由微血管片段构建血管化产热脂肪组织的三维培养

摘要

本文介绍了一种详细方案，阐述如何利用从啮齿类动物或人类脂肪组织中分离出的微血管片段，作为一种简便的方法来构建具有功能性的血管化米色脂肪组织。

摘要

产热型脂肪组织（例如米色或棕色脂肪组织）的构建已被研究作为代谢性疾病的一种潜在疗法，或用于设计个性化的微组织以进行健康筛查和药物测试。目前的策略通常较为复杂，且难以准确、全面地再现产热型脂肪组织的多细胞结构和功能特性。微血管片段是从脂肪组织中分离出的微小完整微血管，包含小动脉、小静脉和毛细血管，可作为自体细胞的单一来源，支持血管化及脂肪组织的形成。本文介绍了优化培养条件的方法，以实现从微血管片段生成三维、具有血管化且功能性的产热型脂肪组织，包括从脂肪组织中分离微血管片段的方案以及相应的培养条件。此外，还讨论了最佳操作实践、工程化组织的表征技术，并提供了来自啮齿类动物和人类微血管片段的示例结果。该方法有望用于促进对肥胖症和代谢性疾病的理解及其治疗手段的开发。

引言

本实验方案的目的是描述一种从单一且可能为自体来源的微血管片段（MVF）构建具有血管化的米色脂肪组织的方法。已有研究表明，棕色和米色脂肪组织在代谢调控方面具有有益作用；然而，成人体内这些脂肪组织库的体积较小，限制了其对全身代谢的影响，尤其是在肥胖或2型糖尿病等疾病状态下^{1,2,3,4,5,6,7}。棕色/米色脂肪作为治疗靶点，对于预防与肥胖及其共病相关的有害代谢效应具有重要意义，正受到广泛关注^8,9,10,11,12。

微血管片段（MVFs）是从脂肪组织中直接分离、培养并以三维构型长期维持的血管结构....

方案

本研究遵循《动物福利法》和《动物福利条例实施规定》，并符合《实验动物护理与使用指南》中的原则。所有动物实验程序均经圣安东尼奥德克萨斯大学机构动物护理和使用委员会批准。

注意：以下步骤使用雄性 Lewis 大鼠。对于雌性动物以及小鼠微血管片段（MVF）的采集，需对方案进行轻微调整²⁹。若使用人源微血管片段（h-MVF）的方案，则仅需执行按照试剂盒说明书重悬 h-MVF、制备生长培养基（1.3）、形成纤维蛋白水凝胶（5）以及培养（6）等步骤。有关本方案的总体流程，请参见图 1。

图1：实验流程示意图。 使用微血管片段（MVF）形成产热型脂肪组织在分析前的六个关键步骤分解图。

结果

米色/棕色脂肪组织具有几个关键的表型形态学特征：其为多房性/含有较小的脂滴，含有大量线粒体（因此呈现特征性的“棕褐色”外观） 体内），相应地具有较高的耗氧率/线粒体生物能量活性，高度血管化，脂解作用增强且胰岛素刺激的葡萄糖摄取增加，最显著的特征是高表达解偶联蛋白1（UCP1），这是一种参与产热性呼吸的线粒体蛋白^19,30.

因此，在表征 MVF 分化为米色脂肪组织的能力时，我们进行了一系列分析，以可视化 MVF 的转化过程（图 7、图 8），从基因水平上加以确认（图 9、图 10），并进行功能性测定（图 11）。

讨论

棕色/米色脂肪组织工程领域目前尚处于不成熟阶段^{22,23,24,25,26,27,28}，大多数脂肪组织模型均针对白色脂肪组织开发^8,22,31。工程化的棕色/米色微组织通常需要多种细胞来源或基因改造，以获得天然棕色脂肪组织的部分表型特征^8,11,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氨基己酸	Sigma Aldrich	A2504-100G	在DMEM中以1 mg/mL的浓度添加
钝头剪刀	Fisher scientific	12-000-172	高压灭菌器中灭菌
牛血清白蛋白（BSA）	Millipore	126575-10GM	在 PBS 中稀释至 4 mg/mL 和 1 mg/mL
I型胶原酶	Fisher scientific	NC9633623	用含4 mg/mL BSA的溶液稀释至6 mg/mL，用于消化切碎的脂肪
地塞米松	赛默飞世尔科技	AC230302500	以乙醇稀释至2 mg/ml的储存浓度
一次性护理垫	Fisher scientific	23-666-062	手术期间用于液体吸收
解剖剪	Fisher scientific	08-951-5	高压灭菌器中灭菌
杜尔贝科′s 改良伊格尔′s 培养基（DMEM）	Fisher scientific	11885092
杜尔贝科′s 改良伊格尔′DMEM/F12 培养基（Ham's F-12 营养混合物）	Sigma Aldrich	D8062
胎牛血清	Fisher scientific	16140089	在DMEM中添加至20%（v/v）。
纤维蛋白原	Sigma Aldrich	F8630-25G	在 DMEM 中以 20 mg/mL 浓度溶解，存在于血浆中的蛋白质，水凝胶的主要成分
250 mL 锥形瓶	Fisher scientific	FB500250	利用较大的表面积实现脂肪的消化
镊子	Fisher scientific	50-264-21	高压灭菌，用于组织和滤膜的处理
Forskolin	Sigma Aldrich	F6886	以乙醇稀释至10 mM的储存浓度
人源MVF	Advanced Solutions Life Sciences, LLC	https://www.advancedsolutions.com/microvessels	本研究使用了从三位不同患者（52岁、54岁和56岁女性）分离的人源微血管片段（hMVFs）。
吲哚美辛	Sigma Aldrich	I7378	以乙醇稀释至12.5 mM的储备浓度
猪胰岛素	Sigma Aldrich	I5523	用 0.01 N HCl 稀释至 5 mg/ml 的储备浓度
MycoZap	Fisher scientific	NC9023832	添加至DMEM中至0.2% w/v，支原体预防剂
青霉素/链霉素（10,000 U/mL）	Fisher scientific	15140122	在DMEM中添加至1% v/v。
培养皿，聚苯乙烯（100 mm × 15 mm）	Fisher scientific	351029	3 用于去除血管和剪碎组织，8（盖）用于筛网预浸泡 & 8（培养皿），用于500或37过滤时 µM 筛选
培养皿，聚苯乙烯（35 mm × 10 mm）	Fisher scientific	50-202-036	用于计数微血管片段
磷酸盐缓冲液（PBS）	Fisher scientific	14-190-250	用无菌去离子水稀释至1倍浓度。
大鼠剪毛器（Andwin Mini Arco 宠物修剪器）	Fisher scientific	NC0854141
罗格列酮	Fisher scientific	R0106200MG	用DMSO稀释至10 mM的储备浓度
剪刀	Fine Science Tools	14059-11	1 把用于初始切口，1 把用于附睾切口，1 把用于尖端剪切
屏幕  37 µM	卡罗来纳生物供应公司	652222R	切成3段" 圆形方块，经环氧乙烷灭菌，用于微血管片段的截留及去除极小片段、单细胞和碎片
筛选 500 µM	卡罗来纳生物供应公司	652222F	切成3段" 圆形方块，经环氧乙烷灭菌，去除较大碎片/碎屑
锯齿止血钳	Fisher scientific	12-000-171	在高压灭菌器中灭菌，用于切口前夹紧皮肤
Steriflip 滤器 0.22 μm	Millipore	SE1M179M6
凝血酶	Fisher scientific	6051601KU	用去离子水稀释至 10 U/mL，用作凝血剂，使纤维蛋白原转化为纤维蛋白
甲状腺激素（T3）	Sigma Aldrich	T2877	用1N NaOH稀释至0.02 mM的储备浓度
Zucker 糖尿病肥胖（ZDF）大鼠——肥胖型（FA/FA）或瘦型（FA/+）雄性	查尔斯河	https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611 https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611	购自查尔斯河实验室（Wilmington, MA）。大鼠在4周龄时获取，并饲喂Purina 5008饲料至安乐死（15–19周龄）。本研究中使用的所有FA/FA大鼠的葡萄糖水平（取自外侧隐静脉的血液）均高于300 mg/dL。所有动物均饲养于温度受控的环境中，采用12小时光照-黑暗循环，自由进食。