一种快速、简单且标准化的匀浆方法用于制备抗原/佐剂乳剂以诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎

摘要

为了诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（一种多发性硬化症的动物模型），需用含有自身抗原和完全弗氏佐剂的油包水乳剂对小鼠进行免疫。尽管目前已存在多种乳剂制备方案，本文介绍了一种快速、简便且标准化的乳剂均质化制备方法。

摘要

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）与多发性硬化症（MS）具有相似的免疫学和临床特征，因此被广泛用作识别新药物靶点以改善患者治疗的模型。MS具有多种不同的疾病进程：复发-缓解型MS（RRMS）、原发进展型MS（PPMS）、继发进展型MS（SPMS）以及一种罕见的进展-复发型MS（PRMS）。尽管动物模型无法准确模拟所有这些不同的人类疾病表型，但仍存在一些EAE模型可反映MS的部分不同临床表现。例如，在C57BL/6J小鼠中由髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）诱导的EAE模拟人类PPMS，而在SJL/J小鼠中由髓鞘蛋白脂质蛋白（PLP）诱导的EAE则类似于RRMS。其他自身抗原（如髓鞘碱性蛋白（MBP））以及多种不同的小鼠品系也用于EAE的研究。在这些自身抗原免疫诱导的EAE模型中，需制备水包油乳剂并进行皮下注射以诱导疾病。大多数EAE模型还需要注射百日咳毒素以促进疾病发展。为了实现稳定且可重复的EAE诱导，必须采用详细的方案来制备抗原/佐剂乳剂。本文所述方法采用标准化流程制备水包油乳剂，操作简便、快速，并使用振荡式匀浆器替代注射器来制备质量可控的乳剂。

引言

免疫耐受的破坏可能导致自身免疫性疾病的发生，例如多发性硬化症（MS）。据估计，全球有280万人患有MS¹。尽管MS的确切病因仍 largely 未知，但自身反应性T细胞和B细胞的失调以及调节性T细胞（Treg）功能缺陷在该疾病的发病机制中起着重要作用^2,3。

自身免疫性疾病的动物模型是研究潜在治疗手段的重要工具。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型已被研究多发性硬化症（MS）的科研人员使用了近一个世纪⁴。早期实验中，该疾病的发病率相对较低。随着含有分枝杆菌（Mycobacterium）和百日咳毒素的完全弗氏佐剂（CFA）的引入，研究人员得以在小鼠中稳定地诱导EAE⁴。最重要的是，必须将CFA与中枢神经系统（CNS）特异性抗原混合，以制备均一的油包水乳剂，从而诱导EAE。目前最常用的EAE模型是通过使用脑炎性多肽对小鼠进行主动免疫建立的。小鼠的遗传背景在疾病易感性中起着重要作用，其中髓鞘少突胶质细胞糖蛋白多肽（MOG_35-55）和髓鞘蛋白脂质蛋白多肽（PLP_139-151）分别用于在C57BL/6J和SJL小鼠中诱导EAE⁵。然而，也可使用其他小鼠品系和来源于中枢神经系统的多肽。

CFA/多肽乳剂的质量是决定主动免疫EAE模型疾病外显率的关键因素⁶。必须通过将溶解于水相缓冲液中的致脑炎多肽与CFA混合，制备均一的油包水乳剂，否则动物将不会发病。已有多种关于CFA/多肽乳剂制备的方案被发表。例如使用涡旋振荡器⁷、超声处理⁸、注射器配合三通T型接头⁹，或仅使用单支注射器⁵等方法。然而，这些方法均难以标准化，且通常涉及冗长而复杂的操作流程。

与上述所有方法相比，本文所述的乳剂制备方法具有无个体间差异且相对快速的优点。该乳剂通过匀浆机以设定的转速、时间和温度振荡试剂而生成，可确保快速且结果一致。除了可用于诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中的疾病外，该方法还可用于研究其他自身免疫性疾病模型，如胶原诱导性关节炎（CIA）和抗原诱导性关节炎（AIA）⁶。因此，预计该方法也可稳定地用于依赖含自身抗原的水包油乳剂的其他动物模型，例如实验性自身免疫性神经炎（EAN）¹⁰、实验性自身免疫性甲状腺炎（EAT）¹¹、自身免疫性葡萄膜炎（EAU）¹²以及重症肌无力（MG）¹³。此外，该方法还能稳定诱导迟发型超敏反应（DTH）等普遍的免疫反应⁶，因此也可用于癌症疫苗和疟疾疫苗的递送（见讨论部分）。

因此，本文建立并介绍了一种快速（总制备时间约30分钟）、简便（所有试剂均可预先配制并保存）且标准化（使用振荡式匀浆器完成乳化）的方法。采用本方案制备的完全弗氏佐剂（CFA）/抗原乳剂可稳定地在自身免疫动物模型中诱导疾病发生。

方案

所有动物实验均按照瑞典动物研究委员会的规定进行，并经瑞典隆德-马尔默动物伦理委员会批准（许可证号：M126-16）。

注意：该方法的示意图流程见图1。

1. 材料准备

注意：所有试剂均需在无菌操作台内无菌配制，并分装后按指定温度保存。试剂可保存长达2年而不影响其效果。

1. 按以下方法制备含 20 mg/mL Mycobacterium tuberculosis 的完全弗氏佐剂（CFA）。
   1. 将 100 mg 冻干的 M. tuberculosis H37RA（见材料表）和五颗 3.2 mm 钢珠加入一个 7 mL 管中（见材料表）。在均质仪（见材料表）中以最高转速（5,000 rpm）震荡 60 秒。
   2. 向管中加入 5 mL 不完全弗氏佐剂（IFA），再次以最高转速震荡 60 秒。用移液器将 IFA 中均质后的 M. tuberculosis 悬液（现称为 CFA）转移至新管中，钢珠留在原管，4 °C 保存备用。
2. 向 MOG_35-55 肽的冻干粉（见材料表）中加入超纯水，使最终肽浓度为 10 mg/mL。将溶液经 0.2 µm 滤器过滤除菌。分装为 60 µL 每份，-20 °C 保存备用。
   注意：本实验所用 MOG_35-55 肽为免疫级纯度（约 70%），经三氟乙酸（TFA）裂解，易溶于水，并含有 C 末端酰胺（-NH₂）以增强其体内稳定性¹⁴。肽分装样品从未经历超过两次的冻融循环，保存于 -20 °C 直至使用。
3. 配制 100 mL 百日咳毒素缓冲液：将 2.9 g NaCl 溶解于 80 mL 1x 无 Ca²⁺/Mg²⁺ PBS 中，加入 100 µL 10% Triton X-100。用 PBS 定容至 100 mL，并经 0.2 µm 滤器过滤除菌。分装为 10 mL 每份，4 °C 保存备用。

2. CFA/多肽乳剂的制备

1. 计算免疫接种所需的乳剂用量。在此标准方案中，每只小鼠接种 50 µg MOG_35-55 肽段和 300 µg 分散于弗氏完全佐剂（CFA）中的 M. tuberculosis。制备乳剂所需各试剂（MOG_35-55 肽段、PBS、CFA 和 IFA）的用量可使用补充文件 1进行计算。为补偿乳剂在操作过程中的少量损失，计算时额外增加 20% 的试剂用量。
   注意：本研究所用的商用乳剂试剂盒（见材料表）包含一个管体、螺帽和推杆，封装于无菌袋中。每个乳剂试剂盒管体的最大容量为 9.6 mL，可制备 8 支 1 mL 注射器的乳剂，足够免疫 40 只小鼠（若每只动物使用 100 µL 乳剂，则可免疫 80 只小鼠）。
2. 将商用乳剂试剂盒中的螺帽管及待用试剂置于冰上。
3. 按照步骤 2.1 计算出的体积，依次加入以下乳剂组分：PBS，然后是肽段，接着是含 M. tuberculosis 的 CFA，最后是 IFA。
4. 将管盖拧紧后反复松紧数次以确保密封。用手剧烈振荡管体 5–10 秒，初步混匀试剂。
5. 将管体放入振荡式匀浆仪中，并用固定杆夹紧。将转速调至最高档，时间设为 60 秒。运行结束后，将管体放回冰上静置 3 分钟。以相同设置重复运行一至两次。
6. 以 300 × g 离心 1 分钟，以去除夹带的空气并压缩乳剂。
7. 取下管盖，将推杆插入管体并缓慢下推，直至接触乳剂顶部。通过旋转方式取下管体底部的可折断封口。
8. 取一支注射器（1 mL；见材料表）的推杆弃去。在注射器上安装针头（推荐使用 25–27 G 针头）。
9. 将注射器尾端连接至管体底部的专用卡口，并轻轻旋转锁定。
10. 缓慢推动推杆，将乳剂从管体转移至注射器中。当乳剂达到注射器 0.15 mL 刻度时停止推动。
11. 将注射器与管体分离，小心插入推杆，注意避免空气进入注射器。继续推动推杆，直至乳剂从针头端渗出。
    注意：此时可取少量乳剂用于质量控制（见步骤 3）。
12. 对管体内剩余的乳剂重复步骤 2.8–2.11。
    ​注意：为尽量减少昂贵的 CFA/抗原乳剂的浪费，应使用 1 mL 注射器。也可使用其他可与管体底部专用卡口匹配的注射器；但可能需要制备更大体积的乳剂。CFA/MOG_35-55 肽段乳剂在 4 °C 下可保存长达 15 周，且不影响其诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的能力。

3. 乳液的质量控制

1. 滴落测试：将少量乳液滴入装有 20 mL 冷水的无菌 50 mL 锥形管中。盖紧管盖，手动振荡数秒。若出现细小且彼此分离的液滴，则表明已形成水包油乳液。
2. 使用相差显微镜检查乳液。
   1. 为分析水包油颗粒的尺寸，取少量乳液（2–3 µL）滴加至显微镜载玻片上，用盖玻片涂抹开，然后用力以环形方式按压，使乳液展平。
   2. 在相差显微镜（参见材料表）下以 400 倍放大倍数观察涂布后的乳液，聚焦于呈现单层结构的视野区域。应能观察到细小且大小均一的灰/白色颗粒（图 2A）。
3. 使用激光衍射法分析乳液颗粒尺寸。
   注：激光衍射利用激光束测量颗粒尺寸分布，是乳液的最终质量控制检测方法。采用本方法所得的代表性颗粒尺寸分布结果如图 2B所示（详细描述参见 Topping 等人⁶）。然而，滴落测试与显微镜检查已足以验证是否形成了满意的乳液。
   1. 在颗粒尺寸分析仪（参见材料表）上，将分散剂（见材料表）的红光和蓝光激光折射率均设为 1.456，样品折射率设为 1.33。将折射率的吸收值设为 0.02。
   2. 从含有肽乳液的注射器中取一滴加入含轻质矿物油的分散单元中。乳液分散后立即开始数据采集。
      ​注：在估算颗粒尺寸分布时，采用了通用模型，并假设颗粒为球形。

4. 使用MOG _35-55肽乳剂在C57BL/6J小鼠中诱导EAE

注意：所有实验均使用五只 8 至 12 周龄的雌性 C57BL6/J 小鼠。

1. 免疫前，使用 2.5% 气化异氟烷麻醉小鼠，并通过用力捏压脚趾确认麻醉效果。
2. 使用 1 mL 注射器，在小鼠后侧腹部左右两侧的不同位点进行皮下注射，每只小鼠注射 200 µL 乳剂，其中含有 MOG_35-55 肽段 50 µg，肽段与 CFA 的体积比为 1:1（v/v）。
3. 在乳剂免疫后至少 1.5 小时，以及 24 小时后，通过腹腔注射方式向每只小鼠注射总共 80 ng 的Bordetella 百日咳毒素，溶于 200 µL 百日咳毒素缓冲液中（左侧腹部 100 µL，右侧腹部 100 µL）。
   注意：已有研究表明，百日咳毒素腹腔注射的精确定位对于引流淋巴结中 T 细胞的活化至关重要¹⁵。
4. 可选：在第 7 天再次注射 MOG_35-55 肽段（某些方案中采用此步骤¹⁶），重复步骤 4.2。
   注意：最重要的是，确保用于免疫的含有 MOG/CFA 或百日咳毒素的注射器和针头被妥善弃置于生物危害袋/容器中。
5. 每日评估临床评分，采用先前描述的 0–6 分评分标准⁶。

结果

制备完全弗氏佐剂（CFA）/髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）乳剂的快速、简便且标准化的实验方案如图1所示。该方法此前已有文献报道⁶。CFA/MOG乳剂也可采用其他方法制备，例如传统的注射器乳化法或涡旋法。本研究通过评估乳剂质量对这些方法进行了比较。所有方法均形成了油包水乳剂；通过将少量乳剂滴加至载玻片上，并在相差显微镜下观察，以评估乳剂的均一性和质量。采用振荡均质法制备的乳剂呈现灰白色、豆状颗粒，代表细小的油包水乳滴；而使用注射器法制备的乳剂滴则更大且更白。在涡旋法中观察到较大的灰黑色颗粒，对应于乳剂中 trapped 的气泡（图2A）。

为了检测油包水乳剂的长期稳定性，可使用激光衍射粒度分析仪测量其随时间变化的粒径分布。采用本文所述标准化方案制备的乳剂在6周时间内未显示出粒径的任何变化（图2B）。因此，进一步测试了含有MOG_35-55...

讨论

水包油乳剂（如抗原/弗氏佐剂）已被用于诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）超过半个世纪¹⁷。目前尚无标准化的方法来制备不受人为因素影响的抗原乳剂。大多数实验室采用注射器手动混合作为标准方法，但该方法耗时较长，常导致材料大量损耗，且乳剂质量因操作人员不同而存在差异。

本论文介绍的方法采用标准振荡匀浆机来制备抗原/CFA乳剂。此外，所用的全部试剂均可分装并长期保存，使乳剂的制备更加方便快捷。制备最多80只小鼠所需乳剂的总时间约为30分钟，这与其他已发表的方法形成鲜明对比——后者制备MOG_35-55乳剂通常需要1至1.5小时^16,18。其他手动方法，例如单注射器法，常会在注射器内引入气泡⁵。本文所述方法经过专门设计，乳剂从注射器后端推入，从而避免了气泡的引入，并最大限度减少了材料损耗。

为了确保结果...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 注射器	B. Braun	9166017V
1 mL 注射器	Sigma-Aldrich	Z683531
7 ml 带盖空管	Bertin-Instruments	P000944LYSK0A.0	7 mL 管
50 mL 无菌离心管	Fisher Scientific	10788561	50 mL 管
Bordetella pertussis 毒素	Sigma-Aldrich	P2980	于 -20 °C 保存
分散剂，轻质矿物油	Sigma-Aldrich	M8410	于室温保存
乳化试剂盒	Bertin-Instruments	D34200.10 ea	包含管、盖和推杆
不完全弗氏佐剂	Sigma-Aldrich	F5506	于 +4 °C 保存
Mycobacterium tuberculosis, H37RA	Fisher Scientific	DF3114-33-8	于 +4 °C 保存
Mastersizer 2000	Malvern Panalytical	N/A	粒径分析仪
Minilys-个人匀浆仪	Bertin-Instruments	P000673-MLYS0-A	振荡匀浆仪
MOG 35-55 肽	Innovagen	N/A
Montanide ISA 51 VG	Seppic	36362Z	经 FDA 批准的油性佐剂
Pall Acrodisc 注射器滤器 0.2 μm	Fisher Scientific	17124381	无菌滤器
PBS，无 Ca²⁺/Mg²⁺	Thermo Fisher Scientific	14190144	PBS
相差显微镜	Olympus	BX40-B
3.2 mm 钢珠	Fisher Scientific	NC0445832	高压灭菌后于室温保存
Triton X-100	Sigma-Aldrich	648463	于室温保存