本方案描述了利用光学相干断层扫描技术在小鼠脉络膜中植入并评估黑色素瘤的方法。
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方法文章
小鼠脉络膜黑色素瘤的植入与评估 通过 光学相干断层扫描
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
建立实验性脉络膜黑色素瘤模型在诱导肿瘤准确定位方面具有挑战性。此外，观察后部脉络膜黑色素瘤也存在困难 体内 实时限制肿瘤定位和生长评估。本文所述方法优化了在小鼠中建立脉络膜黑色素瘤的技术 通过 一种多步骤的脉络膜下腔B16LS9细胞注射方法。为精确地将细胞注入小鼠葡萄膜的微小空间，整个操作过程均在显微镜下进行。首先，在眼球的颞侧上方区域做结膜环形切口。随后，将针头穿过暴露的巩膜，建立通向脉络膜下腔的通道。接着，将钝针插入该通道，并将黑色素瘤细胞注射至脉络膜。注射完成后立即采用无创光学相干断层扫描（OCT）成像技术确定肿瘤的位置及进展情况。视网膜脱离被评估为预测肿瘤位置和大小的指标。该方法可实现小鼠脉络膜局限性黑色素瘤的可重复诱导，并支持对肿瘤生长过程的活体成像评估。因此，该技术为研究眼内肿瘤提供了一种有价值的工具。
引言
葡萄膜黑色素瘤（UM）是成人中最常见的原发性眼内恶性肿瘤。大约90%的眼部黑色素瘤起源于葡萄膜组织脉络膜区域的黑色素细胞1。UM是导致发病和死亡的主要原因，据估计近50%的患者会发展为转移性疾病，其中肝脏是最主要的转移部位2。早期治疗原发性病灶可能降低转移风险，但目前尚无有效治疗方法能够预防转移灶的形成3。
葡萄膜黑色素瘤的标准治疗包括放射疗法，但该疗法可能导致视神经病变、视网膜病变、干眼综合征和白内障，从而引起视力丧失。手术切除通常需等到病灶的生长被明确识别和特征化后才进行。然而，这种延迟可能促使转移性疾病的发展4。在某些情况下，不得不进行无效的眼球摘除术。显然，这种激进的手术会损害视力，并导致显著的外观恶化。
为研究葡萄膜黑色素瘤，人们已致力于开发多种实验模型。能够准确评估该恶性肿瘤的临床前动物模型，对于探索葡萄膜黑色素瘤的新型诊断和治疗策略至关重要。眼黑色素瘤的实验动物模型主要基于将肿瘤细胞接种于小鼠、大鼠和兔体内。5,6小鼠模型因其繁殖速度快、基因组与人类高度相似，且成本较低，被广泛用于黑色素瘤研究。小鼠皮肤....
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方案
本方案中的实验已获得以色列国家动物实验委员会批准，并符合ARVO关于在眼科与视觉研究中使用动物的声明。本研究使用8至10周龄的雌性C57BL/6小鼠，在12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养。实验动物购自商业来源（见材料表）。
1. 细胞培养
- 在含10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠、25 mM HEPES、1%必需维生素混合物、200 U/mL青霉素和200 mg/mL链霉素的RPMI 1640培养基中（见材料表），于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中培养B16LS9细胞。
- 在细胞融合度达到70%–80%时收获细胞用于注射。
2. 动物准备
- 配制氯胺酮（75 mg/kg 体重）和美托咪啶（0.5 mg/kg 体重）的麻醉混合液。通过单次腹腔注射该麻醉混合液对小鼠进行麻醉。
- 将局部眼用麻醉剂奥布卡因（0.4%）滴于双眼。
- 通过局部滴加托吡卡胺（0.5%）使小鼠瞳孔散大。
3. 创建结膜环切口并建立通向脉络膜下腔的巩膜通道<....
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结果
对眼部进行了检查 通过 B16LS9细胞注射后即刻OCT。注射后观察到局部视网膜脱离。小鼠表现出三种视网膜脱离模式：局灶性（图 2，上图），玻璃体渗漏（图 2中间面板）和扩展RD（图 2（下图）。视网膜脱离范围扩大很可能是由注射操作造成的损伤所致。注射后即刻的视网膜脱离模式与注射后5-7天肿瘤的定位之间存在关联。如图所示， 图 2局灶性视网膜脱离与肿瘤细胞生长局限于脉络膜相关。然而，在表现出局灶性视网膜脱离的动物注射后，观察到玻璃体内存在细胞，表明除脉络膜外，玻璃体腔内也存在肿瘤生长。最后，当注射后观察到广泛性视网膜脱离或多部位视网膜脱离时，5天后肿瘤会弥散分布于整个脉络膜和玻璃体中。先前研究表明，通过光学相干断层扫描进行的肿瘤表征与组织学检查结果完全吻合。21.
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讨论
葡萄膜黑色素瘤是一种破坏性疾病，迫切需要新的治疗方法。然而，由于葡萄膜黑色素瘤动物模型存在技术上的挑战，相关研究及潜在治疗手段的发展受到限制1,25。通过眼内注射癌细胞诱导的眼部肿瘤在定位和大小方面均表现出高度变异性，这可能是由于小鼠眼球尺寸较小所致。这种变异性阻碍了对肿瘤进展的全面评估。本文所述的实验方法可在脉络膜下注射B16LS9黑色素瘤细胞后，立即基于活体光学相干断层扫描（OCT）成像评估眼内肿瘤的定位及其预期大小21。多年来，活体成像技术的发展为癌症研究带来了显著优势，使得研究人员能够在整个实验过程中连续追踪肿瘤进展，而不仅限于预设的终点观察。此类方法包括例如利用报告基因细胞进行的生物发光成像，可监测活体动物体内肿瘤及转移灶的位置，包括识别眼部肿瘤16。另一种复杂的技术是光声成像，能够实现细胞的高分辨率成像，并区分黑色素瘤细胞与正常细胞26,
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披露
Marcovich A.L.：Steba Biotech（专利），Yeda Weizmann（专利），EyeYon Medical（顾问，专利），Mor Isum（专利）。（C）= 顾问；（P）= 专利。其余所有作者均无利益冲突。
致谢
本研究部分由以色列科学基金会（ISF）向 Arie Marcovich 资助的项目（资助号 1304/20）支持。我们感谢以色列雷霍沃特卡普兰医疗中心病理科的 Shahar Ish-Shalom 和 Ady Yosipovich 在组织学分析方面的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 μL 玻璃注射器（Hamilton Co.，瑞士博纳杜兹） | Hamilton | 721711 | |
| 30 G 针头 | BD Microbalance | 2025-01 | |
| 盐酸阿替美唑 | Orion Phrma | ||
| B16LS9 细胞 | 来自 Hans Grossniklaus（美国） | ||
| 丁丙诺啡 | richter pharma | 102047 | |
| C57BL/6 雌性小鼠 | Envigo | ||
| 必需维生素混合物 | satorius | 01-025-1A | |
| 胎牛血清 | rhenium | 10270106 | |
| HEPES | satorius | 03-025-1B | |
| 1.4% 羟乙基纤维素滴眼液 | 费舍尔制药（Fisher Pharmaceutical） | 390862 | |
| InSight OCT 分层软件 | Phoenix Micron, Inc | ||
| 氯胺酮 | bremer pharma GMBH（medimarket） | 17889 | |
| L-谷氨酰胺 | satorius | 03-020-1B | |
| 美托咪啶 | zoetis（vetmarket） | 102532 | |
| 0.3% 氧氟沙星滴眼液 | allergan | E92170 | |
| 光学相干断层扫描 | Phoenix Micron, Inc | ||
| 0.4% 奥布卡因 | 费舍尔制药（Fisher Pharmaceutical） | 393050 | |
| 青霉素-链霉素-两性霉素B | satorius | 03-033-1B | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | satorius | 02-023-1a | |
| RPMI 细胞培养基 | satorius | 01-104-1A | |
| 丙酮酸钠 | satorius | 03-042-1B | |
| 手术显微镜 | 蔡司（Zeiss） | OPMI-6 CFC | |
| 0.5% 托吡卡胺 | 费舍尔制药（Fisher Pharmaceutical） | 390723 |
参考文献
- Jager, M. J., et al. Uveal melanoma. Nature Reviews Disease Primers. 6 (1), 1-25 (2020).
- Bustamante, P., Piquet, L., Landreville, S., Burnier, J. V. Uveal melanoma pathobiology: Metastasis to the liver. Seminars in Cancer Biology. 71, Academic Press. 65-85 (2021).
- Damato, B.
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重印与许可
