用荧光染料可视化线粒体和溶酶体的线粒体自噬

摘要

线粒体自噬是线粒体质量控制的主要机制。然而， 由于 缺乏可靠的定量测定，体内线粒体自噬的评估受到阻碍。这里介绍的是使用细胞通透性绿色荧光线粒体染料和红色荧光溶酶体染料观察活细胞中线粒体自噬的方案。

摘要

线粒体是细胞的动力源，在生物能量学、自由基生成、钙稳态和细胞凋亡中起着重要作用。线粒体自噬是线粒体质量控制的主要机制，通常使用显微镜观察进行研究，但 体内 线粒体自噬测定难以进行。通过对活细胞器进行成像来评估线粒体自噬是线粒体研究的另一种必要方法。该协议描述了在活细胞中使用细胞通透性绿色荧光线粒体染料MitoTracker Green和红色荧光溶酶体染料LysoTracker Red的程序，包括染料的负载，线粒体和溶酶体的可视化，以及预期结果。还提供了评估活细胞线粒体自噬的详细步骤，以及有关显微镜软件设置的技术说明。这种方法可以帮助研究人员使用活细胞荧光显微镜观察线粒体自噬。此外，它还可用于量化线粒体和溶酶体并评估线粒体形态。

引言

线粒体是几乎所有真核细胞的动力源^1，2。除了通过氧化磷酸化产生ATP外，线粒体在其他过程中起着至关重要的作用，例如生物能量学，钙稳态，自由基生成，细胞凋亡和细胞稳态³，^4，5。当线粒体从电子传递链中的多个复合物产生活性氧（ROS）时，它们不断受到潜在氧化应激的刺激，当抗氧化防御系统崩溃时，最终会导致结构损伤和功能障碍6^，7。已发现线粒体功能障碍会导致许多疾病，包括代谢紊乱、神经变性和心血管疾病⁸。因此，维持健康的线粒体种群及其正常功能至关重要。线粒体是高度可塑性和动态的细胞器;它们的形态和功能受线粒体质量控制机制控制，包括线粒体蛋白的翻译后修饰（PTM）、线粒体生物发生、融合、裂变和线粒体自噬9^，10。由动态蛋白相关蛋白 1 （DRP1）（动态蛋白超家族的 GTP 酶）介导的线粒体裂变导致小而圆的线粒体并分离功能失调的线粒体，线粒体可以被线粒体自噬清除....

方案

1. 细胞培养和传代

注意:该方案以常规培养的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）为例进行描述。

1. 在 10 cm 细胞培养皿中用 10 mL Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM） 培养 MEF 细胞。在37°C和5%CO₂ 下孵育，并在显微镜下以100倍放大倍率监测细胞。
2. 进行常规细胞传代。
   1. 当细胞达到80%-90%汇合度（每3天）时，用2mL的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）洗涤细胞。然后加入 2 mL 的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 1 分钟以解离细胞，然后加入 2 mL DMEM 以停止胰蛋白酶-EDTA 的作用。将细胞悬液以 100 x g 离心 3 分钟，并将细胞沉淀重悬于 1 mL DMEM 中。
   2. 使用自动细胞计数器和细胞计数室载玻片对细胞进行计数（参见 材料表），然后将1.5 x 10⁶ 个细胞接种到含有10 mL DMEM的新10 cm细胞培养皿中。
3. 对于线粒体自噬测定，如步骤1.2.1中制备细胞悬液。在新鲜DMEM中将细胞悬液稀释至1 x 10⁵ 个细胞/ mL。
4. 将 2 mL 稀释的细胞悬液加入 20 mm 共聚焦培养皿中（参见 材料表

结果

MitoTracker Green是一种绿色荧光线粒体染色剂，能够准确地定位为线粒体。该染料很容易染色活细胞，并且在染色醛固定细胞或死细胞方面效果较差（图2）。红色荧光溶酶体染料LysoTracker Red能够标记和跟踪酸性溶酶体细胞器，并且只能对活细胞进行染色（图2）。共聚焦显微镜成像允许可视化用适当染料染色的线粒体和溶酶体（图1 和 图2）。

线粒体自噬是一种分解代谢细胞过程，通过自噬选择性地降解线粒体，自噬通常发生在损伤、衰老或应激后的受损线粒体中²⁰.随后，这些线粒体被递送到溶酶体进行降解。线粒体自噬有助于在多种细胞类型中将线粒体的数量和质量维持在健康状态。在健康的哺乳动物细胞中，线粒体自噬很少发生，因此需要其他刺激来诱导这一过程²⁵。羰基氰.......

讨论

这里描述的方案提供了一种评估和监测活细胞中线粒体自噬的动态过程的方法，包括自噬体、溶酶体和线粒体裂变，通过与细胞通透的线粒体和溶酶体染料共染色。该方法还可用于识别线粒体和评估线粒体形态。本研究中使用的两种染料都应避光，应避免多次冻融循环，并且染料应尽可能以一次性等分试样储存。建议制备染料的工作溶液，以避免将它们直接添加到细胞培养基中，这可能导致高局部浓度和染料混合不充分。为避免染色其他细胞结构，MEF细胞应在用共聚焦显微镜成像之前染色30分钟。建议在成像前立即进行染色程序。在MEF细胞中，1μM的线粒体和溶酶体染料分别在线粒体和溶酶体中定位良好，较高的染料浓度导致细胞毒性以及其他细胞结构的非特异性染色。该浓度也是染色H9C2细胞中线粒体和溶酶体的最佳选择。对于其他细胞系，需要优化染料浓度和染色时间，以使染料能够很好地定位到细胞器。为了获得清晰的线粒体和溶酶体图像，必须认真调整图像采集参数（参见步骤3.3中的注释）。50%-60%的细胞汇合对于获得单个活细胞图像至关重要，因此必须在接种前对细胞进行计数。如果实验室没有共聚焦培养皿，可以使用圆形盖玻片作为替代方案。在一些动物研究中，特别是在临床检查中，由于缺乏可靠方便的定量实验来研究线粒体自.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
自动细胞计数仪	Countstar	IC1000
细胞计数室玻片	Countstar	12-0005-50
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM）	康宁	10-013-CV
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS）	康宁	21-031-CVC
玻璃底细胞培养皿（共聚焦培养皿）	NEST	801002
Image J （Rasband， NIH）	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Krebs–Henseleit（KHB） 缓冲液			自制
LysoTracker Red	Invitrogen	1818430	100 µmol/L，红色荧光溶酶体染料
MitoTracker Green	Invitrogen	1842298	200 µmol/L 原液，绿色荧光线粒体染料
小鼠胚胎成纤维细胞			自制备
物镜（63 倍油透镜）		蔡司 LSM 880
胰蛋白酶-EDTA 0.25%	吉比科	Cat# 25200056
蔡司 LSM 880 共聚焦激光扫描显微镜	蔡	蔡司 LSM 880
ZEN 显微镜软件 2.1（共聚焦显微镜成像软件）	ZEISS	ZEN 2.1