利用线粒体与溶酶体荧光染料可视化线粒体自噬

摘要

线粒体自噬是线粒体质量控制的主要机制。然而，线粒体自噬的评估 体内 由于缺乏可靠的定量检测方法，该过程受到限制。本文介绍了一种利用细胞膜通透性绿色荧光线粒体染料和红色荧光溶酶体染料，在活细胞中观察线粒体自噬的实验方案。

摘要

线粒体作为细胞的能量工厂，在生物能量学、自由基生成、钙稳态和细胞凋亡中发挥重要作用。线粒体自噬是线粒体质量控制的主要机制，通常通过显微镜观察进行研究，然而 体内 线粒体自噬检测难以实施。通过成像活细胞器来评估线粒体自噬是线粒体研究中一种必要且可行的替代方法。本实验方案详细描述了在活细胞中使用细胞通透性绿色荧光线粒体染料MitoTracker Green和红色荧光溶酶体染料LysoTracker Red的操作步骤，包括染料加载、线粒体与溶酶体的可视化观察以及预期结果。同时提供了在活细胞中评估线粒体自噬的详细步骤，以及关于显微镜软件设置的技术说明。该方法可帮助研究人员利用活细胞荧光显微镜观察线粒体自噬过程，此外还可用于线粒体和溶酶体的定量分析及线粒体形态的评估。

引言

线粒体几乎是所有真核细胞的能量工厂^1,2。除了通过氧化磷酸化产生ATP外，线粒体还在生物能量学、钙稳态、自由基生成、细胞凋亡以及细胞稳态等其他过程中发挥关键作用^3,4,5。由于线粒体在电子传递链的多个复合物中产生活性氧（ROS），因此会持续受到潜在氧化应激的刺激，当抗氧化防御系统崩溃时，最终可能导致结构损伤和功能障碍^6,7。线粒体功能障碍已被发现与多种疾病相关，包括代谢紊乱、神经退行性疾病和心血管疾病⁸。因此，维持健康的线粒体群体及其正常功能至关重要。线粒体是高度可塑且动态的细胞器，其形态和功能受线粒体质量控制机制调控，包括线粒体蛋白的翻译后修饰（PTM）、线粒体生物合成、融合、分裂以及线粒体自噬^9,10。由动力相关蛋白1（DRP1）介导的线粒体分裂——DRP1是动力蛋白超家族的一种GTP酶——会导致形成小而圆的线粒体，并将功能异常的线粒体分离出来，进而通过线粒体自噬途径被清除和降解^11,12。

线粒体自噬是一种通过自噬选择性降解线粒体的细胞过程，通常发生在受损的线粒体中，继发于损伤、衰老或应激之后。随后，这些线粒体会被运送至溶酶体进行降解¹⁰。因此，线粒体自噬是一种分解代谢过程，有助于在多种细胞类型中维持线粒体的数量和质量处于健康状态。它在正常生理条件和应激条件下对恢复细胞稳态起着关键作用^13,14。细胞具有复杂的线粒体自噬机制，该机制可由不同的细胞应激信号和发育变化所诱导。线粒体自噬的调控通路可分为泛素依赖性或受体依赖性^15,16；其中泛素依赖性自噬由激酶PINK1介导，并招募泛素连接酶Parkin E3至线粒体^17,18，而受体依赖性自噬则涉及自噬受体与微管相关蛋白轻链LC3的结合，后者在响应线粒体损伤时介导线粒体自噬¹⁹。

透射电子显微镜（TEM）是观察和检测线粒体自噬最常用的方法之一，至今仍是最佳方法之一²⁰。线粒体自噬的形态学特征是自噬体或由自噬体与溶酶体融合形成的自噬溶酶体，这些结构可在电子显微镜图像中观察到²¹。然而，电子显微镜（EM）的局限性在于无法在活细胞中实时监测线粒体自噬的动态过程，例如线粒体去极化、线粒体分裂以及自噬体与溶酶体的融合²⁰。因此，通过成像活细胞器来评估线粒体自噬，成为线粒体研究中一种颇具吸引力的替代方法。本文所述的活细胞成像技术使用两种荧光染料分别标记线粒体和溶酶体。当线粒体自噬发生时，被自噬体包裹的受损或多余线粒体会被线粒体染料染成绿色，而溶酶体则被红色染料标记。这些自噬体与溶酶体融合后形成自噬溶酶体，导致绿色和红色荧光重叠，呈现为黄色斑点，从而指示线粒体自噬的发生²²。细胞可渗透的线粒体染料（MitoTracker Green）含有轻度巯基反应性的氯甲基基团，用于标记线粒体²³。标记线粒体时，只需将细胞与染料共孵育，染料即可被动扩散穿过质膜并在有活性的线粒体中富集。该线粒体染料可高效染色活细胞，但对醛类固定的细胞或死细胞染色效果较差。溶酶体染料（LysoTracker Red）是一种荧光酸性探针，用于在活细胞中标记和追踪酸性细胞器。该染料对酸性细胞器具有高度选择性，可在纳摩尔浓度下有效标记活细胞²⁴。

本文介绍了在活细胞中使用这些荧光染料的操作步骤，包括染料的加载以及线粒体和溶酶体的可视化。该方法可帮助研究人员利用活细胞荧光显微镜观察线粒体自噬过程，也可用于定量分析线粒体和溶酶体，并评估线粒体的形态学特征。

方案

1. 细胞培养与传代

注意：本方案以常规培养的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）为例进行描述。

1. 使用10 mL的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）在10 cm细胞培养皿中培养MEF细胞。在37 °C、5% CO₂条件下孵育，并在100倍显微镜下观察细胞。
2. 进行常规细胞传代。
   1. 当细胞达到80%–90%融合度（每3天一次）时，用2 mL杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤细胞。随后加入2 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA作用1分钟以解离细胞，再加入2 mL DMEM终止胰蛋白酶-EDTA的作用。将细胞悬液在100 × g条件下离心3分钟，并将细胞沉淀重悬于1 mL DMEM中。
   2. 使用自动细胞计数仪和细胞计数板（见材料表）对细胞进行计数，然后将1.5 × 10⁶个细胞接种至新的含有10 mL DMEM的10 cm细胞培养皿中。
3. 进行线粒体自噬检测时，按照步骤1.2.1制备细胞悬液。用新鲜DMEM将细胞悬液稀释至1 × 10⁵个细胞/mL。
4. 将2 mL稀释后的细胞悬液加入20 mm共聚焦培养皿（见材料表），并在"十字"形摇动培养皿。将细胞培养皿置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育24小时。

2. 线粒体染色

1. 从 -20 °C 冰箱中取出绿色荧光线粒体染料和红色荧光溶酶体染料的储备液分装样品（参见材料表）。
2. 将储备液用 DMEM 按 1:1,000 比例稀释，配制染料的工作液，并充分混匀。例如，向 2 mL DMEM 中分别加入 2 µL 的 1 mM 线粒体染料和溶酶体染料，使两种染料的工作浓度均为 1 µM。
3. 移除共聚焦培养皿中的培养基（步骤 1.4）。加入 1 mL 染色液（按步骤 2.2 配制）覆盖细胞。将细胞培养皿置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中孵育 20–30 分钟。

3. 共聚焦成像

1. 配制 1 L 的 Krebs-Henseleit (KH) 缓冲液（138.2 mM NaCl、3.7 mM KCl、0.25 mM CaCl₂、1.2 mM KH₂PO₄、1.2 mM MgSO₄·7H₂O、15 mM 葡萄糖和 21.85 mM HEPES；最终 pH 值为 7.4），并在 4 °C 下保存（最长 1 个月）。
2. 共聚焦成像当天，提前将 KH 缓冲液从冰箱中取出，并预热至室温（20 至 25 °C）。
3. 设置共聚焦显微镜成像软件参数（见材料表）：对于双激发图像，采用 488 nm 和 543 nm 的顺序激发，分别在 505–545 nm 和 >560 nm 范围内收集发射光。
   注意：按如下方式设置成像参数。扫描模式：帧扫描；速度：9；平均次数：1；增益：450 至 600；针孔：30 至 200；激光功率：<10%。建议先启动成像软件，再完全打开 488 nm 激光。543 nm 激光需开启并稳定 3–5 分钟后方可使用（图 1A）。
4. 从培养箱中取出含染料的培养基（步骤 2.3），向培养皿中加入 1 mL KH 缓冲液。
5. 为诱导线粒体自噬，用 1 µM（终浓度）的羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP）溶于 KH 缓冲液中，在室温下处理细胞 10 分钟，随后立即使用共聚焦显微镜对细胞进行成像。
6. 在 63 倍油镜顶部滴加适量镜油（见材料表）。将细胞样品置于共聚焦显微镜的样品台上，并移动至物镜正上方。
7. 在软件界面左上角点击定位 选项卡（图 1B），使用成像软件寻找样品。为实验选择绿色滤光片组。
8. 使用粗调焦旋钮上下移动物镜进行快速对焦。当通过目镜清晰看到细胞样品后，搜索并聚焦单个细胞区域，并将其移至视野中心。
9. 在软件界面左上角点击采集选项卡以获取图像。预览时仅选择 488 nm 通道和 1024 × 1024 的帧分辨率。
10. 在软件界面左上角点击实时 选项卡以开始实时扫描。调节视野至最清晰状态，并通过左右移动滑块调节激光功率（图 1A）。保持增益设置低于 600，以避免过曝。
11. 将针孔值调整为 156，增益值为 545，数字偏移值为 0。
12. 选择最佳视野，勾选两个通道（488 nm 和 543 nm），并选择 1024 × 1024 的帧分辨率。点击快照 以获取二维图像。保存所采集的图像。
    ​注意：绿色线粒体染料的激发峰为 490 nm，发射峰为 516 nm；可使用 488 nm 激光激发。红色溶酶体染料的激发峰为 576 nm，发射峰为 590 nm；可使用 543 nm 激光激发。

4. 图像分析

1. 使用 ImageJ 打开已保存的图像，并将合并后的图像导入其中。
2. 手动计数每个细胞中黄色斑点的数量，这些斑点表明溶酶体正在吞噬线粒体。

结果

MitoTracker Green 是一种绿色荧光线粒体染料，能够准确地定位于线粒体。该染料可轻松染色活细胞，但对醛类固定或已死亡的细胞染色效果较差（图 2）。红色荧光溶酶体染料 LysoTracker Red 能够标记并追踪酸性溶酶体细胞器，且仅可用于活细胞染色（图 2）。共聚焦显微镜成像可实现对经相应染料染色的线粒体和溶酶体的可视化观察（图 1 和 图 2）。

线粒体自噬是一种通过自噬选择性降解线粒体的分解代谢细胞过程，通常发生在损伤、衰老或应激后的受损线粒体中²⁰。随后，这些线粒体会被运送至溶酶体进行降解。线粒体自噬有助于在多种细胞类型中维持线粒体的数量和质量，使其处于健康状态。在健康的哺乳动物细胞中，线粒体自噬发生频率较低，因此需要其他刺激来诱导该过程^25...

讨论

本文所述方案提供了一种通过共染色细胞膜通透性线粒体和溶酶体染料，来评估和监测活细胞中线粒体自噬动态过程的方法，该过程涉及自噬小体、溶酶体以及线粒体分裂。该方法还可用于识别线粒体并评估线粒体形态。本研究中使用的两种染料均需避光保存，应避免多次冻融，并尽可能分装为单次使用剂量。建议配制染料的工作液，避免直接将染料加入细胞培养基中，以防局部浓度过高及染料混合不均。为避免染色其他细胞结构，MEF细胞应在共聚焦显微镜成像前染色30分钟。建议在成像前立即进行染色操作。在MEF细胞中，1 µM的线粒体染料和溶酶体染料可分别良好地定位于线粒体和溶酶体；浓度过高会导致细胞毒性及对其他细胞结构的非特异性染色。该浓度同样适用于H9C2细胞中线粒体和溶酶体的染色。对于其他细胞系，需优化染料浓度和染色时间，以确保染料能良好地定位于相应细胞器。为获得清晰的线粒体和溶酶体图像，必须认真调整图像采集参数（见步骤3.3中的注释）。接种前必须对细胞进行计数，以确保接种时细胞融合度达到50%-60%，这对于获取单个活细胞的清晰图像至关重要。若实验室无共聚焦培养皿，可使用圆形盖玻片作为替代。在某些动物研究中，尤其是在临床检查中，由于缺乏可靠且便捷的定量实验手段，难以在活体动物...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
自动细胞计数仪	Countstar	IC1000
细胞计数板	Countstar	12-0005-50
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Corning	10-013-CV
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）	Corning	21-031-CVC
玻璃底细胞培养皿（共聚焦培养皿）	NEST	801002
Image J（Rasband，NIH）	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Krebs–Henseleit（KHB）缓冲液			自行配制
LysoTracker Red	Invitrogen	1818430	100 µmol/L，红色荧光溶酶体染料
MitoTracker Green	Invitrogen	1842298	200 µmol/L 储存液，绿色荧光线粒体染料
小鼠胚胎成纤维细胞			自行制备
物镜（63倍油镜）	ZEISS	ZEISS LSM 880
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Gibico	Cat# 25200056
ZEISS LSM 880 共聚焦激光扫描显微镜	ZEISS	ZEISS LSM 880
ZEN 显微镜软件 2.1（共聚焦显微镜成像软件）	ZEISS	ZEN 2.1