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方法文章

检测接种日本脑炎疫苗儿童中的多功能T细胞 通过 流式细胞术

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DOI：

10.3791/64671

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2022年9月23日

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1Beijing Key Laboratory of Pediatric Respiratory Infectious Diseases, Key Laboratory of Major Diseases in Children, Ministry of Education, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Laboratory of Infection and Virology, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children’s Hospital, Capital Medical University, National Center for Children’s Health, 2Research Unit of Critical Infection in Children, 2019RU016, Chinese Academy of Medical Sciences, 3Department of Pediatric Rehabilitation, Beijing Boai Hospital, School of Rehabilitation Medicine, Capital Medical University, China Rehabilitation Research Center, 4Center of Excellence (Beijing), Becton Dickinson Medical Devices (Shanghai) Co Ltd

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本实验方案结合 离体 刺激与流式细胞术分析多功能T细胞（TPF) 日本乙型脑炎病毒（JEV）疫苗接种儿童外周血单个核细胞（PBMCs）中JEV特异性T细胞谱的检测方法及流式细胞术配色方案，旨在为类似研究提供参考。

摘要

T细胞介导的免疫在控制黄病毒属病毒感染中发挥重要作用，无论是在接种疫苗后还是自然感染后均如此。评估T细胞的“质量”需以其功能为依据，功能越强，免疫保护作用也越强。在单细胞水平上能够同时产生两种或多种细胞因子或趋化因子的T细胞被称为多功能T细胞（TPFs），这类细胞通过多种分子机制介导免疫反应，表达脱颗粒标志物（CD107a），并分泌干扰素（IFN）-γ、肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-2或巨噬细胞炎症蛋白（MIP）-1α。越来越多的证据表明，TPFs与长期免疫记忆的维持及免疫保护密切相关，其比例升高是保护性免疫的重要标志，在有效控制病毒感染及再激活过程中具有重要意义。该评估不仅适用于特异性免疫反应，也适用于交叉反应性免疫反应的评估。本文以日本脑炎病毒（JEV）为例，检测了接种日本脑炎疫苗的儿童外周血单个核细胞产生的JEV特异性TPFs的检测方法及流式细胞术染色方案，为类似研究提供参考。

引言

日本脑炎病毒（JEV）是一种重要的蚊媒病毒，属于黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属（Flavivirus） 1。由于日本脑炎（JE）造成的巨大疾病负担，许多亚太国家长期以来面临严峻的公共卫生挑战，但随着多种疫苗的日益普及，这一状况已显著改善2。自然感染或疫苗接种所诱导的适应性保护性免疫反应在预防疾病和抗病毒调控中发挥重要作用。体液免疫和细胞介导的免疫均属于适应性免疫，其中前者诱导一直被视为疫苗设计的关键策略，尽管过去对其理解相对有限3。然而，T细胞介导的免疫在限制黄病毒感染扩散及清除病毒方面的作用正受到越来越多的关注，并被广泛研究4。此外，T细胞免疫不仅在JEV特异性抗病毒反应中不可或缺，还在对异源黄病毒二次感染的交叉保护中发挥重要作用，这一点已在先前的研究中得到证实5。据推测，这种效应可能绕过感染中潜在的抗体依赖性增强作用5。值得注意的是，此类交叉反应性T细胞免疫尤为重要，特别是在缺乏针对黄病毒的疫苗和抗病毒药物的情况下。尽管已有大量研究探讨CD4+和CD8+ T细胞在JEV感染中的作用6,7，但分泌细胞因子的不同T细胞谱系及其功能分化仍不明确，这意味着辅助性T细胞和杀伤性T细胞的确切功能尚未被阐明。

其抗病毒防御的规模决定了T细胞应答的质量。CD4+ 或 CD8+ 能够相容地发挥两种或以上功能（包括细胞因子分泌和脱颗粒）的T细胞被称为多功能T细胞 （TPFs) 在单细胞水平上受到特定刺激后8CD4+ 产生单一或多种细胞因子的T细胞可能具有不同的效应功能和免疫记忆。例如，IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T细胞比IL-2更有可能形成长期有效的保护性反应+ CD4+ T细胞9，可作为评估疫苗接种效果的重要参数。IL-2的频率+ IFN-γ+ CD4+ 艾滋病（AIDS）长期非进展患者的T细胞水平升高，而CD4+ 艾滋病进展期患者的T细胞更倾向于单独产生IFN-γ，这是由于IL-2对T细胞增殖具有促进作用10此外，一部分IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ 被证明可长期存活 体内 并协同促进杀伤功能11尽管CD8+ T细胞更有可能表现出细胞毒性活性，某些CD4+ T细胞也具有细胞毒性活性，这可通过表面CD107a分子的间接检测来反映12此外，某些T细胞亚群表达趋化因子MIP-1α，后者通常由单核细胞分泌，参与T细胞介导的中性粒细胞募集13同样，CD8+ TPF也可用于表征上述标志物的多功能性。研究表明，初免-加强免疫策略可有效诱导T细胞长期持续的反应PF 保护作用13，这可以增强疫苗接种所诱导的保护效果。研究免疫系统的一个核心特征是记忆T细胞相较于初始T细胞能够对再次病毒攻击产生更强、更快且更有效的免疫应答。效应记忆T细胞（T电子显微镜) 和中央记忆T细胞（TCM是重要的T细胞亚群，通常通过CD27/CD45RO或CCR7/CD45RA的共表达模式进行区分14. TCM (CD27+ CD45RO+ 或 CCR7+ CD45RA-）倾向于定位于次级淋巴组织，而T电子显微镜 (CD27- CD45RO+ 或 CCR7- CD45RA-在淋巴组织和外周组织中定位15,16. T电子显微镜 提供即时但非持续的防御，而TCM 在次级淋巴器官中增殖并产生新的效应细胞以维持免疫应答17因此，鉴于记忆细胞能够介导针对病毒的特异而高效的再次应答，关于这一多能性细胞亚群所起作用的问题便随之产生。

随着流式细胞术技术的发展，同时检测超过10种细胞簇、表型及分化抗原标志物已成为常态，这有助于更充分地注释单个T细胞的功能性免疫特征，从而减少对T细胞表型的误读和理解困难。本研究采用离体（ex vivo）刺激结合流式细胞术，分析日本脑炎病毒（JEV）疫苗接种儿童外周血单个核细胞（PBMCs）中的TPF 特征谱。通过该方法，将有助于深入理解疫苗诱导的JEV特异性以及跨反应性T细胞免疫在短期和长期的应答特征。

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方案

本研究获得了首都医科大学附属北京儿童医院伦理委员会的伦理批准（批准号：2020-k-85）。志愿者招募自首都医科大学附属北京儿童医院。外周静脉血样本采集自临床表现健康的儿童：一组为接种过减毒活乙型脑炎SA14-14-2疫苗且加强免疫不足半年的儿童（乙脑疫苗接种组，2岁，n = 5）；另一组为未接种疫苗的儿童（6个月大，n = 5）。由于本研究仅使用临床检测后剩余的样本，因此豁免了受试者的知情同意。为保护志愿者隐私，所有数据均进行了完全匿名化和去标识化处理。

1. 从外周静脉血中分离外周血单个核细胞

  1. 采用标准静脉穿刺技术，从接种过乙型脑炎疫苗和未接种疫苗的儿童中采集外周静脉血样本（2 mL），置于含EDTA-K2抗凝剂的采血管中（参见材料表）18。
  2. 加入2 mL磷酸盐缓冲液（1× PBS）稀释外周血。
    注意：应尽快操作，以最大限度保持细胞存活率。
  3. 向15 mL离心管中加入4 mL密度梯度介质（参见材料表），然后缓慢将稀释后的血液加至分离介质的上层。
    注意：切勿使血液与分离介质混合，或破坏两种液体之间形成的界面，否则将影响分离效果。
  4. 在室温下以800 × g 离心20分钟，离心后观察明显的分层现象。
  5. 将外周血单个核细胞（PBMCs，中间层）转移至另一支15 mL离心管中，用含10%胎牛血清（FBS，参见材料表）的10 mL RPMI-1640培养基洗涤PBMCs。
  6. 在室温下以800 × g 离心10分钟，小心用移液器弃去上清液。
  7. 用含10% FBS的1 mL RPMI-1640培养基重悬PBMCs，并使用基于台盼蓝染色的自动细胞计数仪进行细胞计数（参见材料表）。

2. 利用灭活的日本脑炎病毒颗粒刺激外周血单个核细胞以诱导细胞因子表达

  1. 分别在接种过和未接种日本脑炎疫苗的样本中，设置JEV刺激组和对照组的两个亚组。
  2. 用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基将PBMCs细胞数量调整至2 × 106 个细胞/mL，并接种于24孔板中（每孔1 mL培养基含2 × 106 个细胞）；每组接种三个孔。
  3. 在37 °C条件下，使用浓缩的灭活JEV颗粒5（2 × 105 PFU）刺激JEV刺激组的PBMCs细胞16小时，同时加入单克隆抗体CD28（1 µg/mL，1:1,000）和CD49d（1 µg/mL，1:1,000）、GolgiPlug（1 µg/mL，1:1,000）以及莫能菌素（monensin，1 µg/mL，1:1,000）。用于表面染色时，使用BV605-anti-CD107a（1 µg/mL，1:1,000）（见材料表）。
    注意：JEV通过紫外线照射灭活，方法如前所述19。
  4. 对照组的PBMCs细胞在不含浓缩病毒颗粒的条件下，于37 °C孵育16小时，同时加入单克隆抗体CD28（1 µg/mL，1:1,000）和CD49d（1 µg/mL，1:1,000）、GolgiPlug（1 µg/mL，1:1,000）以及莫能菌素（monensin，1 µg/mL，1:1,000）。使用BV605-anti-CD107a（1 µg/mL，1:1,000）进行表面染色。

3. 离体 细胞内染色

  1. 将每组的细胞悬液收集至1.5 mL微量离心管中，在室温下以500 × g 离心5分钟，并用移液器吸除上清液。
  2. 用1 mL 1× PBS重悬细胞，向细胞悬液中加入可固定活力染料（1 µL/mL，1:1,000，参见材料表），在室温避光条件下孵育10分钟。在室温下以500 × g 离心5分钟，吸除上清液。
  3. 用1 mL 1× PBS重悬细胞，在室温下以500 × g 离心5分钟，小心弃去上清液。
  4. 进行细胞表面标志物染色。
    1. 将细胞重悬于100 µL 1× PBS中，向每管细胞悬液中加入各表面标志物抗体2 µL（BV650-抗CD3、BUV395-抗CD4、BV421-抗CD8、BUV737-抗CD27和BV480-抗CD45RO，稀释倍数：1:50，参见材料表）。
      注：荧光抗体染色方案见表1。
    2. 将试管（步骤3.4.1）在室温避光条件下孵育30分钟，以500 × g 离心5分钟，吸除上清液。
      注：BUV737-抗CD27和BV480-抗CD45RO抗体可用BUV737-抗CCR7和BV480-抗CD45RA替代，用于记忆T细胞的标记。
  5. 用1 mL 1× PBS重悬细胞，在室温下以500 × g 离心5分钟，小心弃去上清液。
  6. 进行固定和破膜处理。
    1. 用500 µL破膜固定液（参见材料表）重悬细胞，在室温避光条件下固定20分钟。以500 × g 离心5分钟，吸除上清液。
  7. 用1 mL 1× PBS重悬细胞，在室温下以500 × g 离心5分钟，小心吸除上清液。
  8. 进行细胞内细胞因子染色。
    1. 将细胞重悬于100 µL 1× PBS中，向每管细胞悬液中加入各细胞因子抗体2 µL（FITC-抗IFN-γ、PE-抗TNF-α、BV785-抗IL-2和APC-抗MIP-1α，稀释倍数：1:50，参见材料表）。
      注：荧光素偶联抗体的体积和相关信息见表1。
    2. 将试管（步骤3.8.1）在室温避光条件下孵育30分钟，以500 × g 离心5分钟，吸除上清液。
  9. 用1 mL 1× PBS重悬细胞，在室温下以500 × g 离心5分钟，小心吸除上清液，加入500 µL 1× PBS重悬细胞。

4. 流式细胞术设置

  1. 按照步骤1所述方法单独分离PBMC样本作为对照样本。将细胞悬液均分为12份，每份100 µL，分装至1.5 mL微量离心管中，如下所述。
    1. 分别设置未染色样本、APC-Cy7-活死染料可固定染色样本、BV650-抗CD3单染样本、BUV395-抗CD4单染样本、BV421-抗CD8单染样本、BUV737-抗CD27单染样本、BV480-抗CD45RO染色样本、BV605-抗CD107a染色样本、FITC-抗IFN-γ染色样本、PE-抗TNF-α单染样本、BV785-抗IL-2单染样本以及APC-抗MIP-1α单染样本。
  2. 按照步骤3所述方法进行细胞表面标志物和细胞内细胞因子染色。对于每个单染样本，仅加入染色步骤中的一种荧光染料。加入500 µL 1x PBS重悬细胞，并以低速涡旋振荡混匀。
  3. 使用未染色样本调节前向散射光（FSC）、侧向散射光（SSC）以及不同荧光染料的电压。
    注：本研究中设置的电压如下：FSC：440 V，SSC：233 V，BV650：575 V，APC-Cy7：449 V，BUV395：500 V，BV421：402 V，BUV737：585 V，BV480：444 V，BV605：457 V，FITC：475 V，PE：469 V，APC：623 V，BV785：725 V。
  4. 使用各单染样本调节流式细胞术补偿，以消除不同荧光染料之间的信号串扰。
    ​注：补偿参数见表2。

5. 门控策略与数据分析

注意：在本研究中，用于此分析的中央记忆T细胞（CD8+或CD4+ T细胞中的TCM）定义为CD27+CD45RO+或CCR7+CD45RA-，效应记忆T细胞（CD8+或CD4+ T细胞中的TEM）定义为CD27-CD45RO+或CCR7-CD45RA-16。

  1. 在FSC-面积（FSC-A）/SSC-面积（SSC-A）散点图上绘制多边形门，以选择完整的淋巴细胞群体，同时排除碎片（图1A）。
  2. 在FSC-A/FSC-宽度（FSC-W）散点图上绘制矩形门，以选择单个细胞（图1B）。
  3. 在活/死细胞/SSC-A散点图上绘制矩形门，以选择活细胞（图1C）。
  4. 在CD3/SSC-A散点图上绘制矩形门，以鉴定CD3+ T细胞（图1D）。
  5. 在CD4/CD8散点图上绘制四象限门，以鉴定CD4+或CD8+ T细胞（图1E）。
  6. 在CD45RO/CD27散点图上绘制四象限门，将CD4+或CD8+ T细胞进一步划分为TCM（CD27+ CD45RO+）和TEM（CD27- CD45RO+）（图1F-I）。
  7. 从CD8+或CD4+ T细胞的TCM或TEM群体中，分别绘制CD107a、IFN-γ、TNF-α、IL-2和MIP-1α的门，以确定不同反应模式的频率。
  8. 依次将样本上机进行流式细胞术检测。使用停止门20采集1 × 106个淋巴细胞。
    注意：用户可根据需要采集超过1 × 106个细胞。该数量是在采集时间与获得足够细胞以确保结果具有统计学意义之间的一种权衡。

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结果

图1展示了用于分析乙型脑炎疫苗接种儿童中代表性JEV刺激组的CD8+或CD4+ T细胞中TCM或TEM亚群的设门策略。使用FSC-A/SSC-A散点图鉴定淋巴细胞，FSC-A/FSC-W散点图用于鉴定单细胞。在活/死细胞/SSC-A散点图上选择活细胞。使用CD3/SSC-A散点图鉴定CD3+ T细胞。通过CD4/CD8散点图分别鉴定CD3+ CD4+和CD3+ CD8+ T细胞。在CD45RO/CD27散点图上分别圈选CD8+或CD4+ T细胞中的TCM（CD27+ CD45RO+）和TEM（CD27- CD45RO+）亚群。通过绘制相应的矩形门，分别圈选来自CD8+ TCM

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讨论

本方案介绍了一种基于流式细胞术的可行方法，用于检测接种SA14-14-2型日本脑炎疫苗儿童外周血单个核细胞（PBMC）中的TPF谱型。本研究以接种与未接种疫苗儿童的静脉血PBMC为研究材料，在日本脑炎病毒抗原刺激下，通过多色流式细胞术抗体染色对扩增的抗原特异性TPF细胞进行表征。与传统的酶联免疫斑点法相比，流式细胞术的显著优势在于能够在单细胞水平尽可能全面地呈现PBMC的功能特征，同时减少检测所需的PBMC数量，特别适用于儿童样本。

明确的疫苗接种史、维持细胞活力、刺激物的T细胞免疫原性以及兼容的颜色匹配策略是本方案中的关键步骤。中国自2008年起已将乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗纳入国家扩大免疫规划，并将疫苗接种史纳入统一管理，从而实现了疫苗接种信息的可及性3。本方案中检测的外周血单个核细胞（PBMCs）在实验过程中始终保持在冰上，以最大限度维持细胞活力。使用特异性刺激物的有效性此前已有广泛报道4,

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

R.W. 受到国家自然科学基金（82002130）和北京市自然科学基金的资助 中国（7222059）。ZD.X. 获得了中国医学科学院医学与健康科技创新工程（2019-I2M-5-026）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗人 CD28Biolegend302934抗体
抗人 CD49dBiolegend304339抗体
APC 抗人 MIP-1αBD551533荧光抗体 
自动细胞计数仪BIO RADTC20细胞计数
BD FACSymphony A5BDA5流式细胞术
BUV395 抗人 CD4BD563550荧光抗体 
BUV737 抗人 CCR7BD741786荧光抗体 
BUV737 抗人 CD27BD612829荧光抗体 
BV421 抗人 CD8Biolegend344748荧光抗体 
BV480 抗人 CD45RABD566114荧光抗体 
BV480 抗人 CD45ROBD566143荧光抗体 
BV605 抗人 CD107aBiolegend328634荧光抗体 
BV650 抗人 CD3BD563999荧光抗体 
BV785 抗人 IL-2Biolegend500348荧光抗体 
离心管BD FalconBD-3520971515 mL 离心管
Cytofix/Cytoperm 固定/透化溶液试剂盒BD554714细胞固定与透化
密度梯度介质DakeweDKW-KLSH-0100Ficoll-Paque，人淋巴细胞分离介质
FITC 抗人 IFN-γBiolegend502506荧光抗体 
Gibco 胎牛血清Thermo Fisher Scientific16000-044胎牛血清
Gibco RPMI-1640 培养基Thermo Fisher Scientific22400089细胞培养基
高速 离心机Sigma 3K15用于 15 mL 离心管的细胞离心
高速 离心机Eppendorf5424R用于 1.5 mL Eppendorf (EP) 管的细胞离心
微量离心管AxygenMCT-150-C1.5 mL 微量离心管
PE 抗人 TNF-αBiolegend502909荧光抗体 
磷酸盐缓冲液 (PBS)BI02-024-1ACSPBS
蛋白转运抑制剂（含布雷菲德菌素 A，GolgiPlug）BD555029阻断细胞内蛋白转运过程
蛋白转运抑制剂（含莫能菌素）BD554724阻断细胞内蛋白转运过程
圆底试管BD Falcon3522355 mL 试管
台盼蓝染色细胞活力检测试剂盒BeyotimeC0011台盼蓝染色
Zombie NIR 可固定活力染料Biolegend423106死细胞染色

参考文献

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