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方法文章

肺炎支原体特异性检测的抗原捕获酶联免疫吸附试验

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DOI：

10.3791/64645

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2023年2月24日

 ,  ,  ,  , 
1Group of Mycoplasmas, Laboratory of Molecular Microbiology, Vaccinology, and Biotechnology Development, Pasteur Institute of Tunis

本文内容

摘要

在肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）感染中，血清学检测虽可获得较好的检测结果，但由于存在免疫交叉反应，其特异性较低。本文所述的实验室自建抗原捕获ELISA方法具有高度的物种特异性，已被证明是准确诊断M. pneumoniae感染的一种可靠筛查手段。

摘要

肺炎支原体 是一种无细胞壁的原核生物，主要定植于人类呼吸道，常见于较大儿童和年轻成人，在人群中呈地方性流行，每6年出现一次流行高峰。该病原体的诊断 M. pneumoniae 由于病原体的苛养特性以及可能存在无症状携带情况，其实验室诊断具有挑战性。 M. pneumoniae 基于患者血清样本中抗体滴度检测的感染诊断仍是目前最常用的方法。由于使用多克隆血清可能存在免疫交叉反应的问题， M. pneumoniae一种抗原捕获酶联免疫吸附试验（ELISA）已被开发以提高血清学诊断的特异性。ELISA板包被有 M. pneumoniae 多克隆抗体，由兔子产生，经针对一组与之具有共同抗原的异源细菌吸附处理后获得特异性 M. pneumoniae 物种和/或已知可定植于呼吸道。反应后的 M. pneumoniae 同源抗原随后被血清样本中相应的抗体特异性识别。通过对抗原捕获ELISA所涉及的理化参数进行进一步优化，建立了一种高特异性、高灵敏度且可重复的ELISA方法。

引言

Mycoplasmas 是已知最小且最简单的原核生物之一。它们与其他细菌的主要区别在于缺乏细胞壁结构。因此，Mycoplasmas 被归入一个独立的类，称为柔膜体纲（Mollicutes）1。 细胞壁的缺失使这些微生物对某些抗菌剂具有内在耐药性，并在很大程度上导致了其多形性。Mycoplasmas 具有 较小的基因组和微小的细胞尺寸，这限制了它们的代谢和生物合成能力，也解释了其寄生和腐生的特性1。

肺炎支原体 是其中之一 支原体 感染 男性，被认为是最具毒力的2. M. pneumoniae 定植于上呼吸道，可导致儿童和年轻成人非典型性肺炎。该病原体引发的临床症状包括 M. pneumoniae 感染症状类似流感，表现为头痛、发热和咳嗽3细胞黏附的 M. pneumoniae 宿主细胞的结合由一种包含P1主要黏附蛋白及多种辅助蛋白的黏附细胞器介导4,5. 由于局部炎症以及宿主免疫系统因病原体紧密黏附而受到刺激，可能出现更多临床表现 M. pneumoniae 到气道黏膜6尽管肺炎是其显著特征 M. pneumoniae 感染后发现，该细菌感染还可导致多种非肺部表现，累及中枢神经系统、心脏、皮肤和关节等不同解剖部位7.

对于所有 支原体 物种，诊断的 M. pneumoniae 具有挑战性。提示支原体病的临床症状大多不明显且无特异性8由于诊断极为困难 M. pneumoniae 仅依靠临床表现和症状进行感染诊断时，实验室筛查显得尤为重要9检测 M. pneumoniae 通过培养获得菌落是正确诊断的金标准方法。然而，由于该方法对生长条件要求苛刻，且获得明确结果所需时间较长（1–2周），使得培养过程复杂化，因此很少用于常规诊断。10核酸扩增技术在速度和效率方面已得到验证，但由于其相对较高的成本以及在部分医疗机构中无法获得，这些分子技术尚未被视为一线诊断检测方法。确实，商业化的PCR检测已被广泛用于诊断 M. pneumoniae 感染，但它们仍无法取代血清学检测。此外，PCR检测频繁出现假阴性和假阳性结果，限制了其应用9血清学检测仍然是实验室中常规用于诊断的最常用方法 M. pneumoniae 感染。数十年来已报道了多种血清学方法，例如冷凝集素试验、补体结合试验11，间接血凝试验12免疫荧光13，以及ELISA技术，该技术于20世纪80年代初首次应用于支原体血清学检测14,15,16进行ELISA血清学诊断时遇到的主要问题之一是 M. pneumoniae 感染的交叉反应会显著降低该技术的特异性。人血清的非特异性吸附 M. pneumoniae 抗原此前已有报道；事实上，通过ELISA在人血清中检测到的许多抗体可能并不总是与支原体抗原结合17，由于其普遍性 M. pneumoniae 含有一些细菌18,19 以及一些动物和人类组织20.

由于实验室中常规使用的 ELISA 检测方法存在较高的背景读数，结果判读常常复杂，因此准确诊断 M. pneumoniae 感染成为一项艰巨任务。面对这一问题，我们选择通过去除待测抗体与 M. pneumoniae 抗原之间的非特异性反应，来改进 M. pneumoniae ELISA 检测方法。为此，我们采用吸附技术选择性地去除非特异性的 M. pneumoniae 抗原。事实上，抗原捕获 ELISA 的主要目标是特异性检测人血清样本中的 M. pneumoniae 免疫球蛋白（Ig）G。该 ELISA 方法的核心在于，在加入人血清样本之前，优先选择性地捕获 M. pneumoniae 特异性抗原。这种特异性通过将 M. pneumoniae 粗制抗原与实验室中家兔产生的 M. pneumoniae 多克隆抗血清孵育来实现，并通过针对一组异源细菌进行吸附处理，使其具有种属特异性；这些细菌属于或不属于柔膜体纲（Mollicutes），与 M. pneumoniae 存在共同抗原，和/或已知可定植于呼吸道。吸附过程重复进行三次，并通过免疫印迹法检测其消除交叉反应的有效性。所建立的 ELISA 检测方法结合了夹心法与间接法 ELISA 的原理。简言之，首先用针对 M. pneumoniae 的多克隆抗血清包被 ELISA 板孔；随后加入 M. pneumoniae 抗原，使其被捕获于抗血清与待测血清样本中的抗体之间。形成的免疫复合物通过酶标记的二抗（辣根过氧化物酶标记的 IgG）进行检测。通过添加显色底物显色反应，并用分光光度法测定吸光度。该自建 ELISA 方法的原理示意图见 图 1。这种自制 ELISA 在特异性检测 M. pneumoniae 感染方面被证实有效，目前已成为常规诊断工作中最常采用的检测方法之一。

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方案

本研究遵循突尼斯巴斯德研究所伦理委员会规定的伦理准则进行。

1. ELISA 前步骤：先决条件与预处理

  1. 细菌菌株与培养基
    注意： 本研究所用的支原体属物种及有细胞壁细菌及其培养基列于 表1.
    1. 柔膜体的培养 物种
      1. 接种 200 µ每种菌株的甘油菌种中取 L，加入 1,800 µL 的培养基。
      2. 在 37℃ 静置培养柔膜体纲物种 ˚5% CO₂，37 °C2 2-4天，直至观察到pH变化（pH指示剂为酚红）。
      3. 将培养物体积通过添加1/10量扩大至10 mLth 将培养物按比例稀释至培养基中，并在相同条件下使其再次生长。
        注意：根据代谢特性，一些人类柔膜体纲物种（肺炎支原体, M. genitalium，以及 M. fermentans）因葡萄糖发酵使培养基酸化，而另一些（M. hominis 和 解脲支原体）分别通过精氨酸水解或尿素水解使培养基碱化。对于禽源支原体而言，Frey培养基的酸化表明其存在 M. gallisepticum，而其碱化则证明了其生长 M. imitans.
      4. 铺板50 µL 的培养物接种于琼脂平板以确认细菌生长。将琼脂平板置于 37 °C 培养 ˚5% CO₂ 条件下 37 °C培养2 并在显微镜下定期观察，注意典型的荷包蛋样菌落的出现（支原体）以及暗色海胆样菌落（脲原体).
    2. 非支原体的生长 物种
      1. 在37℃下，将非柔膜体细菌接种于3 mL培养基中进行培养 ˚C，振荡（200 rpm）过夜。
      2. 将培养物的浊度与对照培养基进行比较，以确认菌体生长。
      3. 将培养物体积通过添加扩大至10 mL，添加比例为1/100th 将培养物按比例稀释后接种于培养基中，并在相同条件下继续培养。
  2. 抗原制备
    1. 柔膜体属物种抗原制备
      1. 收获整个蛋白质（存在于经确认的培养物中） 肺炎支原体 以及其它柔膜体纲物种）在 40,000 x g 在 4 ˚30 分钟，C
      2. 弃去上清液，用1 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）重悬沉淀，重复离心洗涤三次，每次离心条件相同。
      3. 将每种抗原重悬于 500 µL PBS
    2. 非柔膜体抗原制备 物种
      1. 离心过夜培养的非-1,500 倍下的柔膜体细菌 x g 15分钟。
      2. 将每份细菌沉淀重悬于 500 µL 的 PBS。
        注意：使用牛血清白蛋白作为标准品，采用经典的Bradford定量法测定蛋白质浓度21. 脉冲体属（Mollicutes）物种的蛋白质浓度通常在 0.7–4.8 mg/mL 之间。其他细菌物种的蛋白质浓度可达 20 mg/mL。所有抗原均保存于 -20 ˚C，直至后续使用。
  3. 免疫印迹法交叉反应性筛查
    1. 通过将8 µL 抗原与等体积的上样缓冲液（0.5 M Tris-HCl；pH 6.8，10% 甘油 [v/v]，10% SDS [w/v]，0.2% 溴酚蓝）混合后，将混合物于 100 ℃ 孵育 ˚5 分钟，C
      注意：变性处理旨在使蛋白质携带负电荷并破坏其二级结构，从而使其能够在聚丙烯酰胺凝胶中迁移，并根据分子量进行分离。
    2. 使变性的蛋白质（100 µ每孔 g 蛋白）进行 Laemmli 法十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）22 使用12%分离胶和5%浓缩胶进行电泳，随后按照Towbin等人的方法将蛋白质通过电泳转移至硝酸纤维素膜上23.
    3. 将硝酸纤维素膜浸入含5%脱脂奶粉的PBS溶液中，室温下封闭30分钟，以阻断未占据的表面。随后将蛋白印迹膜在室温下与兔多克隆抗体共同孵育2小时。 肺炎支原体 抗血清（由突尼斯巴斯德研究所制备）用 PBS-Tween 20 稀释至 1/200，随后用辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗兔 IgG 抗体用 PBS-Tween 20 稀释至 1/2,000，在室温下孵育 1 小时。
    4. 用 PBS 洗去未结合的抗体，然后将硝酸纤维素膜置于底物溶液（4-氯-1-萘酚，H2O25–15 分钟后加入水终止反应。
  4. 吸附程序
    注意：为消除多克隆抗体之间的交叉反应 肺炎支原体 抗血清与异源细菌抗原，采用Ben Abdelmoumen和Roy先前描述的吸附程序24 被采用。
    1. 制备12种异源细菌的抗原混合物（疑似与 肺炎支原体），在微量离心管中混匀，并将蛋白浓度调整至与实验中待吸附抗血清量的一半相对应。
      注意：不同实验之间的体积和浓度有所不同。此步骤主要取决于待吸附抗体的浓度。例如，若抗体浓度为 3.56 mg/mL，则抗原混合物（由 12 种异源细菌组成）的浓度应为 1.78 mg/mL（即每种抗原约 0.148 mg）。
    2. 将抗原混合物在14,000 x g 4℃下离心10分钟 °C，收集合并的沉淀，并将其与纯化的多克隆抗-肺炎支原体 IgG，37℃孵育2小时 °C，缓慢搅拌。
    3. 孵育后，将悬液在14,000 x g 4℃下10分钟 °C 并收集上清液（即特异性多克隆） 肺炎支原体 抗血清
      ​注意：为确保多克隆抗体的特异性 肺炎支原体 抗血清，重复吸附步骤三次。在用于ELISA检测之前，经吸附处理的多克隆 肺炎支原体 抗血清应通过免疫印迹法检测其对所包含的细菌组别是否存在交叉反应。

2. ELISA 步骤：实验本身

  1. 用捕获抗体包被微孔板
    1. 将 捕获抗体（经预吸附处理的M. pneumoniae多克隆抗血清）用0.1 M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液（pH 9.6）稀释至浓度为10 µg/mL。
    2. 向每孔加入100 µL稀释后的捕获抗体，对96孔ELISA板进行包被。
    3. 4 ˚C过夜孵育后，弃去包被液，并用洗涤缓冲液（每升含146.29 g NaCl、39.4 g Tris-HCl、0.2 g硫柳汞和0.5 mL Tween 20；pH 7.3）洗涤5次。
  2. 封闭
    1. 向各孔加入100 µL封闭液（PBS中含0.5%酪蛋白），以封闭包被孔中剩余的结合位点。
    2. 室温孵育1小时。
    3. 用移液器吸去封闭液，并用洗涤缓冲液洗涤5次。
  3. 抗原的加入
    1. 向所有包被孔中加入等量的M. pneumoniae全蛋白（每孔10 ng）。
    2. 室温反应2小时。
    3. 弃去未结合的抗原溶液，并用洗涤缓冲液洗涤5次。
  4. 待测样本与对照的加入
    1. 将待测样本（人血清）及对照（参考阳性与阴性血清）用PBS-Tween 20缓冲液分别稀释至1/200、1/400和1/800。
    2. 向相应孔中加入100 µL稀释后的样本和对照，每个反应设复孔。将未加抗原和血清的孔标记为空白孔。
    3. 室温孵育90分钟后，弃去血清溶液，并用洗涤缓冲液洗涤5次。
  5. 酶标记检测抗体的加入
    1. 将酶标记的检测抗体（HRP标记的抗兔和抗人IgG）用PBS-Tween 20缓冲液稀释至1/10,000。
    2. 向每孔加入100 µL适当稀释的检测抗体。
    3. 室温避光孵育1小时后，弃去未结合的检测抗体，并用洗涤缓冲液洗涤5次。
  6. 检测与数据分析
    1. 向每孔加入100 µL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）显色液，以显示抗原-抗体结合情况。
    2. 室温显色30分钟后，加入100 µL终止液（7.5% H2SO4）终止酶促反应。
    3. 使用酶标仪在450 nm波长处读取吸光度，并根据阳性指数（IP）的计算结果进行判读。
      IP = 待测血清吸光度 / 临界值吸光度
      IP < 0.7：阴性结果
      IP = 0.7：应在2周内重复检测
      IP > 0.7：阳性结果
      注：IP计算公式由实验室自行设定，0.7的阈值经优化后确定。对于复孔反应，取吸光度的平均值。最佳血清稀释度和抗原浓度通过ELISA棋盘滴定法确定（数据未显示）。临界值 = 参考阳性血清（与样本相同稀释倍数）的光密度（OD），其OD值应至少为阴性对照OD值的3倍。

3. ELISA 后续步骤：结果评估与检测验证

  1. 通过使用 M. pneumoniae 和异源细菌的抗原进行补充性免疫印迹，评估本实验室 ELISA 在受试患者中特异性诊断 M. pneumoniae 感染的能力，以确认受试人血清中 M. pneumoniae 抗体的阳性反应性及其他疑似细菌抗体的阴性反应性（数据未显示）。

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结果

非吸附多克隆抗体的免疫印迹活性 肺炎支原体 抗异源细菌血清
交叉反应性确实存在，如免疫印迹结果所示（图2）并与阳性对照（第1泳道）比较，部分 M. pneumoniae 抗原与筛选的细菌存在共享。这些交叉反应的强度各不相同。例如， M. gallisepticum 和 M. imitans 抗原与之表现出最强的反应活性 M. pneumoniae 抗血清（第9和第10道），除来源于禽类外 支原体相反，两种人类临床分离株均未表现出 解脲脲原体 未显示任何反应性（第7和第8泳道）。然而，其余人类生殖道 支原体 物种 M. hominis, M. fermentans，以及 M. genitalium 与……产生了显著的交叉反应 M. pneumoniae 抗血清...

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讨论

本文主要介绍了一种实验室自建ELISA方法的通用描述，旨在确保特异性筛查 M. pneumoniae 感染。本文提供了ELISA检测方法本身的详细操作步骤以及一些前处理和后处理步骤。该检测方法的特异性通过吸附技术得以保证。此程序此前已在用于人类和禽类诊断的ELISA检测中有所描述。 支原体17,24它还被用于ELISA检测，以诊断其他细菌感染，例如莱姆病。25在上述三篇论文中，吸附被证实有助于提高ELISA的特异性，同时不会牺牲或降低其灵敏度。17,24,25在本ELISA检测中，用于吸附的合适细菌种类可分为两类：第一类包含一些致病性人源和禽源柔膜体纲物种（Mollicutes）M. genitalium, M. ferment...

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披露

作者声明不存在任何竞争利益。

致谢

本研究由突尼斯卫生部以及突尼斯高等教育与科学研究部资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4-氯-1-萘酚Sigma-AldrichC6788-50 TAB
蛋白胨BD211677
胰蛋白胨BD211705
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA9647-50 G
碳酸氢盐缓冲液Sigma-AldrichC3041-50 Cap
酪蛋白Sigma-AldrichC7078-1 KG
CMRL1066 VWRP0058-N1L
D-葡萄糖Sigma-AldrichG7528-1KG
Difco PPLO 肉汤BD255420Frey 培养基
ELISA 酶标仪MULTISKAN GO, Thermo ScientificRef: 51119200
胎牛血清Capricorn ScientificFBS-12A
辣根过氧化物酶标记山羊抗人 IgGAbcamab6759
辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgGLife Technologies656120
盐酸 37%Prolab2025.290
过氧化氢 (H2O2)，30% 溶液ScharlauHI01361000
L-精氨酸Sigma-AldrichA5006-1KG
LB 肉汤突尼斯巴斯德研究所配制由突尼斯巴斯德研究所细菌学实验室提供
Mycoplasma pneumoniae 多克隆抗血清（兔源）突尼斯巴斯德研究所制备由突尼斯巴斯德研究所通过兔免疫制备获得血清
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸Sigma-AldrichN7004-10G
Nunc Maxisorp 平底 96 孔微量滴定板 Invitrogen44-2404-21
青霉素 G 钠盐（1 MIU）PANPHARMA
酚红fluka chemika77660
脱脂奶粉MP Biomedicals902887
碳酸氢钠 Sigma-AldrichS6297-1KG
碳酸钠Sigma-AldrichS7795-1KG
氯化钠 (NaCl)NovachimPS02805
硫酸 (H2SO4) 95-97%Merck1007311011
硫柳汞USB22215
TMB 底物（3,3’, 5,5’ 四甲基联苯胺溶液）Abcamab142042
Trizma 碱Sigma-AldrichT6791-1 KG
吐温 20Sigma-Aldrich1379-500 ML
酵母提取物，粉末，超纯Thermo Scientific J23547 

参考文献

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