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方法文章

长期培养个体细胞 秀丽隐杆线虫 在固体培养基上进行纵向荧光监测和厌恶干预

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DOI：

10.3791/64682

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2022年12月2日

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1Department of Molecular & Cellular Biology, University of Arizona, Tucson

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种在固体培养基上培养单个分离线虫并对其进行终生生理参数监测和荧光定量的实验方案。该培养系统在单虫培养孔周围设置棕榈酸屏障，以防止线虫逃逸，从而允许使用具有厌恶性干预条件，包括致病菌和化学应激物。

摘要

Caenorhabditis elegans 被广泛用于研究衰老生物学。在 C. elegans 衰老研究中的常规做法是将线虫群体培养在固体线虫生长培养基（NGM）上，从而高效地收集群体水平的生存数据及其他生理表型数据，并定期取样亚群以定量荧光生物标志物。该方法的局限性在于无法（1）对个体线虫进行长期追踪，以建立感兴趣表型的年龄轨迹；以及（2）在培养环境中直接监测荧光生物标志物。其他替代性培养方法采用液体培养或微流控技术对个体动物进行时间序列监测，部分情况下包括荧光定量，但其代价是培养环境与固体NGM在情境上存在显著差异。WorMotel 是一种先前报道的微加工多孔装置，可用于在固体NGM上培养分离的线虫。每条线虫被维持在一个含有固体NGM的孔中，孔周围由充满硫酸铜的护城河包围，硫酸铜是一种对 C. elegans 具有接触驱避作用的物质，从而实现对个体动物的纵向监测。我们发现，当施加衰老研究中常见的厌恶干预（包括饮食限制、致病菌和诱导细胞应激的化学试剂）时，硫酸铜不足以阻止线虫逃逸。此外，这些多孔装置由聚二甲基硅氧烷（PDMS）模制而成，会在荧光成像中产生较高的背景伪影。本实验方案描述了一种新方法，利用市售的聚苯乙烯微孔板（最初设计用于人类白细胞抗原（HLA）分型）在固体NGM上培养分离的线虫，可在整个生命周期内测量生存率、生理表型和荧光信号。棕榈酸屏障可防止线虫逃逸，即使在存在厌恶条件的情况下亦然。每块微孔板最多可培养96条动物，且可轻松适应多种实验条件，包括饮食限制、RNA干扰（RNAi）和化学添加剂，并兼容自动化系统以采集寿命和活动数据。

引言

C. elegans 是遗传学、细胞生物学和分子生物学研究中一种强大的模式生物，因为它们易于在实验室中培养，具有较短的世代时间和寿命，与哺乳动物在蛋白质序列上具有高度同源性，并且其透明的身体结构使得能够在活体（in vivo）中直接观察荧光蛋白和染料的分布1。由于 C. elegans 长期被广泛用作发育生物学、衰老等多个研究领域的重要模型系统，其生长与发育过程已被深入理解，基因组已实现全序列测定，同时已开发出一系列强大的遗传学工具，包括全基因组范围的RNAi饲喂文库，以及数千种突变体和转基因品系。传统上，C. elegans 在固体琼脂线虫生长培养基（NGM）上以群体形式培养，表型通过直接观察或成像结合后续分析进行人工评估。荧光显微镜可用于检测个体 C. elegans 中由染料或转基因表达的荧光标签所呈现的多种分子表型。荧光成像通常需要将线虫固定或麻痹在载玻片上的薄层琼脂糖垫中，该过程具有侵入性，且常导致动物死亡。此外，该方法还需使用化学试剂（如左旋咪唑或叠氮化钠），这些试剂可能干扰所研究的分子过程2,3。上述方法能够获取涵盖多种表型的横断面群体水平数据，但无法实现对单个动物随时间的连续追踪。

近年来，多种方法被开发用于培养分离的 C. elegans，使研究人员能够利用新型成像技术捕捉动物在时间进程中的生理和分子表型的动态变化。其中一类 C. elegans 培养方法是微流控装置，包括 WormFarm4、Nemalife 芯片5 以及 Chronis 等人开发的“行为”芯片6，以及其他多种类似系统7,8,9。与之相关的是基于液体的培养方法，该方法使用多孔板对单个线虫或小群体随时间进行表征10,11。微流控和微孔板系统可对 C. elegans 的表型响应进行精确的定量测量，甚至达到单个个体水平，但其培养环境存在一个关键限制。迄今为止，绝大多数关于 C. elegans 的研究，尤其是在衰老领域，都是在基于固体琼脂的培养基上完成的。液体培养会导致 C. elegans 持续游泳，构成一种独特的环境背景，可能改变其基本生物学特性。例如，与在基于琼脂的固体 NGM 培养基上培养的个体相比，液体培养的线虫其脂肪含量和基因表达发生显著改变——特别是与应激反应相关的基因12,13。另一类单个动物成像方法则采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）装置，将单个个体隔离在固体培养基上，旨在更接近模拟线虫在培养皿中群体培养时所经历的标准环境。WorMotel 是一种具有 240 个孔的 PDMS 装置，专为在固体培养基上培养单个个体而设计。每个孔中填充了使用低熔点琼脂糖替代琼脂的改良 NGM 培养基，并接种细菌作为食物，从而构建出类似于常规培养皿系统中常用的固体培养环境。孔壁呈圆形，使得无论动物位于孔内何处均可被成像（避免了多孔板中动物靠近直角孔壁时造成的视觉遮挡）。在每个孔周围设置的狭窄沟槽中加入硫酸铜，用作驱避剂以防止动物逃离孔洞14,15。该方法的一个局限性在于，当存在厌恶性环境条件（如饮食限制、致病性细菌或诱导细胞应激的化学物质（例如百草枯））时，硫酸铜无法有效阻止线虫逃逸。

另一种使用固体培养基的系统是线虫围栏（Worm Corral），该系统利用水凝胶在载玻片上为每条线虫创建一个小型密闭环境，从而实现对单独隔离的个体进行长期监测16一个关键的局限性在于，动物必须以卵的形式被密封在环境中，因此需要使用无菌动物以防止繁殖，并将药物处理限制为单次给药。在WorMotel系统中，可通过两种方式实现多剂量药物实验：一是在将线虫转移至装置前进行多轮暴露处理，二是在实验过程中向孔中局部追加药物；然而，在后一种情况下，向已有孔中追加药物后的实际暴露剂量难以精确量化，且取决于药物降解的速度。WorMotel和Worm Corral系统均适用于明场或暗场成像，可用于获取与活动性及动物生理状态（如生长与发育）相关的信息。尽管这些系统也可用于荧光监测，但根据我们的经验，用于构建其他单虫成像技术的聚二甲基硅氧烷（PDMS）材料容易产生微气泡、捕获颗粒物以及其他微小异常，从而导致不规则的荧光伪影，干扰荧光信号的一致性观察与定量，尤其是在GFP（绿色荧光蛋白）的发射波段——这是最常用的荧光染料——的检测中尤为明显。 秀丽隐杆线虫 研究。迄今为止，活体荧光成像的 秀丽隐杆线虫 以纵向方式研究个体动物主要依赖于微流控装置17.

此处，我们介绍一种用于培养单个细胞的新型方法 秀丽隐杆线虫 在可兼容厌恶性干预和直接荧光成像的固体培养基上进行。该方法在概念上与其他单虫成像技术相似，不同之处在于用 commercially available 聚苯乙烯微孔板（最初为微细胞毒性检测开发，也常称为 Terasaki 板）替代了定制的 PDMS 芯片。18这些微型培养板的孔中可填充固体培养基并接种细菌食物，从而高度模拟线虫在标准固体NGM培养条件下所处的环境。每个孔周围均被棕榈酸而非硫酸铜形成的厌恶屏障包围。棕榈酸常用于防止线虫在标准平板群体培养中逃离固体培养基，特别是在涉及厌恶环境刺激（如饮食限制或化学应激物暴露）的实验中。该微型培养板还具有极低且稳定的荧光背景，可直接在培养环境中对线虫进行荧光成像。这一新型的单虫固体琼脂培养系统不仅支持在整个生命周期中对个体线虫进行追踪，实时监测其生长、发育、活动及寿命，还可兼容直接荧光显微观察。由于线虫无需麻痹或固定即可成像， 在体 荧光生物标志物可在单个动物个体上进行纵向定量，且动物可持续保留在培养基中，从而能够观察每个个体生命周期内的动态变化。该培养系统还可与当前一代用于追踪寿命及其他健康指标的自动化系统兼容。14,19我们提供了一种培养单个的详细方案 秀丽隐杆线虫 在此基于微孔板的系统中，讨论潜在的陷阱与故障排除方法，并探讨该系统相较于其他系统的优缺点，特别是更新和优化后的WorMotel实验方案。15.

每个单虫培养环境均由一个微型培养盘组成，该培养盘通过定制的3D打印适配器固定在标准单孔培养板内（图1A）。孔内填充低熔点琼脂糖线虫生长培养基（lmNGM），接种浓缩的细菌作为食物来源，并在周围涂覆棕榈酸以防止线虫逃逸（图1B）。微型培养盘与单孔板壁之间的空隙填充饱和水凝胶晶体，以维持湿度（图1B）。培养板盖内表面涂覆去垢剂，以防止冷凝水形成。每个孔中加入一条线虫，单孔培养板用Parafilm密封，以保持湿度并允许氧气交换。一名熟练的研究人员可同时平行制备最多六个微型培养盘。

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方案

1. 配方

注意：在开始微孔板制备之前，请先配制储备液。

  1. 低熔点琼脂糖线虫生长培养基（lmNGM）的储备溶液
    1. 制备 1 M K2HPO4 通过溶解174.18 g的K2在1 L无菌去离子水中加入HPO4，置于1 L瓶中。121 °C、15 psi条件下高压灭菌30分钟，室温（RT）保存。
    2. 配制 1 M KPi （pH 6.0）通过溶解136.09 g KH2HPO4 在1 L无菌去离子水中，于1 L瓶中。用1 M K滴定该溶液。2HPO4 调节至 pH 6.0。在 121 °C、15 psig 条件下高压灭菌 30 分钟，室温保存。
    3. 制备 1 M CaCl₂2 通过溶解73.5 g的CaCl2 在500 mL瓶中的500 mL无菌去离子水中。121 °C、15 psig条件下高压灭菌30分钟，室温保存
    4. 制备 1 M MgSO₄4 通过溶解123.25 g的MgSO4 在500 mL瓶中的500 mL无菌去离子水中溶解。121 °C、15 psig条件下高压灭菌30分钟，室温保存。
    5. 制备 lmNGM 用 3 M NaCl：在洁净的 100 mL 瓶中，加入 100 mL 超纯水和 18.20 g NaCl。在 121 °C、15 psig 条件下高压灭菌 30 分钟。
    6. 在500 mL棕色瓶中加入2.5 g胆固醇、275 mL 100%乙醇和25 mL无菌去离子水，配制成5 mg/mL胆固醇溶液。在121 °C、15 psig条件下高压灭菌30 min，室温保存。
    7. 在15 mL锥形管中，将0.1231 g氟脱氧尿苷（FUdR）溶于10 mL无菌去离子水中，配制50 mM FUdR溶液。使用10 mL注射器和0.22 µm滤器对溶液进行除菌。将溶液分装至10个微量离心管中，每管1 mL，于-20 °C保存。
    8. 在15 mL锥形管中，将500 mg羧苄青霉素溶于10 mL无菌去离子水中，配制50 mg/mL羧苄青霉素溶液。使用10 mL注射器和0.22 µm滤器对溶液进行除菌。将溶液分装至10个微量离心管中，每管1 mL，并于-20 °C保存。
    9. 在15 mL锥形管中，将2.38 g异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）溶于10 mL无菌去离子水中，配制1 mM IPTG溶液。使用10 mL注射器和0.22 µm滤膜过滤除菌。将溶液分装至10个微量离心管中，每管1 mL，于-20 °C保存。
    10. 在15 mL锥形管中，将1 g氨苄青霉素溶于10 mL无菌去离子水中，配制100 mg/mL氨苄青霉素溶液。使用10 mL注射器和0.22 µm滤膜过滤除菌。将100 mg/mL氨苄青霉素溶液每管1 mL分装至10个微量离心管中，于-20 °C保存。
  2. 制备普通线虫生长培养基（NGM） 秀丽隐杆线虫 维持
    1. 要制备50个平板，将10 g细菌琼脂、1.5 g NaCl和1.25 g细菌蛋白胨溶解于500 mL烧瓶中的486 mL超纯水中。将培养基在121 °C、15 psig条件下，使用液体循环高压灭菌至少30 min以进行灭菌。
    2. 高压灭菌后，让培养基冷却至 55 °C，然后加入 12.5 mL 的 1 M KPi, 500 µL 1 M MgSO₄4, 500 µL 1 M CaCl2, 加入500 µL浓度为5 mg/mL的胆固醇溶液。
    3. 采用无菌操作技术，将步骤1.2.2中制备的培养基每份10 mL倒入每个60 mm培养皿中（共50个）。将加有培养基的培养皿静置至少30分钟，使其凝固。用移液器将300 µL过夜培养的细菌菌液加至培养皿中央，置于实验台面上。静置使菌液干燥，并继续培养1–2天以使菌层增厚。将这些含细菌的NGM培养皿于4 °C保存。
  3. 制备 lmNGM 预混液
    1. 在250 mL锥形瓶中，加入2 g低熔点琼脂糖、0.25 g蛋白胨、1 mL 3 M NaCl和99 mL超纯水。在121 °C、15 psig条件下高压灭菌30 min。
    2. 将10 mL lmNGM分装至试管中，用Parafilm封口以防止液体蒸发。盖上管盖，静置使其冷却凝固。
  4. 制备85 mM NaCl用于细菌培养：在100 mL瓶中加入515.61 mg NaCl，加超纯水定容至100 mL。在121 °C、15 psig条件下高压灭菌30分钟。
  5. 在可高压灭菌的挤压瓶中，将1 g S型高吸水性聚合物溶解于150 mL超纯水中，制备吸水性聚丙烯酰胺晶体。剪切瓶尖以确保适当的 dispensing 孔径。于121 °C、15 psig条件下高压灭菌30分钟，用锡箔封口后振荡混匀晶体。
  6. 在15 mL锥形管中，将3 mL 100% Tween-20与7 mL超纯水混合，配制去垢剂溶液。
  7. 在500 mL瓶中加入2.5 g胆固醇、275 mL 100% EtOH和25 mL超纯水，配制成5 mg/mL胆固醇溶液。
  8. 制备棕榈酸工作液
    1. 将500 mg固体棕榈酸在研钵中研磨，随后加入15 mL Tween-20至50 mL锥形瓶中。通过涡旋混合，尽可能溶解其中的晶体。
    2. 加入17.5 mL 100%乙醇，涡旋溶液以尽可能溶解棕榈酸。
    3. 加入17.5 mL超纯水，充分涡旋。将溶液置于80 °C金属浴中温和加热，直至棕榈酸完全溶解。冷却过程中可能有部分棕榈酸析出。
  9. 在1 L或更大烧杯中，将20 g LB粉末溶于1 L去离子水中，配制溶菌肉汤（LB）。将肉汤均分为两份，每份500 mL，分别加入两个500 mL烧杯中。于121 °C、15 psig条件下高压灭菌30 min。制备好的肉汤于室温保存。
  10. 制备LB（Lysogeny Broth）琼脂平板
    1. 在1 L烧瓶中，将10 g LB粉末和7.5 g Bacto琼脂加入500 µL去离子水中，混匀。在121 °C、15 psig条件下，用液体循环灭菌30 min。
    2. 如需要，可在灭菌后的培养基冷却至 55 °C 后加入可选抗生素（500 µL 浓度为 100 µg/mL 的氨苄青霉素）。采用无菌操作技术，将 20 mL 培养基倒入每个 100 mm 培养皿中（共 25 个），制备 LB 琼脂平板。将平板储存于 4 °C。

2. 准备同步化年龄的线虫群体

  1. 准备一批处于幼虫4期（L4）且年龄同步的线虫种群，以便加入微孔板中。或者，也可在任何发育阶段将线虫加入微孔板（若在L4期之前的发育阶段加入线虫，则微孔板培养基中不应含有FUdR，以避免发育停滞）。
    注意：如果实验开始时的目标发育阶段为L4期，则此步骤应在将线虫加入微孔板前2天完成。可根据需要调整同步化时间，使线虫达到预期的发育阶段。
  2. 温度会影响寿命。为获得一致的结果，应使用标准NGM平板（见第1节）在20 °C条件下培养C. elegans，并在细菌食物不足时将线虫转移至新的平板上。
  3. 从含有大量年轻成虫的保存平板中，采用常规方法获得年龄同步的种群，最常用的方法是氯解法20或定时产卵法21。
  4. 分离出虫卵并将其接种到涂有细菌的NGM平板上。若使用野生型C. elegans，虫卵将孵化并发育成线虫，在2天内达到L4幼虫阶段。

3. 准备细菌培养物

  1. 实验开始前一天，接种所需细菌食物来源。每块平板准备约 5 mL 细菌培养物。
    注意：E. coli 食物来源的细菌划线平板可提前最多 1 个月制备，并在 4 °C 下保存。
    1. 从冻存的甘油菌种中划线接种细菌，以获得单菌落，接种于 LB 琼脂平板上。
    2. 在 37 °C 下过夜培养。
    3. 用单个菌落接种液体 LB 培养基，每接种一次使用一个菌落。
    4. 在 37 °C 下以约 250 rpm 振荡培养 12–16 小时。

4. 将棕榈酸涂层应用于微孔板

注意：棕榈酸用作厌恶屏障，以防止动物从各个孔中逃逸。除孔的内表面外，微孔板底部表面的其余部分均需涂覆该物质。在棕榈酸中添加制霉菌素以减少真菌污染。此步骤可根据需要在实验开始前1天完成。

  1. 将珠浴设定为 80 °C，使其有足够时间预热。
  2. 使用前立即取 1 mL 棕榈酸工作液，分装至每个微孔板，并转移至单独的无菌容器（通常为 15 mL 锥形瓶）中，然后每 1 mL 棕榈酸溶液中加入 4 µL 的 10,000 单位/mL 制霉菌素，再进行加热。
  3. 用乙醇（70% 或更高浓度）喷洒微孔板内外至饱和，然后甩去多余乙醇。
    注意：残留的乙醇应在紫外交联处理过程中（步骤 4.4）挥发完全。
  4. 使用紫外交联仪对微孔板进行灭菌（以下说明针对本研究所用的紫外交联仪）：
    1. 将微孔板及其盖子分别放入紫外交联仪中（即不要将盖子盖在板上，因为紫外线无法穿透塑料）。
    2. 关闭门并开启紫外交联仪。
    3. 按下 Time，输入 20 分钟，然后按下 Start。
    4. 20 分钟后，将板和盖翻转，重复步骤 4.2.2–4.2.3。
    5. 戴手套操作，将盖子盖在微孔板上，以防止灭菌后污染。
  5. 通过涡旋振荡和倒置充分混匀棕榈酸工作液。
  6. 将装有棕榈酸工作液的 15 mL 锥形瓶放入珠浴中，待所有可见晶体完全溶解后再使用。
  7. 将微孔板连同盖子一起放置在珠浴周围的台面上预热约 2 分钟。
  8. 取下微孔板盖子。沿微孔板背壁（长边）缓慢加入 200 µL 棕榈酸工作液。重新盖上盖子，并将微孔板置于珠浴上静置 2–3 分钟，使棕榈酸溶液在微孔板底部均匀铺展。
    注意：尽管微孔板底部完全覆盖需至步骤 4.10 才能实现，但此时溶液应已均匀覆盖超过一半的底部表面。若棕榈酸溶液未能均匀铺展，可在微孔板附近开启涡旋振荡器或振动电机，提供轻微振动以促进溶液扩散。保持微孔板盖子盖好，以防污染。
  9. 重复步骤 4.8。
    注意：此时微孔板底部应已有明显液体棕榈酸覆盖，面积约为一半或更多。
  10. 将微孔板旋转 180°，在另一侧重复步骤 4.8 和 4.9。
    注意：只有在两侧均加入棕榈酸溶液（步骤 4.9 和 4.10）后，Terasaki 板底部才会形成一层均匀的薄层。所需棕榈酸混合物体积可能因配制方法、温度及其他因素而异。通常，总共使用 400 至 800 µL 棕榈酸混合液即可完全覆盖微孔板底部。一旦观察到底部已被明显覆盖，即应停止添加棕榈酸，以免污染孔位。
  11. 将微孔板在无盖状态下置于无菌干燥箱或层流罩中干燥至少 1 小时。或者，可在加样前一天（第 5 节）完成此步骤，将微孔板带盖于室温下干燥至少 16 小时。

5. 使用低熔点线虫生长培养基（lmNGM）加样至微孔板

注意：本方法使用标准NGM培养基，并以低熔点琼脂糖替代常规琼脂。琼脂在约45 °C时开始凝固。在使用微量移液器填充微孔板孔时，由于琼脂基NGM凝固迅速，常导致移液器吸头堵塞和/或孔内表面不平整。而使用低熔点琼脂糖的NGM在约28 °C时才开始凝固，使熔融的培养基能够轻松移液，并形成一致平整的孔表面。应在将线虫放置于微孔板的当天制备lmNGM。若在同一天内完成微孔板的lmNGM制备、细菌接种以及接种秀丽隐杆线虫（C. elegans），请确保在开始此系列操作前，线虫已达到或接近目标发育阶段。

  1. 将移液管托盘放入80 °C的金属珠浴中预热。
  2. 将每份待制备的微孔板（步骤1.1）所需的10 mL lmNGM预混液在微波炉中加热约30–45秒，直至融化。
    1. 将lmNGM预混液试管放入一个200 mL烧杯中，不加盖，以防倾倒。
    2. 加热约10–15秒，或当lmNGM预混液刚开始冒泡时，暂停微波炉，将lmNGM预混液倒入无菌的200 mL烧杯中，然后继续微波加热。
    3. 根据需要暂停加热以防止沸腾溢出，并轻轻摇动混合。
    4. 当所有lmNGM完全变为液体且无块状物时，停止微波加热。
      ​注意：一份10 mL的分装量足以填充总共192个孔（两个微孔板）。
  3. 在温热的低熔点琼脂糖中按以下顺序加入下列组分，配制lmNGM（体积按每10 mL低熔点琼脂糖计算）：250 µL 25 mM KPi（pH 6）、10 µL 1 M CaCl2、10 µL 1 M MgSO4和10 µL 5 mg/mL胆固醇。
    1. 若研究人员计划长期观察成虫并需要抑制其繁殖，还需加入10 µL 50 mM FUdR。
    2. 若使用常见的HT115 RNAi E. coli菌株及相关RNAi质粒进行RNAi喂养实验，则还需加入5 µL 50 mg/mL羧苄青霉素（用于筛选RNAi质粒）和12 µL 1 mM IPTG（用于诱导RNAi质粒中双链RNA的表达）。
      注意：可根据所需食物来源中所需的抗生素及其他化学品添加其他添加剂。药物或化学应激物也可在此阶段加入lmNGM。NGM与lmNGM中NaCl的最终浓度相同，但NaCl加入培养基的方式不同。对于NGM，所有NaCl均在培养基制备过程中加入（步骤1.2）。而对于lmNGM，部分NaCl在培养基制备过程中加入（步骤5.3），另一部分则随细菌食物加入（第6节）。这一调整的原因在于微孔板每个孔中的培养基体积较小。将5 µL悬浮于LB中的浓缩细菌加入含有20 µL培养基的孔中，会显著改变培养基的营养组成（因以相近体积引入了LB的组分）。为避免此问题，将细菌重悬于NaCl溶液中，以去除LB组分的同时防止细菌遭受渗透压应激。因此，培养基中加入的NaCl量相应减少，以补偿细菌溶液中所添加的盐分。
  4. 将lmNGM倒入已预热的移液管托盘中。
  5. 将微孔板置于实验台面上，用移液器向每个孔中加入20 µL lmNGM。在更换移液器吸头时应盖上微孔板盖，以尽量减少污染。
    ​注意：使用电子多通道重复移液器可使此步骤更简便。

6. 在微孔板孔中接种细菌食物

注意：使用过夜接种培养物中浓缩10倍的食物5 µL，足以在整个生命周期内喂养一只 C. elegans。

  1. 将细菌从过夜培养物转移至50 mL锥形管中。
  2. 在约3,500 ×g 条件下离心20分钟。
  3. 弃去上清液。用85 mM NaCl溶液将细菌培养物重悬，使其浓度为原培养物的10倍（体积为原培养物的1/10）。
  4. 在将细菌加入孔板前，需目视检查微孔板，确保固体lmNGM完全位于各孔内部。若发现lmNGM附着在孔壁外侧，应用移液枪头刮除多余部分。若不及时清除，多余培养基可能导致食物扩散至棕榈酸中。
  5. 小心吸取5 µL浓缩10倍的细菌培养物，滴加至每个孔中lmNGM表面。应尽量避免细菌培养物溢出孔外进入棕榈酸区域，否则会吸引线虫离开孔内。
  6. 将微孔板置于无菌干燥箱或超净工作台中干燥约35分钟。每约5分钟检查一次，注意避免过度干燥。当观察到少数孔仍略微湿润时即可取出，因为在添加线虫的过程中孔内会继续干燥。

7. 将每个微孔板置于单孔板内

注意：本步骤中，将微孔板使用定制的3D打印插入件固定于标准单孔板内，并用吸水性晶体包围。随后将单孔板盖上并用封口膜密封。此设置允许氧气交换，同时防止污染，并维持足够的湿度，以避免在持续数周的实验过程中 lmNGM 干燥（若研究延长寿命的突变或环境条件，线虫寿命实验可持续6至8周）。在制备过程中，应始终在未主动添加物质时盖住板子，以尽量减少细菌或真菌污染。

  1. 将单孔板、3D打印的适配器及盖子浸入10%次氯酸钠溶液中进行灭菌。用无菌去离子水彻底冲洗，并用擦拭纸擦干。
  2. 用70%或更高浓度的乙醇溶液喷洒单孔板、3D打印适配器和盖子，并用擦拭纸擦拭干净。让残留的乙醇自然挥发干燥。
    注意：在使用次氯酸钠和乙醇处理后，也可采用紫外线照射进行灭菌，参数与上述第4.4步中所述微孔板相同。
  3. 将无菌的3D打印插入件放入无菌的单孔板中。
  4. 用70%乙醇喷洒已准备好的微孔板外表面进行灭菌。
  5. 将微孔板放入单孔板内的3D打印适配器中。
  6. 丢弃微孔板的盖子。
  7. 在微孔板外壁与单孔板内壁之间的3D打印插入件顶部充分加入水凝胶颗粒。
  8. 立即加入线虫（第8节）或密封微孔板以备次日使用。盖上微孔板盖子，并用一层Parafilm封膜包裹四边以密封微孔板。重复此密封步骤两次，共包裹三层Parafilm。
  9. 密封微孔板后，可在室温下置于实验台上最多4天，之后再加入线虫（第8节）。

8. 将线虫加入微孔板

注意：可使用铂金接种针从年龄同步化的线虫群体（第2节）中挑取动物，手动将一条线虫加入每个孔中。仅转移处于目标生活阶段的线虫。如果转移过程超过1小时，微孔板中的lmNGM可能会干燥。每次转移10至20条线虫可加快操作速度，但需要一定练习才能稳定地在每个孔中释放单条线虫。

  1. 当线虫达到所需的生活阶段后，每孔加入一条线虫。
  2. 从源头平板挑取线虫时，应将盖子重新盖回微孔板上，以尽量减少污染。

9. 完成长期使用的培养环境制备

注意：以下步骤旨在确保实验期间微孔板中的培养基和线虫保持湿润。

  1. 向单孔板的盖子中加入约 40 µL 去垢剂溶液，并用擦镜纸均匀涂抹盖子内表面。此涂层可防止板子密封后随时间推移产生冷凝水。继续使用额外的擦镜纸涂抹去垢剂溶液，直至透过盖子观察时无视觉畸变（通常需要约两张擦镜纸）。
  2. 检查水凝胶晶体，确保其表面与微孔板顶部边缘齐平且未溢出。如有必要，向板中添加或移除部分水凝胶晶体。
  3. 采用以下方法用 Parafilm 封口膜包裹微孔板（共使用三段封口膜），以确保封膜可长期保持密封效果：
    1. 略微拉伸第一段 Parafilm，覆盖微孔板的两个侧面。
    2. 略微拉伸第二段 Parafilm，覆盖微孔板剩余的两个侧面。
    3. 拉伸最后一段 Parafilm，完全包裹微孔板的四个侧面，覆盖前两段 Parafilm。正确密封的微孔板可保持湿润状态约 2 个月。
      注意：实验期间应每隔 1–2 周检查 Parafilm 的完整性，并根据需要及时更换。
    4. 用蘸有 70% 乙醇的湿润擦镜纸擦拭微孔板顶部，去除任何指纹。
  4. 使用标签纸标记单孔板。该微孔板现已准备好用于成像，并可长期储存以随时间监测线虫。在各次成像间隔期间，将微孔板置于 20 °C 环境中保存。微孔板可在需要时多次打开并重新密封，以便进行药物处理或其他操作，但应尽量减少开闭次数，以避免污染和水分流失。

10. 在微孔板孔中对单个线虫进行成像

注意：本实验方案的目的是详细描述如何制备微孔板培养环境。制备完成并接种线虫后，微孔板单虫培养环境可用于长期监测多种表型，所用技术与在培养皿上进行的标准培养方法一致。下文提供了测量一些常见表型的基本操作说明。荧光成像必须在正置显微镜下进行。在暗室中，光线穿过Terasaki板时产生的折射可降至最低。

  1. 寿命测定：通过轻轻敲击培养皿侧面或顶部，或在培养皿上照射明亮的蓝光，并观察每只动物的反应来测定其寿命。记录每只动物的存活状态 "死亡的" 如果数秒内无活动，则视为死亡。每1-3天重复一次此操作，直至所有线虫死亡。
    注意：微型培养板培养环境可与自动化图像采集和寿命评估分析系统兼容。14,19.
  2. 标准显微镜观察：使用高分辨率相机或扫描仪对单个孔或整个培养板进行明场（或暗场）成像。该成像数据可用于分析多种表型，包括动物体大小。22,23,24发育25，活性14,19和寿命。
  3. 荧光显微镜：可通过手动或使用电动平台系统对单孔进行荧光成像。单孔培养板可与标准的多孔板适配器兼容。若将装置置于黑色壁盒内，可最大限度降低信噪比。
    注意：由于线虫在培养过程中仍可自由爬行，因此该培养系统适用于低分辨率成像，以捕获整个生物体的荧光信号及荧光标记物在组织中的大致定位。高分辨率和高倍成像通常需要固定动物以防止运动。尽管可以通过在每个孔中局部添加麻痹剂（如叠氮化钠或左旋咪唑）来实现高分辨率成像，但这将无法对同一条线虫在后续时间点进行重复测量。此外，如所述，该培养系统不适合倒置使用，因而不能用于倒置显微镜系统。
    1. 如果未使用明场成像来测量寿命，而仅采集荧光信号，则需手动测量寿命。将用于GFP激发的蓝光照射线虫5秒，以诱导其运动。若动物在5秒内未发生移动，则判定该动物已死亡。

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结果

本文所述基于微培养板的单虫培养环境可用于监测多种表型，包括寿命与健康寿命、活动能力与运动行为、身体形态与爬行轨迹几何特征，以及随时间推移对个体动物中转基因表达的荧光生物标志物的检测。该微培养板系统适用于通过人工评分或图像采集结合下游成像分析来进行寿命分析。与在培养皿上的标准培养方法21类似，可通过刺激后是否产生运动（例如轻敲培养皿或暴露于蓝光）来人工判断线虫的存活或死亡状态。对于基于图像的寿命分析，可通过比较施加刺激后连续图像帧之间的差异，确定每条线虫何时停止运动。该方法可与自动化的图像采集和分析系统兼容，并能提供额外数据，即每个时间点个体动物的活动水平。这些信息不仅可用于估算寿命（运动停止），还可用于评估健康寿命（活动水平下降至某一阈值；目前已有多种定义被提出）。此外，还可从这些图像中测量其他参数（如体型、形态和姿势）。

该微型培养板系统的特征包括：（1）能够长期追踪单个动物的个体变化；（2）培养系统与厌恶性干预措施（如饮食限制或化学应激剂）具有良好的兼容性；（3）能够在培养环境中直接测量荧光信号。为展示这些特性，我们将线虫暴露于2...

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讨论

在此，我们介绍一种新型培养系统，该系统采用原本用于人类白细胞抗原组织分型检测的微孔板，以实现单个细胞的分离与表征 秀丽隐杆线虫 在与基于琼脂的NGM标准培养基环境相似的固体培养基中，随时间推移 秀丽隐杆线虫 研究。该系统可兼容多种干预措施，包括饮食限制、外源性药物处理、化学或环境应激物刺激以及RNAi。此外，还可实现对荧光生物标志物的长期纵向监测 体内 在个体动物中。在群体中追踪个体动物的能力，使得能够评估具有明显时间成分的表型在个体内部的变异性，包括行为、发病过程、对压力条件的反应以及健康状况的下降。同时，该方法还可将群体中个体早期生命特征的变化与晚期生命结局（包括寿命和健康状况）相联系。与其它单虫成像技术类似，这种基于微孔板的培养系统可实现对个体动物在整个生命周期中多个时间点的监测，同时避免了潜在的混杂因素，例如当线虫在液体环境中培养时所引发的应激反应通路激活（许多微流控装置即存在此类情况）。因此，该培养系统所获得的数据可更直接地与以往大多数研究结果进行比较 秀丽隐杆线虫 在固体培养基上进行的工作。近期的技术进步使得许多方面的自动化成为可能 秀丽隐杆线虫...

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披露

作者声明不存在任何需要披露的利益冲突。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）R35GM133588 项目资助，授予 G.L.S.， NIHT32GM008659 培训资助项目（授予 L.E.），美国国家医学科学院 Catalyst 奖（授予 G.L.S.），以及由亚利桑那州理事会管理的亚利桑那州技术和研究倡议基金。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3D打印的Terasaki插件定制打印公司Robot_Terasaki_tray_insert_10-20
-2021.STL		使用标准PLA增强型细丝，FDM打印，喷嘴尺寸0.6 mm
AirClean系统AC624LF垂直层流通风柜菲舍尔科技公司36-100-4376
胰蛋白胨赛默飞世尔科技公司211677
CaCl2Acros有机物349615000
秀丽隐杆线虫 N2秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）N2野生型菌株
羧苄青霉素GoldbioC-103-25
胆固醇ICN生物医学公司101380
大肠杆菌 OP50 秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）OP50C. elegans的标准实验室食物
乙醇密理博公司ex0276-4
菲舍尔Vortex Genie 2涡旋振荡器菲舍尔科技公司G-560
FUdR 研究产品国际公司F10705-1.0
吸水性水凝胶晶体 M2高分子技术公司型号S型号S超强吸水性聚合物
异丙基-ß-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）GoldBioI2481C100
K2HPO4菲舍尔化学P288-500
Kimwipes纸巾KimTech34155实验用擦拭纸
LB肉汤，Lennox配方BD Difco240230
Leica K5 sCMOS黑白相机徕卡显微系统公司11547112
Leica M205 FCA荧光体视显微镜徕卡显微系统公司10450826
低熔点琼脂糖研究产品国际公司A20070-250.0
MgSO4 菲舍尔化学M-8900
NaCl菲舍尔生物试剂BP358-1
Nunc OmniTray单孔板赛默飞世尔科技公司264728
制霉菌素西格玛公司N1538
棕榈酸Acros有机物129700010
纸巾Coastwide Professional365374
Parafilm M封口膜Parafilm16-101
Stratagene UV Stratalinker 2400Stratagene400075紫外交联仪
Terasaki板（Lambda）One Lambda151431
Thermolyne Dri-bath干浴器ThermolyneDB28125
Tween 赛默飞世尔科技公司J20605-AP

参考文献

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长期培养个体细胞 秀丽隐杆线虫 在固体培养基上进行纵向荧光监测和厌恶干预
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