建立三维类器官模型研究口腔-食管鳞状细胞癌

摘要

本方案描述了通过化学致癌方法诱导生成并表征小鼠口腔-食管三维类器官的关键步骤，这些类器官代表了正常、癌前病变及鳞状细胞癌病灶。

摘要

食管鳞状细胞癌（ESCC）在全球范围内高发，每年占所有食管癌病例的90%，是所有人类鳞状细胞癌中致死率最高的类型。尽管近年来在阐明伴随ESCC发生和发展的分子改变方面已取得一定进展，但患者的预后仍然较差。对这些分子改变进行功能注释是必要的下一步工作，而这需要能够准确模拟ESCC分子特征且易于进行低成本功能研究的模型。使用烟草烟雾模拟物4-硝基喹啉-1-氧化物（4NQO）处理的小鼠可稳定地形成ESCC及食管癌前病变。值得注意的是，4NQO诱导的病变也常出现在口腔（最常见于舌部）以及前胃，这些部位均具有复层鳞状上皮。然而，由于构建同基因型小鼠模型耗时且资源消耗大，这些小鼠难以被简便地用于功能假设的验证。本文中，我们通过建立源自4NQO处理小鼠的单细胞来源三维（3D）类器官模型，以在体外对小鼠ESCC或癌前病变细胞进行表征，从而克服了这一局限性。ex vivo培养的这些类器官能够再现ESCC和食管癌前病变的关键特征，可低成本、快速地用于构建同基因型模型，并可用于同系移植实验。我们展示了如何从正常、癌前病变及鳞状细胞癌（SCC）的小鼠食管组织中建立3D类器官，并对其进行维持和冷冻保存。这些多功能类器官的应用范围广泛，包括结合基因工程小鼠模型进行研究，通过流式细胞术或免疫组织化学进一步表征，利用CRISPR技术构建同基因型类器官细胞系，以及开展药物筛选或同系移植实验。我们相信，本实验方案中所展示技术的广泛应用将加速该领域的研究进展，以应对ESCC所带来的严重疾病负担。

引言

食管鳞状细胞癌（ESCC）是人类鳞状细胞癌中致死率最高的一种，这主要归因于其诊断时间较晚、对治疗具有耐药性以及易发生转移^1,2。ESCC起源于食管腔面被覆的复层鳞状上皮。该鳞状上皮由基底层中的增殖性基底细胞和上基底层中的分化细胞组成。在生理条件下，基底细胞表达p63、Sox2以及细胞角蛋白K5和K14等标志物，而分化细胞则表达K4、K13和IVL。基底细胞本身具有异质性，其中包括以K15³和CD73⁴等标志物定义的潜在干细胞。在稳态状态下，基底细胞在上基底层中经历有丝分裂后的终末分化，而分化后的细胞则向上迁移并脱落至管腔，完成上皮更新。与起源细胞相似，ESCC表现出程度不一的鳞状细胞分化特征。ESCC常伴有多个病灶的组织学前驱病变，称为上皮内瘤变（IEN）或异型增生，其特征为存在不典型的基底样细胞。除了上皮的改变外，ESCC还表现出黏膜下区的组织重塑，在此过程中癌相关成纤维细胞（CAFs）被激活，并募集免疫/炎症细胞，从而促进肿瘤微环境的形成。

食管鳞状细胞癌（ESCC）的发病机制涉及遗传改变以及环境危险因素的暴露。关键的遗传损伤包括肿瘤抑制基因TP53和CDKN2A（p16INK4A）的失活，以及CCND1（细....

方案

小鼠实验根据相关规定进行规划和操作，并经哥伦比亚大学机构动物护理和使用委员会审查批准，动物实验方案编号为#AABB1502。小鼠饲养在符合标准的动物护理设施中，该设施确保对小鼠的人道对待，为小鼠提供适当的兽医护理，并为实验室人员提供实验室安全培训。

1. 使用4NQO处理小鼠以诱导食管IEN和ESCC病变（时间考虑：最长28周）

注意：为了生成代表食管肿瘤性病变的MEO，小鼠将接受4NQO介导的化学致癌处理，具体方法如Tang等¹⁴先前所述。正常/非肿瘤性MEO则来源于未经处理的小鼠。

1. 小鼠
   1. 每笼饲养 4 至 5 只小鼠，在开始实验前至少适应动物房环境 1 周。为降低年龄相关疾病导致 28 周完整实验提前终止的可能性，应选用 8 周龄至 16 周龄的小鼠开始实验。
      注意：本实验方案使用体重约为20–30 g的C57BL/6小鼠。对于较短时间的实验，可使用较年长的小鼠。雄性或雌性小鼠均可使用。对照组（无处理，见第1.3.1节）小鼠需在年龄和性别上相匹配。
2. 含4NQO饮用水的制备
   1. 配制1 mg/mL 4NQO储备液于乙二醇丙二醇中（材料列表）。在500 mL玻璃烧杯中，加入10....

结果

本方案描述了根据特定处理方案，从经4NQO处理的小鼠的正常食管组织或食管鳞状细胞癌（ESCC）肿瘤组织中生成小鼠食管类器官（MEO）的过程。该处理方案包括：通过饮用水给予4NQO持续16周，随后进行10至12周的观察期。图 1随后对小鼠实施安乐死，以获取舌或食管组织进行解剖。图 2 以及 图 3我们介绍一种从完整食管中分离上皮层的方法。图 4) 用于后续的单细胞分离。食管来源的上皮细胞初始接种密度为每孔5,000个细胞，置于50 µ含有细胞与基底膜基质及成分明确的无血清细胞培养基的 L 液滴图 5) 并使其在平均7-10天内形成类器官。可通过相差/明场成像和组织病理学进行形态学分析，进一步表征小鼠食管、舌及前胃类器官。图 6）。类器官的自我更新能力可通过测定传代时的类器官形.......

讨论

     在本文所述的实验方案中，MEO 的生成与分析包含若干关键步骤和注意事项。为确保 MEO 实验的可重复性与严谨性，生物学重复和技术重复均至关重要。对于生物学重复，每个实验条件通常需要使用两到三只独立的 ESCC 小鼠模型即可满足要求。然而，合适的生物学重复数量可能因具体研究中待检测的参数而异。例如，目前尚不清楚在经 4NQO 处理但无肉眼可见病灶或组织学上无 IEN 和 ESCC 病变的小鼠中，肿瘤性类器官最早可在何时以及以多高频率被检测到。尽管 4NQO 可在多种小鼠品系中诱导食管病变¹⁴，但目前 MEO 仅从 C57BL/6 小鼠中成功建立。在携带基因工程化遗传改变（如 Trp53 缺失和 cyclin D1 过表达）的小鼠中，ESCC 的发生与发展进程会加快^7,14,15。在这些小鼠中，肿瘤性 MEO 可能在 4NQO 处理期间或之后比野生型 C57BL/6 小.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25-300-120
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25-200-114
0.4% 台盼蓝	Thermo Fisher Scientific	T10282
1 mL 无针结核菌素注射器	BD	309659
1.5 mL 微量离心管	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
100 µm 细胞筛	Thermo Fisher Scientific	22363549
15 mL 锥形管	Thermo Fisher Scientific	14-959-53A
200 µL 宽口微量移液器吸头	Thermo Fisher Scientific	212361A
21 G 针头	BD	305167
24 孔板	Thermo Fisher Scientific	12-556-006
4-硝基喹啉-1-氧化物（4NQO）	东京化成工业	NO250
50 mL 锥形管	Thermo Fisher Scientific	12-565-270
6 孔板	Thermo Fisher Scientific	12556004
70 µm 细胞筛	Thermo Fisher Scientific	22363548
99.9% 乙二醇丙二醇	SK picglobal
高级 DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	12634028
两性霉素 B	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15290018	储存浓度 250 µg/mL，终浓度 0.5 µg/mL
抗生素-抗真菌剂	Thermo Fisher Scientific	15240062	储存浓度 100x，终浓度 1x
B-27 添加剂	Thermo Fisher Scientific	17504044	储存浓度 50x，终浓度 1x
细菌琼脂	BD	214010
CO2 培养箱，例如 Heracell 150i	Thermo Fisher Scientific	51026406	或同类产品
Countess II FL 全自动细胞计数仪	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000	或同类产品
冻存管	Thermo Fisher Scientific	03-337-7D
DietGel 76A	Clear H2O	72-07-5022
二甲基亚砜（DMSO）	MilliporeSigma	D4540
中性蛋白酶	Corning	354235	储存浓度 50 U/mL，终浓度 2.5–5 U/mL
解剖剪刀	VWR	25870-002
杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）	Thermo Fisher Scientific	14190250	储存浓度 1x
胎牛血清（FBS）	HyClone	SH30071.03
镊子	VWR	82027-386
冻存容器	Corning	432002	或同类产品
明胶	Thermo Fisher Scientific	G7-500
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061	储存浓度 100x，终浓度 1x
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630080	储存浓度 1 M，终浓度 10 mM
加热板/搅拌器	Corning	PC-420D	或同类产品
Lab Armor 珠浴（或水浴）	VWR	89409-222	或同类产品
实验室天平	Ohaus	71142841	或同类产品
Matrigel 基底膜提取物（BME）	Corning	354234
微量离心机 Minispin	Eppendorf	22620100	或同类产品
微量离心管架	Southern Labware	0061
N-2 添加剂	Thermo Fisher Scientific	17502048	储存浓度 100x，终浓度 1x
N-乙酰半胱氨酸（NAC）	Sigma-Aldrich	A9165	储存浓度 0.5 M，终浓度 1 mM
Parafilm M 封口膜	Thermo Fisher Scientific	S37440
多聚甲醛（PFA）	MilliporeSigma	158127-500G
病理学包埋盒	Thermo Fisher Scientific	22-272416
相差显微镜	Nikon		或同类产品
重组小鼠表皮生长因子（mEGF）	Peprotech	315-09-1mg	储存浓度 500 ng/µL，终浓度 100 ng/mL
表达 R-Spondin1 和 Noggin 的 RN 细胞条件培养基（RN CM）	N/A	N/A	可通过类器官与细胞培养核心申请获得，终浓度 2%
Sorval ST 16R 离心机	Thermo Fisher Scientific	75004380	或同类产品
大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）	MilliporeSigma	T9128	储存浓度 250 µg/mL
ThermoMixer C	Thermo Fisher Scientific	14-285-562 PM	或同类产品
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	储存浓度 10 mM，终浓度 10 µM