肺炎支原体特异性检测的抗原捕获酶联免疫吸附试验

摘要

在肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）感染中，血清学检测虽可获得较好的检测结果，但由于存在免疫交叉反应，其特异性较低。本文所述的实验室自建抗原捕获ELISA方法具有高度的物种特异性，已被证明是准确诊断M. pneumoniae感染的一种可靠筛查手段。

摘要

肺炎支原体 是一种无细胞壁的原核生物，主要定植于人类呼吸道，常见于较大儿童和年轻成人，在人群中呈地方性流行，每6年出现一次流行高峰。该病原体的诊断 M. pneumoniae 由于病原体的苛养特性以及可能存在无症状携带情况，其实验室诊断具有挑战性。 M. pneumoniae 基于患者血清样本中抗体滴度检测的感染诊断仍是目前最常用的方法。由于使用多克隆血清可能存在免疫交叉反应的问题， M. pneumoniae一种抗原捕获酶联免疫吸附试验（ELISA）已被开发以提高血清学诊断的特异性。ELISA板包被有 M. pneumoniae 多克隆抗体，由兔子产生，经针对一组与之具有共同抗原的异源细菌吸附处理后获得特异性 M. pneumoniae 物种和/或已知可定植于呼吸道。反应后的 M. pneumoniae 同源抗原随后被血清样本中相应的抗体特异性识别。通过对抗原捕获ELISA所涉及的理化参数进行进一步优化，建立了一种高特异性、高灵敏度且可重复的ELISA方法。

引言

Mycoplasmas 是已知最小且最简单的原核生物之一。它们与其他细菌的主要区别在于缺乏细胞壁结构。因此，Mycoplasmas 被归入一个独立的类，称为柔膜体纲（Mollicutes）¹。 细胞壁的缺失使这些微生物对某些抗菌剂具有内在耐药性，并在很大程度上导致了其多形性。Mycoplasmas 具有 较小的基因组和微小的细胞尺寸，这限制了它们的代谢和生物合成能力，也解释了其寄生和腐生的特性¹。

肺炎支原体 是其中之一 支原体 感染 男性，被认为是最具毒力的². M. pneumoniae 定植于上呼吸道，可导致儿童和年轻成人非典型性肺炎。该病原体引发的临床症状包括 M. pneumoniae 感染症状类似流感，表现为头痛、发热和咳嗽³细胞黏附的 M. pneumoniae 宿主细胞的结合由一种包含P1主要黏附蛋白及多种辅助蛋白的黏附细胞器介导^4,5. 由于局部炎症以及宿主免疫系统因病原体....

方案

本研究遵循突尼斯巴斯德研究所伦理委员会规定的伦理准则进行。

1. ELISA 前步骤：先决条件与预处理

1. 细菌菌株与培养基
   注意： 本研究所用的支原体属物种及有细胞壁细菌及其培养基列于 表1.
   1. 柔膜体的培养 物种
      1. 接种 200 µ每种菌株的甘油菌种中取 L，加入 1,800 µL 的培养基。
      2. 在 37℃ 静置培养柔膜体纲物种 ˚5% CO₂，37 °C₂ 2-4天，直至观察到pH变化（pH指示剂为酚红）。
      3. 将培养物体积通过添加1/10量扩大至10 mL^th 将培养物按比例稀释至培养基中，并在相同条件下使其再次生长。
         注意：根据代谢特性，一些人类柔膜体纲物种（肺炎支原体, M. genitalium，以及 M. fermentans）因葡萄糖发酵使培养基酸化，而另一些（M. hominis 和 解脲支原体）分别通过精氨酸水解或尿素水解使培养基碱化。对于禽源支原体而言，Frey培养基的酸化表明其存在 M. gallisepticum，而其碱化则证明了其生长

结果

非吸附多克隆抗体的免疫印迹活性 肺炎支原体 抗异源细菌血清
交叉反应性确实存在，如免疫印迹结果所示（图2）并与阳性对照（第1泳道）比较，部分 M. pneumoniae 抗原与筛选的细菌存在共享。这些交叉反应的强度各不相同。例如， M. gallisepticum 和 M. imitans 抗原与之表现出最强的反应活性 M. pneumoniae 抗血清（第9和第10道），除来源于禽类外 支原体相反，两种人类临床分离株均未表现出 解脲脲原体 未显示任何反应性（第7和第8泳道）。然而，其余人类生殖道 支原体 物种 M. hominis, M. fermentans，以及 M. genitalium 与……产生了显著的交叉反应 M. pneumoniae 抗血清.......

讨论

本文主要介绍了一种实验室自建ELISA方法的通用描述，旨在确保特异性筛查 M. pneumoniae 感染。本文提供了ELISA检测方法本身的详细操作步骤以及一些前处理和后处理步骤。该检测方法的特异性通过吸附技术得以保证。此程序此前已在用于人类和禽类诊断的ELISA检测中有所描述。 支原体^17,24它还被用于ELISA检测，以诊断其他细菌感染，例如莱姆病。²⁵在上述三篇论文中，吸附被证实有助于提高ELISA的特异性，同时不会牺牲或降低其灵敏度。^17,24,25在本ELISA检测中，用于吸附的合适细菌种类可分为两类：第一类包含一些致病性人源和禽源柔膜体纲物种（Mollicutes）M. genitalium, M. ferment.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4-氯-1-萘酚	Sigma-Aldrich	C6788-50 TAB
蛋白胨	BD	211677
胰蛋白胨	BD	211705
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A9647-50 G
碳酸氢盐缓冲液	Sigma-Aldrich	C3041-50 Cap
酪蛋白	Sigma-Aldrich	C7078-1 KG
CMRL1066	VWR	P0058-N1L
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7528-1KG
Difco PPLO 肉汤	BD	255420	Frey 培养基
ELISA 酶标仪	MULTISKAN GO, Thermo Scientific	Ref: 51119200
胎牛血清	Capricorn Scientific	FBS-12A
辣根过氧化物酶标记山羊抗人 IgG	Abcam	ab6759
辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG	Life Technologies	656120
盐酸 37%	Prolab	2025.290
过氧化氢 (H2O2)，30% 溶液	Scharlau	HI01361000
L-精氨酸	Sigma-Aldrich	A5006-1KG
LB 肉汤	突尼斯巴斯德研究所配制		由突尼斯巴斯德研究所细菌学实验室提供
Mycoplasma pneumoniae 多克隆抗血清（兔源）	突尼斯巴斯德研究所制备		由突尼斯巴斯德研究所通过兔免疫制备获得血清
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸	Sigma-Aldrich	N7004-10G
Nunc Maxisorp 平底 96 孔微量滴定板	Invitrogen	44-2404-21
青霉素 G 钠盐（1 MIU）	PANPHARMA
酚红	fluka chemika	77660
脱脂奶粉	MP Biomedicals	902887
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S6297-1KG
碳酸钠	Sigma-Aldrich	S7795-1KG
氯化钠 (NaCl)	Novachim	PS02805
硫酸 (H2SO4) 95-97%	Merck	1007311011
硫柳汞	USB	22215
TMB 底物（3,3’, 5,5’ 四甲基联苯胺溶液）	Abcam	ab142042
Trizma 碱	Sigma-Aldrich	T6791-1 KG
吐温 20	Sigma-Aldrich	1379-500 ML
酵母提取物，粉末，超纯	Thermo Scientific	J23547