需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

由微血管片段构建血管化产热脂肪组织的三维培养

2.9K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/64650

⸱

2023年2月3日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center, 2Department of Biomedical Engineering and Chemical Engineering, University of Texas at San Antonio, 3Institute of Regenerative Medicine, University of Texas at San Antonio

本文内容

摘要

本文介绍了一种详细方案，阐述如何利用从啮齿类动物或人类脂肪组织中分离出的微血管片段，作为一种简便的方法来构建具有功能性的血管化米色脂肪组织。

摘要

产热型脂肪组织（例如米色或棕色脂肪组织）的构建已被研究作为代谢性疾病的一种潜在疗法，或用于设计个性化的微组织以进行健康筛查和药物测试。目前的策略通常较为复杂，且难以准确、全面地再现产热型脂肪组织的多细胞结构和功能特性。微血管片段是从脂肪组织中分离出的微小完整微血管，包含小动脉、小静脉和毛细血管，可作为自体细胞的单一来源，支持血管化及脂肪组织的形成。本文介绍了优化培养条件的方法，以实现从微血管片段生成三维、具有血管化且功能性的产热型脂肪组织，包括从脂肪组织中分离微血管片段的方案以及相应的培养条件。此外，还讨论了最佳操作实践、工程化组织的表征技术，并提供了来自啮齿类动物和人类微血管片段的示例结果。该方法有望用于促进对肥胖症和代谢性疾病的理解及其治疗手段的开发。

引言

本实验方案的目的是描述一种从单一且可能为自体来源的微血管片段（MVF）构建具有血管化的米色脂肪组织的方法。已有研究表明，棕色和米色脂肪组织在代谢调控方面具有有益作用；然而，成人体内这些脂肪组织库的体积较小，限制了其对全身代谢的影响，尤其是在肥胖或2型糖尿病等疾病状态下1,2,3,4,5,6,7。棕色/米色脂肪作为治疗靶点，对于预防与肥胖及其共病相关的有害代谢效应具有重要意义，正受到广泛关注8,9,10,11,12。

微血管片段（MVFs）是从脂肪组织中直接分离、培养并以三维构型长期维持的血管结构13,14,15。我们课题组及其他研究团队此前已开始利用MVFs的多细胞性和多向分化潜能，特别是在脂肪组织形成方面的应用16,17,18。在此基础上，我们近期证明，来源于健康及2型糖尿病啮齿类模型19以及高龄（50岁以上）人类受试者20的MVFs中，含有可被诱导形成产热型（即米色）脂肪组织的细胞。

本文介绍了一种创新方法，利用单一来源的多能血管基质细胞（MVF），不仅能够生成米色脂肪组织，还能同时形成其相关且关键的血管组分21。该技术的应用对于寻求简便组织工程策略以生成产热性脂肪组织的研究具有重要价值。与其他致力于构建米色脂肪组织的方法22,23,24,25,26,27,28不同，本研究所描述的方法无需使用多种细胞类型或复杂的诱导方案。可利用来源于啮齿类动物和人类的MVF构建带血管化的米色脂肪和白色脂肪模型，展现出良好的转化潜力。本实验方案的最终产物是一种结构和代谢功能与棕色脂肪组织相当的工程化米色产热脂肪组织。总体而言，本方案提出了一种易于获取且可能实现自体移植的MVF来源，或可成为研究代谢性疾病的一种有价值的治疗干预手段和研究工具。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本研究遵循《动物福利法》和《动物福利条例实施规定》，并符合《实验动物护理与使用指南》中的原则。所有动物实验程序均经圣安东尼奥德克萨斯大学机构动物护理和使用委员会批准。

注意：以下步骤使用雄性 Lewis 大鼠。对于雌性动物以及小鼠微血管片段（MVF）的采集，需对方案进行轻微调整29。若使用人源微血管片段（h-MVF）的方案，则仅需执行按照试剂盒说明书重悬 h-MVF、制备生长培养基（1.3）、形成纤维蛋白水凝胶（5）以及培养（6）等步骤。有关本方案的总体流程，请参见图 1。

用于细胞培养的微血管片段分离和纤维蛋白水凝胶形成过程示意图
图1：实验流程示意图。 使用微血管片段（MVF）形成产热型脂肪组织在分析前的六个关键步骤分解图。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 试剂制备

注意：以下试剂对应一只大鼠，称重和配制均在生物安全柜内进行。

  1. 在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制牛血清白蛋白（BSA）。
    1. 在 PBS 中配制 10 mg/mL (1.0%) 的 BSA 溶液，用于后续稀释至洗涤步骤（1 mg/mL，0.1%）和消化反应（4 mg/mL，0.4%）。
    2. 按照步骤1.1.3至1.1.5，制备不同浓度的BSA，如步骤1.1.1所述。
    3. PBS 中的 10 mg/mL BSA（PBS 中 1% BSA）
      1. 将500 mg BSA和500 mL PBS加入50 mL锥形管中，涡旋混匀以溶解BSA。
      2. 如果产生过多气泡，将溶液在 350 x g 2 分钟。使用滤器对该溶液进行过滤除菌 0.22 µm 尼龙网滤器
    4. PBS 中的 1 mg/mL BSA（PBS 中 0.1% BSA）
      1. 将15 mL浓度为10 mg/mL的BSA PBS溶液加入到135 mL PBS中，总体积为150 mL，于500 mL无菌瓶中进行1:10稀释，轻轻摇动瓶子以确保混合均匀。
    5. PBS 中含 4 mg/mL BSA（即 PBS 中含 0.4% BSA）
      1. 将35 mL的10 mg/mL BSA PBS溶液与57.5 mL PBS加入至100 mL无菌瓶中，总体积稀释至1:2.5，轻轻摇动瓶子以确保混合均匀。
  2. 用 BSA 配制胶原酶，用于消化切碎的脂肪组织。
    1. 制备 6 mg/mL 胶原酶溶液。
      1. 在50 mL锥形管中，称取72 mg胶原酶（标签注明“用于Epi”）。
      2. 在三个 50 mL 离心管中，分别称取 144 mg 胶原酶（标记为“for Ing 1”、“for Ing 2”和“for SubQ”）。
      3. 将称量好的胶原酶在4 ˚C下保存至使用。
        注意：在消化前立即加入 BSA/PBS，不要提前添加。
      4. 向含有72 mg胶原酶的试管中加入12 mL PBS中的4 mg/mL BSA溶液。
      5. 向含有 144 mg 胶原酶的试管中加入 24 mL 浓度为 4 mg/mL 的 PBS 溶解 BSA。
      6. 振荡试管以确保溶液均匀，并用滤器对溶液进行过滤除菌 0.22 µm 尼龙网滤器
  3. 制备添加氨基己酸（ACA）的生长培养基，用于培养/分化分离得到的MVFs。
    1. 生长培养基（GM）：在DMEM中添加20% FBS、1%青霉素-链霉素（pen strep）、0.2%支原体预防剂和1 mg/mL ACA。
    2. 制备白色脂肪诱导培养基（WAM）。
      1. WAM 诱导：在 DMEM/F12 培养基中添加 20% FBS、1% 青霉素-链霉素、0.2% 支原体预防剂 10 µg/mL 胰岛素, 10 µm forskolin 1 µm 地塞米松和1 mg/mL ACA。
        注意：对于人源微血管内皮细胞（h-MVFs），还需添加 125 µM 吲哚美辛
      2. WAM 培养基维护：在 DMEM/F12 中添加 20% FBS、1% 青霉素-链霉素、0.2% 支原体预防剂 5 µg/mL 胰岛素和 1 mg/mL ACA。
        注意：对于人源多能血管细胞（h-MVFs），需将胰岛素浓度调整为 10 µg/mL.
    3. 制备米色脂肪诱导培养基（BAM）。
      1. BAM诱导：在DMEM/F12培养基中添加20% FBS、1%青霉素-链霉素、0.2%支原体预防剂 10 µg/mL 胰岛素, 10 µm forskolin 1 µm 地塞米松 1 µm 罗格列酮、20 nM 3,3′,5-三碘-L-甲状腺原氨酸（T3）和1 mg/mL ACA。
        注意：对于人源心肌成纤维细胞（h-MVFs），需将T3的浓度调整为120 nM。
      2. BAM 维持培养：在 DMEM/F12 培养基中添加 20% FBS、1% 青霉素-链霉素、0.2% 支原体预防剂 5 µg/ml 胰岛素, 10 µm forskolin 1 µm 罗格列酮、20 nM T3 和 1 mg/mL ACA。
        注意：对于人源多能血管细胞（h-MVFs），需将胰岛素浓度调整为 10 µg/mL 并将 T3 浓度调整至 120 nM。
  4. 制备凝血酶（仅在无库存分装溶液时需要制备），用于制备纤维蛋白凝胶中的凝血剂。
    1. 10 U/mL 凝血酶溶于双蒸水2O:
      1. 使用 1–5 mL 去离子水重悬凝血酶粉末2将生产商提供的小瓶中的O溶解，并将重悬液转移至250 mL烧杯中。
      2. 将溶液定容至100 mL，反复吹打混匀多次，确保形成均一溶液。将溶液分装至15 mL锥形管中（约10 mL/管），于-20 ˚C冰箱中保存。
        注意：使用前需在室温（RT）下解冻凝血酶。

2. 工具/材料准备

注意：所有仪器在使用前均应进行高压灭菌/消毒。

  1. 附睾/腹股沟/皮下脂肪组织分离（手术需在指定手术区域进行）
    1. 确保准备一次性垫巾、两把剪刀、一把止血钳（可选）、两把镊子，以及四个50 mL锥形管，每管内含10–15 mL含1 mg/mL BSA（0.1%）的PBS溶液。
  2. 微血管片段分离
    1. 组织剪切（在生物安全柜中进行）：准备三个未包被的无菌100 mm培养皿、一对镊子和一对弯头剪刀。
    2. 消化与分离（在生物安全柜中进行）：准备一对剪刀、一对镊子、八个未包被的无菌100 mm培养皿、三个未包被的无菌35 mm培养皿、已称重并置于4 °C的胶原酶、四个250 mL培养瓶、一个中央带孔的塑料支架、四个500 µm筛网（裁成直径约3英寸的圆形方块）、四个37 µm筛网（裁成直径约3英寸的圆形方块），以及11个50 mL锥形管。
  3. 纤维蛋白重悬
    1. 制备纤维蛋白水凝胶（在生物安全柜中进行）：确保纤维蛋白原、凝血酶和生长培养基（在试剂制备阶段配制）均已备好。

3. 脂肪分离方案

  1. 初步步骤
    1. 使用乙醇填充烧杯，以在使用手术器械前对其进行清洗和消毒。接着，准备好用于处理大鼠的操作台，并备好真空装置，以便在剃毛步骤中吸除产生的毛发。
    2. 准备一个装有冰的桶，将预先准备好的50 mL离心管（每管含10 mL浓度为1 mg/mL的BSA）放入其中。相应地标记各离心管。
      注意：由于需要提取两侧的腹股沟脂肪，且该区域收集到的脂肪量通常大于附睾脂肪和背部皮下脂肪，因此可能需要准备两个独立的离心管分别盛放。
    3. 在指定的手术区域内，准备好已实施安乐死的大鼠及所需的手术工具。通常根据IACUC规程，采用CO2对大鼠实施安乐死。
    4. 使用电动剪毛器，在目标区域周围剃除大鼠体毛。具体而言，为分离附睾脂肪和腹股沟脂肪，需剃除会阴部之间至腹部一半区域的毛发（建议在此区域使用较小的剃毛器）。为获取位于肩胛骨之间的背部皮下脂肪，需剃除整个背部的毛发（由于大鼠背部毛发较厚，建议使用较大的剃毛器）。
    5. 用70%乙醇喷洒大鼠体表，进行无菌处理。通常建议对将要切开的区域清洁两次。
  2. 不同脂肪库的分离
    1. 腹股沟（皮下）
      1. 将大鼠置于仰卧位，用剪刀提起阴茎下方的皮肤。从中心开始，用剪刀横向剪开，形成“V”形切口，并环绕至大鼠背部，以充分暴露整个脂肪库。注意切口应浅表进行，确保下方脂肪组织保持完整。在切割过程中，需切断连接皮肤与脂肪的筋膜组织，实现皮肤与脂肪的分离（图2A）。
      2. 当筋膜被适当剪开后，确认两侧腹股沟脂肪均已暴露（腹股沟脂肪从腹股沟区域向背部延伸）。随后，将两侧脂肪分别移入含有10 mL浓度为1 mg/mL BSA的两个独立离心管中（图2B）。
    2. 附睾（内脏）
      1. 通过切开腹部皮肤及包裹睾丸的薄层组织，采集附睾脂肪（图2C）。
      2. 用镊子轻轻拉出脂肪组织，并用剪刀将其剪下。操作时应避免解剖任何明显可见的主要血管（若需同时采集睾丸和附睾组织，可在生物安全柜中清洁步骤时一并移除）。
      3. 小心地将取出的脂肪放入含有10 mL PBS中浓度为1 mg/mL BSA的50 mL离心管中。
        注意：附睾脂肪的去除应在腹股沟脂肪移除之后进行。附睾脂肪体积通常较小，位于腹股沟脂肪下方，处于包裹睾丸和附睾的腹部皮肤之下。
    3. 背部皮下
      1. 将大鼠转为俯卧位（背部朝上），使用大号剪刀从背部皮肤开始剪开（该区域皮肤较厚），一直剪至头皮，注意不要剪得过深，仅需切至皮肤下方即可（图2D）。
      2. 切断连接皮肤与深层组织的筋膜；脂肪位于肩胛间区域。应注意区分/分离皮下脂肪与棕色脂肪，棕色脂肪更靠近脊柱（图2E）。
      3. 分离后，将脂肪放入相应含有10 mL PBS中浓度为1 mg/mL BSA的50 mL离心管中。

小鼠脂肪组织解剖示意图；腹股沟脂肪、附睾脂肪和皮下脂肪的切口位置已标出。
图 2：不同脂肪组织库的分离。（A）切除腹股沟脂肪组织所需的初始切口。（B）腹股沟脂肪库的位置。（C）附睾脂肪库的位置，注意需切开外层皮肤以获得通路。（D）将小鼠置于俯卧位后，为获取其他脂肪组织所需追加的切口。（E）后部皮下脂肪库的位置。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 微血管片段分离方案

  1. 将含有大鼠切除脂肪组织的50 mL锥形管放入生物安全柜中。
  2. 使用镊子将脂肪组织转移至标准100 mm培养皿中（内含约0.5 mL PBS配制的1 mg/mL BSA，以保持组织湿润）。
  3. 清除脂肪组织中可见的血管、肌肉及其他非脂肪组织。
  4. 用剪刀剪碎脂肪组织约10分钟（剪碎至可用10 mL移液器转移的程度）。
  5. 加入约0.5 mL PBS配制的1 mg/mL BSA检查是否有团块；如有必要，继续剪碎。
  6. 用10 mL移液器将剪碎的脂肪转移至无菌250 mL锥形瓶中。
    注意：使用移液器记录转移体积。
  7. 加入足够量的BSA（1 mg/mL），使最终体积达到20 mL。
  8. 向胶原酶中加入PBS配制的4 mg/mL BSA（胶原酶终浓度：6 mg/mL）（例如，72 mg胶原酶加12 mL，144 mg胶原酶加24 mL）。
    注意：剪碎完成前请勿加入，因该步骤对时间敏感。
  9. 轻轻摇动锥形管以确保溶液均匀，并使用0.22 µm尼龙滤膜过滤除菌。
  10. 对于附睾脂肪，于37 °C水浴中消化约8–10分钟；对于腹股沟及后部皮下脂肪，消化约15–20分钟，期间持续以环形方式摇动锥形瓶（当脂肪仅剩少量团块时立即停止消化）。
  11. 将消化后的脂肪转移至50 mL锥形管中（每管约30 mL），并标记为“已消化脂肪”。
  12. 以400 × g离心4分钟；离心后沉淀应呈红色（图3A）。
  13. 离心期间，将无菌37 µm筛网和500 µm筛网置于含5 mL PBS配制的1 mg/mL BSA的无菌培养皿中预湿备用。
  14. 离心结束后，将上清液小心倾入标记为“废弃物”的50 mL锥形管中。倾倒时应轻柔操作，以去除表层脂肪，避免扰动由微血管片段（MVF）形成的沉淀。
  15. 向含有沉淀的管（“已消化脂肪”）中加入10 mL PBS配制的1 mg/mL BSA。吹打混悬沉淀2次（上下移液）。
  16. 操作沉淀时应避免过于剧烈，以防破坏组织片段。
  17. 将500 µm筛网置于新的培养皿中，放置于塑料筛网支架上方（图3B）。
  18. 使用移液器将“已消化沉淀”管中的10 mL液体以同心圆方式加至500 µm筛网上（图3C）。
  19. 用额外5 mL PBS配制的1 mg/mL BSA冲洗滤膜。目标细胞将通过滤膜进入培养皿中，因此弃去500 µm筛网，但保留培养皿中的滤过液体。
  20. 将37 µm筛网置于新的培养皿中，放置于塑料筛网支架上方。
  21. 更换移液器吸头，以避免使用37 µm筛网时引入团块。
  22. 将第一次过滤所得液体以同心圆方式加至37 µm筛网上。
  23. 用额外5 mL PBS配制的1 mg/mL BSA冲洗滤膜。目标细胞将保留在滤膜上，因此弃去滤过液体，但保留37 µm筛网。
  24. 将37 µm筛网滑入含有5 mL PBS配制的1 mg/mL BSA的新培养皿中。
  25. 通过轻敲培养皿于锥形管架上来震落片段。避免剧烈震荡，以防液体或细胞溅出培养皿。
  26. 用额外5 mL PBS配制的1 mg/mL BSA冲洗滤膜。目标细胞将保留在培养皿中的液体中。保留37 µm筛网及含有脱落片段的液体用于后续步骤。
  27. 将含BSA及片段的液体转移至无菌50 mL锥形管中。
  28. 重复多次用约5 mL PBS配制的1 mg/mL BSA冲洗37 µm筛网，并将冲洗液加入锥形管中，直至收集总体积达约15–20 mL。最终，目标细胞将从培养皿中的液体收集至锥形管中；最后一次冲洗后弃去37 µm筛网，但保留含有脱落片段的液体于50 mL锥形管中。
  29. 用剪刀剪去200 µL移液器吸头的尖端。轻轻摇动50 mL管，取出两份20 µL样品，分别放入洁净的35 mm培养皿中。
  30. 在培养皿中计数每份样品中的片段数量，以计算分离得到的MVF总数。
    总片段数 = 总悬液计算公式：((样品1总数 + 样品2总数)/2) × 锥形管中50 mL。
  31. 将剩余含脱落片段的液体在50 mL锥形管中以400 × g离心4分钟，以收集MVF。

脂肪分离的离心方法示意图；装置包括滤器和培养皿的排列。
图3：MVF的分离。（A）脂肪组织消化后，经离心得到含MVF的沉淀和上清液的分离示意图。（B）用于过滤和捕获MVF的耗材布局。（C）过滤/洗涤步骤中同心圆方法的示意图。请点击此处查看该图的放大版本。

5. 纤维蛋白水凝胶的形成

  1. 示例计算：
    注意：以下是接种密度约为 15,000–20,000 个 MVF/mL、纤维蛋白原：凝血酶凝胶比例为 2:5（纤维蛋白原浓度为 20 mg/mL）时的计算过程。
    1. 若需制备五个 250 µL 的凝胶，总共需要 1,250 µL 体积。为避免移液误差，建议按 1.5 mL 总体积进行配制。
      1. 纤维蛋白原所需体积的计算方法如下：
        体积分析化学比例方程 \( \frac{2}{7} = \frac{X_1}{1500 \, \mu L} \)。，X1 = 428.57 µL 纤维蛋白原
      2. 凝血酶所需体积的计算方法如下：
        比例计算公式 \(5/7 = X_2/1500 \, \mu\text{L}\)，用于浓度平衡计算。，X2 = 1,071.43 µL 凝血酶
      3. 由于实际需要 428.57 µL 纤维蛋白原，建议配制 500 µL，具体如下：
        20 mg/mL × 0.5 mL = 10 mg 纤维蛋白原。将其溶解于 500 µL DMEM 中
      4. 为获得每个凝胶，按以下方式计算纤维蛋白原和凝血酶的体积：
        1. 纤维蛋白原：
          稀释计算比例方程 2/7 = X₁/250μL，教学示意图。，X1 = 71.43 µL 纤维蛋白原（溶于 DMEM）+ MVF
        2. 凝血酶：
          表示稀释过程中比例关系的方程；5/7 = X₂/250μL；适用于化学计算。，X2 = 178.57 µL 凝血酶
  2. MVF 纤维蛋白凝胶制备
    1. 将 50 mL 锥形管中离心后的碎片上清液大部分倒出，使用移液器吸除附着在管口边缘的少量液体。
    2. 将凝血酶加入将要制备凝胶的孔中（图 4A）。
    3. 剪去 200 µL 移液枪头的尖端，用纤维蛋白原轻柔重悬 MVF，使其在凝胶中的终浓度约为 15,000–20,000 个 MVF/mL。
    4. 剪去 200 µL 移液枪头的尖端，将 MVF 与纤维蛋白原混合液轻轻加入含凝血酶的溶液中。迅速吹打混匀，确保形成均一混合物。重复此步骤直至所有凝胶制备完成（图 4B）。
    5. 将培养板放入培养箱（37 °C，5% CO2）中孵育约 15 分钟，以促进凝胶交联（图 4C）。
    6. 向每孔中加入 100–150 µL 生长培养基。

纤维蛋白水凝胶形成示意图：凝血酶、纤维蛋白原、MVFs；生物化学过程。
图 4：MVF 纤维蛋白凝胶的形成。（A）将 5/7 份的凝血酶混合物加入相应的孔中。（B）接着，使用剪去尖端的移液枪头（以避免扰动 MVFs），将 2/7 份的纤维蛋白原 + MVF 混合物加入孔中并轻轻混匀。（C）最后，将所有制备好的凝胶置于 37 °C 培养箱中孵育，待水凝胶完全固化后，再加入培养基。请点击此处查看该图的放大版本。

6. MVFs 的培养条件

  1. 对于非血管化的白色和米色脂肪组织（+ GM 对照）的培养，请使用 图5 中所示的时间线19。
  2. 对于血管化的白色和米色脂肪组织（+ GM 对照）的培养，请使用 图6 中所示的时间线19。
  3. 水凝胶应在培养期间置于培养箱中（37 °C，5% CO2），每隔一天更换一次培养基。关于样品的固定与分析处理，请参考已发表的文献16,19,20。

显示GM、WAM、BAM诱导和成熟阶段的血管生成与脂肪生成时间线示意图。
图5：非血管化脂肪组织形成的时序。 本图改编自Acosta等人的研究19。请点击此处查看此图的放大版本。

血管生成时间线示意图：GM-GM、GM-WAM、GM-BAM 通路；诱导与成熟过程。
图6：血管化脂肪组织形成的时序。 本图改编自 Acosta 等人19。请点击此处查看该图的放大版本。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

米色/棕色脂肪组织具有几个关键的表型形态学特征：其为多房性/含有较小的脂滴，含有大量线粒体（因此呈现特征性的“棕褐色”外观） 体内），相应地具有较高的耗氧率/线粒体生物能量活性，高度血管化，脂解作用增强且胰岛素刺激的葡萄糖摄取增加，最显著的特征是高表达解偶联蛋白1（UCP1），这是一种参与产热性呼吸的线粒体蛋白19,30.

因此，在表征 MVF 分化为米色脂肪组织的能力时，我们进行了一系列分析，以可视化 MVF 的转化过程（图 7、图 8），从基因水平上加以确认（图 9、图 10），并进行功能性测定（图 11）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

棕色/米色脂肪组织工程领域目前尚处于不成熟阶段22,23,24,25,26,27,28，大多数脂肪组织模型均针对白色脂肪组织开发8,22,31。工程化的棕色/米色微组织通常需要多种细胞来源或基因改造，以获得天然棕色脂肪组织的部分表型特征8,11,

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

致谢

Acosta 博士获得美国国立卫生研究院资助 CA148724 和 TL1TR002647 的支持。Gonzalez Porras 博士获得美国国立卫生研究院下属国家糖尿病与消化及肾脏疾病研究所资助，资助编号为 F32-0DK122754。本研究部分得到美国国立卫生研究院（5SC1DK122578）以及德克萨斯大学圣安东尼奥分校生物医学工程系的支持。本内容由作者全权负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。部分图片使用 Biorender.com 制作。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氨基己酸Sigma AldrichA2504-100G在DMEM中以1 mg/mL的浓度添加
钝头剪刀Fisher scientific12-000-172高压灭菌器中灭菌
牛血清白蛋白（BSA）Millipore126575-10GM在 PBS 中稀释至 4 mg/mL 和 1 mg/mL
I型胶原酶Fisher scientificNC9633623用含4 mg/mL BSA的溶液稀释至6 mg/mL，用于消化切碎的脂肪
地塞米松赛默飞世尔科技AC230302500以乙醇稀释至2 mg/ml的储存浓度
一次性护理垫Fisher scientific23-666-062手术期间用于液体吸收
解剖剪Fisher scientific08-951-5高压灭菌器中灭菌
杜尔贝科′s 改良伊格尔′s 培养基（DMEM）Fisher scientific11885092
杜尔贝科′s 改良伊格尔′DMEM/F12 培养基（Ham's F-12 营养混合物）Sigma AldrichD8062
胎牛血清 Fisher scientific16140089在DMEM中添加至20%（v/v）。
纤维蛋白原 Sigma AldrichF8630-25G在 DMEM 中以 20 mg/mL 浓度溶解，存在于血浆中的蛋白质，水凝胶的主要成分
250 mL 锥形瓶Fisher scientificFB500250利用较大的表面积实现脂肪的消化
镊子Fisher scientific50-264-21高压灭菌，用于组织和滤膜的处理
ForskolinSigma AldrichF6886以乙醇稀释至10 mM的储存浓度
人源MVFAdvanced Solutions Life Sciences, LLChttps://www.advancedsolutions.com/microvessels本研究使用了从三位不同患者（52岁、54岁和56岁女性）分离的人源微血管片段（hMVFs）。 
吲哚美辛 Sigma AldrichI7378以乙醇稀释至12.5 mM的储备浓度
猪胰岛素Sigma AldrichI5523用 0.01 N HCl 稀释至 5 mg/ml 的储备浓度
MycoZapFisher scientificNC9023832添加至DMEM中至0.2% w/v，支原体预防剂 
青霉素/链霉素（10,000 U/mL）Fisher scientific15140122在DMEM中添加至1% v/v。
培养皿，聚苯乙烯（100 mm × 15 mm）Fisher scientific3510293 用于去除血管和剪碎组织，8（盖）用于筛网预浸泡 & 8（培养皿），用于500或37过滤时 µM 筛选
培养皿，聚苯乙烯（35 mm × 10 mm）Fisher scientific50-202-036用于计数微血管片段
磷酸盐缓冲液（PBS）Fisher scientific14-190-250用无菌去离子水稀释至1倍浓度。
大鼠剪毛器（Andwin Mini Arco 宠物修剪器）Fisher scientificNC0854141
罗格列酮Fisher scientificR0106200MG用DMSO稀释至10 mM的储备浓度
剪刀Fine Science Tools14059-111 把用于初始切口，1 把用于附睾切口，1 把用于尖端剪切
屏幕  37 µM 卡罗来纳生物供应公司652222R切成3段" 圆形方块，经环氧乙烷灭菌，用于微血管片段的截留及去除极小片段、单细胞和碎片
筛选 500 µM 卡罗来纳生物供应公司652222F切成3段" 圆形方块，经环氧乙烷灭菌，去除较大碎片/碎屑
锯齿止血钳Fisher scientific12-000-171在高压灭菌器中灭菌，用于切口前夹紧皮肤
Steriflip 滤器 0.22 μm MilliporeSE1M179M6
凝血酶Fisher scientific6051601KU用去离子水稀释至 10 U/mL，用作凝血剂，使纤维蛋白原转化为纤维蛋白
甲状腺激素（T3）Sigma AldrichT2877用1N NaOH稀释至0.02 mM的储备浓度
Zucker 糖尿病肥胖（ZDF）大鼠——肥胖型（FA/FA）或瘦型（FA/+）雄性 查尔斯河https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611
https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611		购自查尔斯河实验室（Wilmington, MA）。大鼠在4周龄时获取，并饲喂Purina 5008饲料至安乐死（15–19周龄）。本研究中使用的所有FA/FA大鼠的葡萄糖水平（取自外侧隐静脉的血液）均高于300 mg/dL。所有动物均饲养于温度受控的环境中，采用12小时光照-黑暗循环，自由进食。

参考文献

  1. Cohen, P., Spiegelman, B. M. Brown and beige fat: molecular parts of a thermogenic machine. Diabetes. 64 (7), 2346-2351 (2015).
  2. Liu, X., et al. Brown adipose tissue transplantation reverses obesity in Ob/Ob mice. Endocrinology. 156 (7), 2461-2469 (2015).
  3. Tharp, K. M., Stahl, A. Bioengineering beige adipose tissue therapeutics. Frontiers in Endocrinology. 6, 164(2015).
  4. Barquissau, V., et al. White-to-brite conversion in human adipocytes promotes metabolic reprogramming towards fatty acid anabolic and catabolic pathways. Molecular Metabolism. 5 (5), 352-365 (2016).
  5. Kim, S. H., Plutzky, J. Brown fat and browning for the treatment of obesity and related metabolic disorders. Diabetes & Metabolism Journal. 40 (1), 12-21 (2016).
  6. Lizcano, F., Vargas, D. Biology of beige adipocyte and possible therapy for type 2 diabetes and obesity. International Journal of Endocrinology. 2016, 9542061(2016).
  7. Mulya, A., Kirwan, J. P. Brown and beige adipose tissue: therapy for obesity and its comorbidities. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 45 (3), 605-621 (2016).
  8. Murphy, C. S., Liaw, L., Reagan, M. R. In vitro tissue-engineered adipose constructs for modeling disease. BMC Biomedical Engineering. 1, 27(2019).
  9. Srivastava, S., Veech, R. L. Brown and brite: The fat soldiers in the anti-obesity fight. Frontiers in Physiology. 10, 38(2019).
  10. Samuelson, I., Vidal-Puig, A. Studying brown adipose tissue in a human in vitro context. Frontiers in Endocrinology. 11, 629(2020).
  11. Wang, C. -H., et al. CRISPR-engineered human brown-like adipocytes prevent diet-induced obesity and ameliorate metabolic syndrome in mice. Science Translational Medicine. 12 (558), (2020).
  12. Kaisanlahti, A., Glumoff, T. Browning of white fat: agents and implications for beige adipose tissue to type 2 diabetes. Journal of Physiology and Biochemistry. 75 (1), 1-10 (2019).
  13. Sato, N., et al. Development of capillary networks from rat microvascular fragments in vitro: the role of myofibroblastic cells. Microvascular Research. 33 (2), 194-210 (1987).
  14. Laschke, M. W., Später, T., Menger, M. D. Microvascular fragments: More than just natural vascularization units. Trends in Biotechnology. 39 (1), 24-33 (2021).
  15. Hoying, J. B., Boswell, C. A., Williams, S. K. Angiogenic potential of microvessel fragments established in three-dimensional collagen gels. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 32 (7), 409-419 (1996).
  16. Acosta, F. M., Stojkova, K., Brey, E. M., Rathbone, C. R. A straightforward approach to engineer vascularized adipose tissue using microvascular fragments. Tissue Engineering. Part A. 26 (15-16), 905-914 (2020).
  17. Acosta, F. M., et al. Adipogenic differentiation alters properties of vascularized tissue-engineered skeletal muscle. Tissue Engineering. Part A. 28 (1-2), 54-68 (2021).
  18. Strobel, H. A., Gerton, T., Hoying, J. B. Vascularized adipocyte organoid model using isolated human microvessel fragments. Biofabrication. 13 (3), 035022(2021).
  19. Acosta, F. M., et al. Engineering functional vascularized beige adipose tissue from microvascular fragments of models of healthy and type II diabetes conditions. Journal of Tissue Engineering. 13, 20417314221109337(2022).
  20. Gonzalez Porras, M. A., Stojkova, K., Acosta, F. M., Rathbone, C. R., Brey, E. M. Engineering human beige adipose tissue. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 906395(2022).
  21. Herold, J., Kalucka, J. Angiogenesis in adipose tissue: The interplay between adipose and endothelial cells. Frontiers in Physiology. 11, 1861(2021).
  22. McCarthy, M., et al. Fat-On-A-Chip models for research and discovery in obesity and its metabolic comorbidities. Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (6), 586-595 (2020).
  23. Klingelhutz, A. J., et al. Scaffold-free generation of uniform adipose spheroids for metabolism research and drug discovery. Scientific Reports. 8 (1), 523(2018).
  24. Yang, J. P., et al. Metabolically active three-dimensional brown adipose tissue engineered from white adipose-derived stem cells. Tissue Engineering. Part A. 23 (7-8), 253-262 (2017).
  25. Vaicik, M. K., et al. Hydrogel-based engineering of beige adipose tissue. Journal of Materials Chemistry B. 3 (40), 7903-7911 (2015).
  26. Tharp, K. M., Stahl, A. Bioengineering beige adipose tissue therapeutics. Frontiers in Endocrinology. 6, 164(2015).
  27. Tharp, K. M., et al. Matrix-assisted transplantation of functional beige adipose tissue. Diabetes. 64 (11), 3713-3724 (2015).
  28. Harms, M. J., et al. Mature human white adipocytes cultured under membranes maintain identity, function, and can transdifferentiate into brown-like adipocytes. Cell Reports. 27 (1), 213-225 (2019).
  29. Frueh, F. S., Später, T., Scheuer, C., Menger, M. D., Laschke, M. W. Isolation of murine adipose tissue-derived microvascular fragments as vascularization units for tissue engineering. Journal of Visualized Experiments. (122), e55721(2017).
  30. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: Function and physiological significance. Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).
  31. Unser, A. M., Tian, Y., Xie, Y. Opportunities and challenges in three-dimensional brown adipogenesis of stem cells. Biotechnology Advances. 33, 962-979 (2015).
  32. Dani, V., Yao, X., Dani, C. Transplantation of fat tissues and iPSC-derived energy expenditure adipocytes to counteract obesity-driven metabolic disorders: Current strategies and future perspectives. Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders. 23 (1), 103-110 (2022).
  33. Xu, X., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments as vascularization units for dental pulp regeneration. Journal of Endodontics. 47 (7), 1092-1100 (2021).
  34. McDaniel, J. S., Pilia, M., Ward, C. L., Pollot, B. E., Rathbone, C. R. Characterization and multilineage potential of cells derived from isolated microvascular fragments. Journal of Surgical Research. 192 (1), 214-222 (2014).
  35. Gealekman, O., et al. Depot-specific differences and insufficient subcutaneous adipose tissue angiogenesis in human obesity. Circulation. 123 (2), 186-194 (2011).
  36. Altalhi, W., Hatkar, R., Hoying, J. B., Aghazadeh, Y., Nunes, S. S. Type I diabetes delays perfusion and engraftment of 3D constructs by impinging on angiogenesis; which can be rescued by hepatocyte growth factor supplementation. Cellular and Molecular Bioengineering. 12 (5), 443-454 (2019).
  37. Altalhi, W., Sun, X., Sivak, J. M., Husain, M., Nunes, S. S. Diabetes impairs arterio-venous specification in engineered vascular tissues in a perivascular cell recruitment-dependent manner. Biomaterials. 119, 23-32 (2017).
  38. Laschke, M. W., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from aged donors exhibit an impaired vascularisation capacity. European Cells & Materials. 28, 287-298 (2014).
  39. Später, T., et al. Vascularization of microvascular fragment isolates from visceral and subcutaneous adipose tissue of mice. Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 19 (1), 161-175 (2021).
  40. Später, T., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from male and female fat donors exhibit a comparable vascularization capacity. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 777687(2021).
  41. Laschke, M. W., Menger, M. D. The simpler, the better: tissue vascularization using the body's own resources. Trends in Biotechnology. 40 (3), 281-290 (2022).
  42. Yang, F., Cohen, R. N., Brey, E. M. Optimization of co-culture conditions for a human vascularized adipose tissue model. Bioengineering. 7 (3), 114(2020).
  43. Pilkington, A. -C., Paz, H. A., Wankhade, U. D. Beige adipose tissue identification and marker specificity-Overview. Frontiers in Endocrinology. 12, 599134(2021).
  44. Chiou, G., et al. Scaffold architecture and matrix strain modulate mesenchymal cell and microvascular growth and development in a time dependent manner. Cellular and Molecular Bioengineering. 13 (5), 507-526 (2020).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

由微血管片段构建血管化产热脂肪组织的三维培养
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。