节律调控随年龄增长而下降，正越来越被视为与年龄相关疾病的重要促成因素。通过生活方式干预（如饮食和体力活动）调节昼夜节律，可能成为促进健康衰老、减轻与年龄相关的活动能力下降的潜在策略。然而，目前直接评估线粒体功能的方法具有侵入性，通常需要进行肌肉活检，由于受试者对疼痛和风险的担忧，可能在受试者招募和保留方面带来挑战。

通过血液采集等侵入性较小的方法评估昼夜节律和代谢健康的标志物，将为未来研究中探索和验证治疗靶点提供有价值的成果。这些微创方法有望通过揭示昼夜节律与代谢健康之间复杂的相互作用及其对生理功能的影响，显著推动该领域的发展。本研究的目标是评估细胞能量代谢与昼夜节律之间的关系。具体而言，采用生物能量通量分析来评估在不同底物可利用条件下线粒体的功能，同时监测参与者白细胞中一组昼夜节律相关基因的表达情况。通过结合生物能量分析和基因表达分析这两方面手段，可全面深入地理解这两个基本生理过程之间的关联。

从昼夜节律角度对这一时间序列数据进行统计分析，有助于深入了解昼夜节律的强度、范围及其时间特征。总之，将基因表达分析、细胞生物能量学以及机体水平的代谢指标相结合，构成了一种新颖且创新的研究方法，将为揭示人类能量代谢与昼夜节律之间的相互作用提供重要线索。

在一项初步研究中，我们检测到外周血单个核细胞（PBMCs）的耗氧率（OCR）在脂肪酸利用受限时出现急性反应（注射肉碱棕榈酰转移酶1a抑制剂依托莫西后）。该发现提示，在来自该特定人群的PBMCs中，基础呼吸过程可能依赖脂肪酸作为能量底物。然而，最大呼吸未受影响，表明在高能量需求期间，其他能量来源（如葡萄糖和谷氨酰胺）可能补偿脂肪酸利用的减少。未来的研究应探讨：a）PBMCs的生物能量状态是否反映机体整体的能量代谢情况；b）限时进食等干预措施是否会影响能量底物的选择偏好。

关于PBMCs的通量分析，有几个关键步骤需要注意。首先，在评估实验样品之前，应优化细胞接种密度（每孔细胞数），确保每个孔内以及每块板之间的细胞分布连续且均匀；应通过使用0、0.125、0.25、0.5、1.0和2.0 µM浓度进行预实验来优化最终的FCCP浓度；如适用，应根据制造商说明书优化Hoechst 33342染色条件。其次，将代谢数据归一化至细胞参数对于不同实验间数据的可比性至关重要。本方案中描述了在通量分析仪检测结束后，利用Hoechst 33342染色细胞和细胞成像设备进行细胞计数的方法。若无合适的设备，也可采用其他归一化方法，例如每孔总细胞蛋白含量或核DNA含量。本方案相较于已有方案有一项值得注意的修改：可分别使用三种抑制剂各自的独立检测试剂盒完成实验，而非仅使用此处提出的两种试剂盒（见材料表）。

使用外周血单个核细胞（PBMCs）作为替代模型来研究老年人能量代谢与昼夜节律之间的相互作用，受限于一个假设，即PBMCs对干预的反应能够准确反映其他组织和器官的反应。尽管该方法具有创新性且创伤极小，但必须认识到，不同组织和器官（如大脑、肝脏和骨骼肌）在不同条件下可能表现出不同的反应。一项临床前研究表明，在进食和禁食小鼠中，时钟基因的表达发生变化，导致肝脏和肌肉组织中部分BMAL1靶基因上调，而其他基因则下调41。这些外周组织和器官高度代表了代谢过程，并可受到环境信号的影响，进而影响时钟基因的表达机制42。要全面理解外周组织、器官与中枢昼夜节律钟之间的关系，仍需进一步研究。

另一个局限性在于，服用任何处方药的参与者并未被排除在外，这可能对统计分析造成限制。为减轻这一局限性，在未来的研究中将采用一种已在服用药物的老年群体中得到验证的医疗用药清单43。参与者将根据试验方案数据审查部分中记录的推荐药物进行分类。药物共分为三类，分别为已被证实会 1) 加速功能衰退、2) 减缓功能衰退、以及 3) 影响骨骼肌功能的药物。

最后，人类骨骼肌线粒体氧化能力确实存在昼夜节律，在下午06:00至11:00达到峰值，在上午08:00至11:00期间下降44。目前尚不清楚外周血单个核细胞（PBMCs）的线粒体氧化能力是否也具有类似的节律。然而，初步数据表明，PBMCs与线粒体代谢之间存在关联45。鉴于肌肉活检以及PBMCs变化的相关信息尚不明确，在分析结果时必须谨慎。考虑到这一局限性，在评估和制定实验方案时应牢记这些信息，因为这些背景知识和见解可能有助于确保方案的有效性和可靠性。

据我们所知，目前尚无先前研究通过本项目提出的方法评估过燃料利用模式或昼夜节律。我们的目标是考察线粒体燃料利用和昼夜节律健康相关标志物对变化的响应性。本研究提供了一种微创方法，用于测量一种高灵敏度的生物标志物，可在未来无法实施肌肉活检的干预性研究中作为替代方案。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由美国老年人独立中心（NIH/NIA P30AG028740）资助，并得到临床与转化科学研究所（NIH/NCRR UL1TR000064）的协助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Agilent Technologies 细胞成像 Agilent Technologies细胞图像软件
Agilent/Seahorse Wave 桌面程序Agilent Technologies5994-0039EN用于分析细胞分析仪和应激测试实验数据的软件
Agilent/Seahorse XFe96 实时细胞能量代谢分析仪Agilent TechnologiesS7800B实时细胞代谢通量分析仪；通量分析仪 
条形码阅读器Agilent TechnologiesG2615-90007
Seahorse Wave 桌面软件Agilent Technologies数据采集软件；实验分析；Wave 程序 
Seahorse XF 1.0 M 葡萄糖溶液Agilent Technologies103577-100基础培养基的添加剂，用于配制检测用培养基
Seahorse XF 100 mM 丙酮酸溶液Agilent Technologies103578-100基础培养基的添加剂，用于配制检测用培养基
Seahorse XF 200 mM 谷氨酰胺溶液Agilent Technologies103579-100基础培养基的添加剂，用于配制检测用培养基
Seahorse XF 细胞线粒体应激测试Agilent Technologies103015-100线粒体生物能量功能检测
Seahorse XF 线粒体燃料灵活性测试 Agilent Technologies103260-100线粒体生物能量功能检测
Seahorse XF RPMI 培养基Agilent Technologies103576-100外周血单个核细胞的基础培养基
Seahorse XFe96 FluxPak 微型试剂盒Agilent Technologies102601-100传感器微孔板和细胞培养微孔板
Cytation 1 细胞成像多功能读板仪 Agilent/BioTek用于细胞成像的多功能读板仪
CPT 肝素钠采血管，16 x 125 mm x 8.0 mLBecton Dickinson362753用于分离外周血单个核细胞的血液采集管
CellTak 细胞与组织粘附剂Corning354240用于包被细胞培养微孔板的细胞粘附剂
磷酸盐缓冲液 Corning21-040-CV用于洗涤血细胞的缓冲液
Ficoll Paque PlusCytivaGE17-1440-02密度梯度介质
Lunar Prodigy DXA 扫描仪General ElectricEN 60601-2-7 5.1全身瘦体质量和脂肪/瘦组织质量比
冷冻容器，Nalgene Mr. FrostyMilliporeSigmaC1562用于缓慢冷冻细胞悬液的冷冻容器
Buffer EL.Qiagen79217红细胞裂解缓冲液
Buffer RLTQiagen79216RNA 裂解缓冲液
Buffer RPEQiagen1018013温和洗涤缓冲液
Buffer RW1 Qiagen1053394严格洗涤缓冲液
QIAamp DNA Micro 试剂盒Qiagen56304DNA 制备：QIAamp MinElute 柱、蛋白酶 K、载体 RNA、缓冲液、收集管（2 ml）
QIAamp RNA 血液小型试剂盒Qiagen52304血液 RNA 试剂盒；用于 RNA 分离
QIAshredderQiagen79656一次性细胞裂解液匀浆器
无 RNase 的 DNase 试剂盒Qiagen79254用于进行 DNA 消化
2-巯基乙醇（试剂）Thermo Fisher ScientificMFCD00004890
2 mL 收集管，100 个装Thermo Fisher ScientificAM12480
Fast SYBR Green Master MixThermo Fisher Scientific4385612引物加入其中，用于进行 qRT-PCR 
微量离心管，1.5 mLThermo Fisher Scientific69715RNA 纯化过程中用于承载 RNA 纯化滤器
窄口 p1000 移液器吸头Thermo Fisher Scientific02-707-402
QuantStudio 3 实时荧光定量 PCR 系统、MiniAmp Plus 热循环仪及 96 孔板套装Thermo Fisher ScientificA40393
Tempus 血液 RNA 采血管Thermo Fisher Scientific4342792RNA 采血管
Tempus Spin RNA 分离试剂盒Thermo Fisher Scientific4380204RNA 提取与分离

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