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方法文章

小鼠脉络膜黑色素瘤的植入与评估 通过 光学相干断层扫描

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DOI：

10.3791/64632

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2022年12月2日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Ophthalmology Research Laboratory, Kaplan Medical Center, 2Department of Ophthalmology, Kaplan Medical Center, Faculty of Medicine, The Hebrew University of Jerusalem

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了利用光学相干断层扫描技术在小鼠脉络膜中植入并评估黑色素瘤的方法。

摘要

建立实验性脉络膜黑色素瘤模型在诱导肿瘤准确定位方面具有挑战性。此外，观察后部脉络膜黑色素瘤也存在困难 体内 实时限制肿瘤定位和生长评估。本文所述方法优化了在小鼠中建立脉络膜黑色素瘤的技术 通过 一种多步骤的脉络膜下腔B16LS9细胞注射方法。为精确地将细胞注入小鼠葡萄膜的微小空间，整个操作过程均在显微镜下进行。首先，在眼球的颞侧上方区域做结膜环形切口。随后，将针头穿过暴露的巩膜，建立通向脉络膜下腔的通道。接着，将钝针插入该通道，并将黑色素瘤细胞注射至脉络膜。注射完成后立即采用无创光学相干断层扫描（OCT）成像技术确定肿瘤的位置及进展情况。视网膜脱离被评估为预测肿瘤位置和大小的指标。该方法可实现小鼠脉络膜局限性黑色素瘤的可重复诱导，并支持对肿瘤生长过程的活体成像评估。因此，该技术为研究眼内肿瘤提供了一种有价值的工具。

引言

葡萄膜黑色素瘤（UM）是成人中最常见的原发性眼内恶性肿瘤。大约90%的眼部黑色素瘤起源于葡萄膜组织脉络膜区域的黑色素细胞1。UM是导致发病和死亡的主要原因，据估计近50%的患者会发展为转移性疾病，其中肝脏是最主要的转移部位2。早期治疗原发性病灶可能降低转移风险，但目前尚无有效治疗方法能够预防转移灶的形成3。

葡萄膜黑色素瘤的标准治疗包括放射疗法，但该疗法可能导致视神经病变、视网膜病变、干眼综合征和白内障，从而引起视力丧失。手术切除通常需等到病灶的生长被明确识别和特征化后才进行。然而，这种延迟可能促使转移性疾病的发展4。在某些情况下，不得不进行无效的眼球摘除术。显然，这种激进的手术会损害视力，并导致显著的外观恶化。

为研究葡萄膜黑色素瘤，人们已致力于开发多种实验模型。能够准确评估该恶性肿瘤的临床前动物模型，对于探索葡萄膜黑色素瘤的新型诊断和治疗策略至关重要。眼黑色素瘤的实验动物模型主要基于将肿瘤细胞接种于小鼠、大鼠和兔体内。5,6小鼠模型因其繁殖速度快、基因组与人类高度相似，且成本较低，被广泛用于黑色素瘤研究。小鼠皮肤黑色素瘤细胞系B16常用于接种C57BL/6小鼠以诱导同源性肿瘤。在利用该模型诱导葡萄膜黑色素瘤时，通常需要在接种后7–14天摘除荷瘤眼球。此外，B16是一种侵袭性很强的模型，眼部的免疫豁免特性有助于转移的发生，通常在肿瘤细胞接种后3–4周即可检测到转移灶。原始B16细胞系的不同亚系表现出不同的转移特性。6例如，Queens 黑色素瘤细胞系具有较高的转移率7,8B16LS9细胞系具有树突状细胞形态，源自注射亲本皮肤黑色素瘤细胞系B16F1的C57BL/6小鼠的肝转移灶9当注射到眼球后房时，这些细胞可形成眼内肿瘤，其组织学特征与人类葡萄膜黑色素瘤相似，并能在C57BL/6小鼠中形成肝特异性转移灶，但在Balb/C小鼠中则不能10,11,12在遗传学上，这些细胞表现为c-met原癌基因的表达水平较高，该基因编码肝细胞生长因子的细胞受体13相比之下，B16F10，第10代th 亲本B16细胞经眼内接种后，主要转移至肺部14. B16F10 和 B16LS9 均具有色素12.

多种关键挑战限制了小鼠葡萄膜黑色素瘤模型的成功应用。首先，肿瘤细胞反流可能导致眼外或结膜下黑色素瘤的发生。其次，黑色素瘤细胞眼内接种后的肿瘤生长通常具有高度变异性，这给治疗效果和疾病进展的评估带来困难。另一个主要难题是难以在活体（in vivo）条件下持续监测肿瘤生长。尽管生物发光成像（如对表达荧光素酶的肿瘤进行成像）常用于监测眼内肿瘤生长15,16，但其无法提供肿瘤在眼内的具体位置信息。因此，肿瘤评估通常需在眼球摘除后进行10,17，这极大地限制了对肿瘤进展过程及治疗反应的全面表征。研究葡萄膜黑色素瘤的另一重大障碍是在色素性小鼠中监测病灶的困难。为推动动物模型中葡萄膜黑色素瘤的研究，亟需开发能够克服上述问题的新方法。

光学相干断层扫描（OCT）具有独特的能力，能够以高分辨率对眼球不同部位进行深层成像，这是其他方法（包括 超声成像18,19）所无法比拟的。OCT成像已被用于动物模型中研究多种眼部疾病20。最近，OCT成像被证明是一种无创性手段，可用于评估眼内肿瘤的生长情况21。本文所述方案描述了在小鼠脉络膜中植入黑色素瘤细胞，并利用OCT在细胞接种时预测眼内肿瘤的位置和大小。

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方案

本方案中的实验已获得以色列国家动物实验委员会批准，并符合ARVO关于在眼科与视觉研究中使用动物的声明。本研究使用8至10周龄的雌性C57BL/6小鼠，在12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养。实验动物购自商业来源（见材料表）。

1. 细胞培养

  1. 在含10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠、25 mM HEPES、1%必需维生素混合物、200 U/mL青霉素和200 mg/mL链霉素的RPMI 1640培养基中（见材料表），于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中培养B16LS9细胞。
  2. 在细胞融合度达到70%–80%时收获细胞用于注射。

2. 动物准备

  1. 配制氯胺酮（75 mg/kg 体重）和美托咪啶（0.5 mg/kg 体重）的麻醉混合液。通过单次腹腔注射该麻醉混合液对小鼠进行麻醉。
  2. 将局部眼用麻醉剂奥布卡因（0.4%）滴于双眼。
  3. 通过局部滴加托吡卡胺（0.5%）使小鼠瞳孔散大。

3. 创建结膜环切口并建立通向脉络膜下腔的巩膜通道

  1. 使用1.4%羟乙基纤维素（见材料表）作为润滑剂涂抹双眼，以防干燥。向右眼滴加0.5%托吡卡胺。
  2. 在手术显微镜下观察小鼠术眼（见材料表），用无菌眼内镊夹住眼睑使其保持张开。
  3. 用眼内镊夹住上方颞侧角巩膜缘结膜，并将其牵拉至下方鼻侧位置22。在整个操作过程中保持此牵拉状态 以固定该位置（图1A）。
  4. 使用30 G针头在背侧颞区距角巩膜缘后方约1–2 mm处做一小段（1–2 mm）结膜切开。
    注意：使用更细的针头可避免过度穿刺，并有助于更精确地定位肿瘤。
  5. 清除结膜切口处多余的滕氏囊组织。
    注意：滕氏囊是一层包绕眼球的致密结缔组织层22。
  6. 在此位置插入针头，穿透巩膜，进行切开以形成通向脉络膜下腔的通道，直至通过暴露的巩膜白色组织可见到脉络膜的棕褐色（图1B）。

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图1：肿瘤细胞接种。（A）使用眼内镊夹住颞上象限角膜缘结膜，并将其牵拉至鼻下位置。（B）将30 G针头尖端插入并穿透巩膜，进行切开以建立通往脉络膜下腔的路径。（C）将装有细胞并连接32 G针头的注射器插入该路径，并注入细胞。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 黑色素瘤细胞的接种

  1. 将 70,000 个 B16LS9 细胞重悬于 2 µL PBS 中。此数量为每只眼睛的估计用量。
  2. 将细胞悬液吸入一支无菌的 10 µL 玻璃 Hamilton 注射器（见材料表），该注射器配备一根弯成 45° 角的 32 G 钝头针头。
  3. 将装有细胞悬液的注射器针头插入第 3 步形成的通道中，深度约为 2 mm。
  4. 注射 2 µL 细胞悬液。
  5. 注射后保持针头位置不动 2–3 秒，直至所有液体完全弥散。
  6. 缓慢轻柔地拔出针头，以避免液体从通道泄漏（图 1C）。
    注意事项：注射速度和力度的调整可能影响肿瘤形成模式。建议实验人员通过预实验校准这些参数，以确定合适的施加力度和速度。初步实验确定注射总量为 70,000 个细胞。然而，由于不同细胞培养类型、批次或小鼠品系之间可能存在差异，需对该细胞数量进行校准。

5. 评估注射位置

  1. 通过OCT扫描在黑色素瘤细胞接种后立即观察注射眼，以识别视网膜脱离（RD）、视网膜损伤和/或玻璃体中的细胞23.
    注意事项：必要时重新滴注托吡卡胺、奥布普罗卡因和乙基纤维素。
  2. 根据步骤 5.1 的 OCT 扫描结果，对 RD 模式进行分类21 根据以下情况：(1) 视网膜脱离（RD）的局部裂孔部位；(2) 玻璃体渗漏——观察到玻璃体内的细胞物质；(3) 扩展性视网膜脱离——多部位视网膜脱离。
  3. 根据以下情况预测肿瘤位置：（1）局部视网膜脱离（RD）提示脉络膜肿瘤；（2）玻璃体渗漏提示玻璃体内肿瘤；（3）广泛性视网膜脱离提示多变且弥散的肿瘤图2).
    ​注意：仅有局部视网膜退行性变（约50%）的小鼠才会出现局限于脉络膜的肿瘤。

6. 基于RD高度预测肿瘤大小

  1. 使用OCT分割/分析软件（参见材料表）测量OCT扫描中局部RD的高度，并根据以下分组进行分类：小 = <300 µm；中 = 300–400 µm；大 = >400 µm。
  2. 根据以下标准评估肿瘤在注射后5天内预计达到的体积：
    小的RD高度通常出现在小体积肿瘤中（肿瘤体积范围为0.0059 mm3至0.07 mm3，平均体积为0.027 ± 0.005 mm3）。
    中等RD高度见于小体积和中等体积肿瘤（肿瘤体积范围为0.015 mm3至0.15 mm3，平均体积为0.056 ± 0.016 mm3）。
     大的RD高度与广泛的肿瘤体积相关，最大可达0.36 mm3。
    注：预期肿瘤大小的范围来源于先前实验结果，并据此划分为小、中、大三类肿瘤。

7. 术后操作

  1. 局部应用0.3%氧氟沙星眼用制剂。
  2. 通过皮下注射盐酸阿替美唑（3 mg/kg）逆转麻醉。
  3. 皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg 体重），每日两次，连续3天，以减轻动物的疼痛与痛苦。
  4. 黑色素瘤细胞注射后第5天，通过以下方法评估肿瘤大小： 按照以下步骤进行。
    1. 按照步骤2.1所述麻醉小鼠。滴加托吡卡胺（0.5%）。
    2. 通过纵向和矢状位OCT扫描检查眼部，并使用OCT分割/分析软件测量肿瘤体积和定位。
    3. 使用公式计算肿瘤体积24：V = a*b*c*6/π （a、b 和 c 分别表示长度、宽度和高度）。
    4. 每2-3天按步骤7.4.1-7.4.3所述方法检测肿瘤大小。
      注意：若使用不同的小鼠品系或细胞系，必须优化该实验步骤。

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结果

对眼部进行了检查 通过 B16LS9细胞注射后即刻OCT。注射后观察到局部视网膜脱离。小鼠表现出三种视网膜脱离模式：局灶性（图 2，上图），玻璃体渗漏（图 2中间面板）和扩展RD（图 2（下图）。视网膜脱离范围扩大很可能是由注射操作造成的损伤所致。注射后即刻的视网膜脱离模式与注射后5-7天肿瘤的定位之间存在关联。如图所示， 图 2局灶性视网膜脱离与肿瘤细胞生长局限于脉络膜相关。然而，在表现出局灶性视网膜脱离的动物注射后，观察到玻璃体内存在细胞，表明除脉络膜外，玻璃体腔内也存在肿瘤生长。最后，当注射后观察到广泛性视网膜脱离或多部位视网膜脱离时，5天后肿瘤会弥散分布于整个脉络膜和玻璃体中。先前研究表明，通过光学相干断层扫描进行的肿瘤表征与组织学检查结果完全吻合。21.

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讨论

葡萄膜黑色素瘤是一种破坏性疾病，迫切需要新的治疗方法。然而，由于葡萄膜黑色素瘤动物模型存在技术上的挑战，相关研究及潜在治疗手段的发展受到限制1,25。通过眼内注射癌细胞诱导的眼部肿瘤在定位和大小方面均表现出高度变异性，这可能是由于小鼠眼球尺寸较小所致。这种变异性阻碍了对肿瘤进展的全面评估。本文所述的实验方法可在脉络膜下注射B16LS9黑色素瘤细胞后，立即基于活体光学相干断层扫描（OCT）成像评估眼内肿瘤的定位及其预期大小21。多年来，活体成像技术的发展为癌症研究带来了显著优势，使得研究人员能够在整个实验过程中连续追踪肿瘤进展，而不仅限于预设的终点观察。此类方法包括例如利用报告基因细胞进行的生物发光成像，可监测活体动物体内肿瘤及转移灶的位置，包括识别眼部肿瘤16。另一种复杂的技术是光声成像，能够实现细胞的高分辨率成像，并区分黑色素瘤细胞与正常细胞26,

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披露

Marcovich A.L.：Steba Biotech（专利），Yeda Weizmann（专利），EyeYon Medical（顾问，专利），Mor Isum（专利）。（C）= 顾问；（P）= 专利。其余所有作者均无利益冲突。

致谢

本研究部分由以色列科学基金会（ISF）向 Arie Marcovich 资助的项目（资助号 1304/20）支持。我们感谢以色列雷霍沃特卡普兰医疗中心病理科的 Shahar Ish-Shalom 和 Ady Yosipovich 在组织学分析方面的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 μL 玻璃注射器（Hamilton Co.，瑞士博纳杜兹）Hamilton721711
30 G 针头BD Microbalance2025-01
盐酸阿替美唑Orion Phrma
B16LS9 细胞来自 Hans Grossniklaus（美国）
丁丙诺啡 richter pharma102047
C57BL/6 雌性小鼠Envigo
必需维生素混合物satorius01-025-1A
胎牛血清rhenium10270106
HEPESsatorius03-025-1B
1.4% 羟乙基纤维素滴眼液费舍尔制药（Fisher Pharmaceutical）390862
InSight OCT 分层软件 Phoenix Micron, Inc 
氯胺酮bremer pharma GMBH（medimarket）17889
L-谷氨酰胺satorius03-020-1B
美托咪啶 zoetis（vetmarket）102532
0.3% 氧氟沙星滴眼液allerganE92170
光学相干断层扫描 Phoenix Micron, Inc 
0.4% 奥布卡因费舍尔制药（Fisher Pharmaceutical）393050
青霉素-链霉素-两性霉素Bsatorius03-033-1B
磷酸盐缓冲液（PBS） satorius02-023-1a
RPMI 细胞培养基satorius01-104-1A
丙酮酸钠satorius03-042-1B
手术显微镜蔡司（Zeiss）OPMI-6 CFC
0.5% 托吡卡胺费舍尔制药（Fisher Pharmaceutical）390723

参考文献

  1. Jager, M. J., et al. Uveal melanoma. Nature Reviews Disease Primers. 6 (1), 1-25 (2020).
  2. Bustamante, P., Piquet, L., Landreville, S., Burnier, J. V. Uveal melanoma pathobiology: Metastasis to the liver. Seminars in Cancer Biology. 71, Academic Press. 65-85 (2021).
  3. Damato, B. Ocular treatment of choroidal melanoma in relation to the prevention of metastatic death-A personal view. Progress in Retinal and Eye Research. 66, 187-199 (2018).
  4. Jouhi, S., et al. The small fatal choroidal melanoma study. A survey by the European Ophthalmic Oncology Group. American Journal of Ophthalmology. 202, 100-108 (2019).
  5. Cao, J., Jager, M. J. Animal eye models for uveal melanoma. Ocular Oncology and Pathology. 1 (3), 141-150 (2015).
  6. Uner, O. E., Gandrakota, N., Azarcon, C. P., Grossniklaus, H. E. Animal models of uveal melanoma. Annals of Eye Science. 7, 21-30 (2022).
  7. Yang, H., Dithmar, S., Grossniklaus, H. E. Interferon alpha 2b decreases hepatic micrometastasis in a murine model of ocular melanoma by activation of intrinsic hepatic natural killer cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (7), 2056-2064 (2004).
  8. Yang, H., Grossniklaus, H. E. Combined immunologic and anti-angiogenic therapy reduces hepatic micrometastases in a murine ocular melanoma model. Current Eye Research. 31 (6), 557-562 (2006).
  9. Rusciano, D., Lorenzoni, P., Burger, M. M. Murine models of liver metastasis. Invasion & Metastasis. 14 (1-6), 349-361 (1994).
  10. Diaz, C. E., Rusciano, D., Dithmar, S., Grossniklaus, H. E. B16LS9 melanoma cells spread to the liver from the murine ocular posterior compartment (PC). Current Eye Research. 18 (2), 125-129 (1999).
  11. Rusciano, D., Lorenzoni, P., Burger, M. M. Murine models of liver metastasis. Invasion & Metastasis. 14 (1-6), 349-361 (1994).
  12. Ashur-Fabian, O., et al. Tetrac delayed the onset of ocular melanoma in an orthotopic mouse model. Frontiers in Endocrinology. 12, 632335(2019).
  13. Elia, G., et al. Mechanisms regulating c-met overexpression in liver-metastatic B16-LS9 melanoma cells. Journal of Cellular Biochemistry. 81 (3), 477-487 (2001).
  14. Harning, R., Szalay, Z. Ocular metastasis of in vivo and in vitro derived syngeneic murine melanoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (9), 1599-1604 (1987).
  15. Ezra-Elia, R., et al. Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice. Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).
  16. Notting, I. C., et al. Whole-body bioluminescent imaging of human uveal melanoma in a new mouse model of local tumor growth and metastasis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (5), 1581-1587 (2005).
  17. Yang, H., et al. In-vivo xenograft murine human uveal melanoma model develops hepatic micrometastases. Melanoma Research. 18 (2), 95-103 (2008).
  18. Murthy, R. K., Haji, S., Sambhav, K., Grover, S., Chalam, K. V. Clinical applications of spectral domain optical coherence tomography in retinal diseases. Biomedical Journal. 39 (2), 107-120 (2016).
  19. Drexler, W., et al. Ultrahigh-resolution ophthalmic optical coherence tomography. Nature Medicine. 7 (4), 502-507 (2001).
  20. Ochakovski, G. A., Fischer, M. D. Phenotyping of mouse models with OCT. Methods in Molecular Biology. 1834, 285-291 (2019).
  21. Zaks, O., et al. In-vivo imaging for assessing tumor growth in mouse models of ocular melanoma. Experimental Eye Research. 204, 108431(2021).
  22. Brar, V. S. American Academy of Ophthalmology 2022-2023 BCSC. 2. Fundamentals and principles of ophthalmology. , (2022).
  23. Duker, J. S., Waheed, N. K., Goldman, D. Handbook of Retinal OCT: Optical Coherence Tomography, 2nd Edition. , Elsevier Health Sciences. (2021).
  24. Tomayko, M. M., Reynolds, C. P. Determination of subcutaneous tumor size in athymic (nude) mice. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 24 (3), 148-154 (1989).
  25. Richards, J. R., Yoo, J. H., Shin, D., Odelberg, S. J. Mouse models of uveal melanoma: Strengths, weaknesses, and future directions. Pigment Cell & Melanoma Research. 33 (2), 264(2020).
  26. Chen, R., et al. Photoacoustic molecular imaging-escorted adipose photodynamic-browning synergy for fighting obesity with virus-like complexes. Nature Nanotechnology. 16 (4), 455-465 (2021).
  27. Yu, Q., et al. Label-free visualization of early cancer hepatic micrometastasis and intraoperative image-guided surgery by photoacoustic imaging. Journal of Nuclear Medicine. 61 (7), 1079-1085 (2020).

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