为了诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（一种多发性硬化症的动物模型），需用含有自身抗原和完全弗氏佐剂的油包水乳剂对小鼠进行免疫。尽管目前已存在多种乳剂制备方案，本文介绍了一种快速、简便且标准化的乳剂均质化制备方法。
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摘要
摘要
实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）与多发性硬化症（MS）具有相似的免疫学和临床特征，因此被广泛用作识别新药物靶点以改善患者治疗的模型。MS具有多种不同的疾病进程：复发-缓解型MS（RRMS）、原发进展型MS（PPMS）、继发进展型MS（SPMS）以及一种罕见的进展-复发型MS（PRMS）。尽管动物模型无法准确模拟所有这些不同的人类疾病表型，但仍存在一些EAE模型可反映MS的部分不同临床表现。例如，在C57BL/6J小鼠中由髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）诱导的EAE模拟人类PPMS，而在SJL/J小鼠中由髓鞘蛋白脂质蛋白（PLP）诱导的EAE则类似于RRMS。其他自身抗原（如髓鞘碱性蛋白（MBP））以及多种不同的小鼠品系也用于EAE的研究。在这些自身抗原免疫诱导的EAE模型中，需制备水包油乳剂并进行皮下注射以诱导疾病。大多数EAE模型还需要注射百日咳毒素以促进疾病发展。为了实现稳定且可重复的EAE诱导，必须采用详细的方案来制备抗原/佐剂乳剂。本文所述方法采用标准化流程制备水包油乳剂，操作简便、快速，并使用振荡式匀浆器替代注射器来制备质量可控的乳剂。
引言
免疫耐受的破坏可能导致自身免疫性疾病的发生，例如多发性硬化症（MS）。据估计，全球有280万人患有MS1。尽管MS的确切病因仍 largely 未知，但自身反应性T细胞和B细胞的失调以及调节性T细胞（Treg）功能缺陷在该疾病的发病机制中起着重要作用2,3。
自身免疫性疾病的动物模型是研究潜在治疗手段的重要工具。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型已被研究多发性硬化症（MS）的科研人员使用了近一个世纪4。早期实验中，该疾病的发病率相对较低。随着含有分枝杆菌（Mycobacterium）和百日咳毒素的完全弗氏佐剂（CFA）的引入，研究人员得以在小鼠中稳定地诱导EAE4。最重要的是，必须将CFA与中枢神经系统（CNS）特异性抗原混合，以制备均一的油包水乳剂，从而诱导EAE。目前最常用的EAE模型是通过使用脑炎性多肽对小鼠进行主动免疫建立的。小鼠的遗传背景在疾病易感性中起着重要作用，其中髓鞘少突胶质细胞糖蛋白多肽（MOG35-55）和髓鞘蛋白脂质蛋白多肽（PLP139-151）分别用于在C57BL/6J和SJL小鼠中诱导EAE....
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方案
所有动物实验均按照瑞典动物研究委员会的规定进行，并经瑞典隆德-马尔默动物伦理委员会批准（许可证号：M126-16）。
注意：该方法的示意图流程见图1。
1. 材料准备
注意：所有试剂均需在无菌操作台内无菌配制，并分装后按指定温度保存。试剂可保存长达2年而不影响其效果。
- 按以下方法制备含 20 mg/mL Mycobacterium tuberculosis 的完全弗氏佐剂（CFA）。
- 将 100 mg 冻干的 M. tuberculosis H37RA（见材料表）和五颗 3.2 mm 钢珠加入一个 7 mL 管中（见材料表）。在均质仪（见材料表）中以最高转速（5,000 rpm）震荡 60 秒。
- 向管中加入 5 mL 不完全弗氏佐剂（IFA），再次以最高转速震荡 60 秒。用移液器将 IFA 中均质后的 M. tuberculosis 悬液（现称为 CFA）转移至新管中，钢珠留在原管，4 °C 保存备用。
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结果
制备完全弗氏佐剂（CFA）/髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）乳剂的快速、简便且标准化的实验方案如图1所示。该方法此前已有文献报道6。CFA/MOG乳剂也可采用其他方法制备，例如传统的注射器乳化法或涡旋法。本研究通过评估乳剂质量对这些方法进行了比较。所有方法均形成了油包水乳剂；通过将少量乳剂滴加至载玻片上，并在相差显微镜下观察，以评估乳剂的均一性和质量。采用振荡均质法制备的乳剂呈现灰白色、豆状颗粒，代表细小的油包水乳滴；而使用注射器法制备的乳剂滴则更大且更白。在涡旋法中观察到较大的灰黑色颗粒，对应于乳剂中 trapped 的气泡（图2A）。
为了检测油包水乳剂的长期稳定性，可使用激光衍射粒度分析仪测量其随时间变化的粒径分布。采用本文所述标准化方案制备的乳剂在6周时间内未显示出粒径的任何变化（图2B）。因此，进一步测试了含有MOG35-55.......
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讨论
水包油乳剂（如抗原/弗氏佐剂）已被用于诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）超过半个世纪17。目前尚无标准化的方法来制备不受人为因素影响的抗原乳剂。大多数实验室采用注射器手动混合作为标准方法，但该方法耗时较长，常导致材料大量损耗，且乳剂质量因操作人员不同而存在差异。
本论文介绍的方法采用标准振荡匀浆机来制备抗原/CFA乳剂。此外，所用的全部试剂均可分装并长期保存，使乳剂的制备更加方便快捷。制备最多80只小鼠所需乳剂的总时间约为30分钟，这与其他已发表的方法形成鲜明对比——后者制备MOG35-55乳剂通常需要1至1.5小时16,18。其他手动方法，例如单注射器法，常会在注射器内引入气泡5。本文所述方法经过专门设计，乳剂从注射器后端推入，从而避免了气泡的引入，并最大限度减少了材料损耗。
为了确保结果.......
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披露
BTB Emulsions AB 已提交一项专利申请，涉及用于制备免疫用乳剂的装置及方法，适用于动物和人类（欧洲专利申请号：EP3836884A1）。BTB 是该公司的首席执行官、创始人，同时也是 BTB Emulsions 的股东。Bertin-Instruments 公司负责在全球范围内分销本出版物中所使用的乳剂试剂盒。
致谢
作者谨此感谢隆德大学的动物饲养单元、Camilla Björklöv 和 Agnieszka Czopek 提供的支持，以及英国牛津大学罗斯伯勒风湿病学研究所 Richard Williams 在本手稿撰写过程中给予的建设性批评和语言方面的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 注射器 | B. Braun | 9166017V | |
| 1 mL 注射器 | Sigma-Aldrich | Z683531 | |
| 7 ml 带盖空管 | Bertin-Instruments | P000944LYSK0A.0 | 7 mL 管 |
| 50 mL 无菌离心管 | Fisher Scientific | 10788561 | 50 mL 管 |
| Bordetella pertussis 毒素 | Sigma-Aldrich | P2980 | 于 -20 °C 保存 |
| 分散剂，轻质矿物油 | Sigma-Aldrich | M8410 | 于室温保存 |
| 乳化试剂盒 | Bertin-Instruments | D34200.10 ea | 包含管、盖和推杆 |
| 不完全弗氏佐剂 | Sigma-Aldrich | F5506 | 于 +4 °C 保存 |
| Mycobacterium tuberculosis, H37RA | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | 于 +4 °C 保存 |
| Mastersizer 2000 | Malvern Panalytical | N/A | 粒径分析仪 |
| Minilys-个人匀浆仪 | Bertin-Instruments | P000673-MLYS0-A | 振荡匀浆仪 |
| MOG 35-55 肽 | Innovagen | N/A | |
| Montanide ISA 51 VG | Seppic | 36362Z | 经 FDA 批准的油性佐剂 |
| Pall Acrodisc 注射器滤器 0.2 μm | Fisher Scientific | 17124381 | 无菌滤器 |
| PBS，无 Ca²⁺/Mg²⁺ | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| 相差显微镜 | Olympus | BX40-B | |
| 3.2 mm 钢珠 | Fisher Scientific | NC0445832 | 高压灭菌后于室温保存 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 648463 | 于室温保存 |
参考文献
- Walton, C., et al. Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition. Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).
- van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M.
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重印与许可
