长期培养个体细胞 秀丽隐杆线虫 在固体培养基上进行纵向荧光监测和厌恶干预

摘要

本文介绍了一种在固体培养基上培养单个分离线虫并对其进行终生生理参数监测和荧光定量的实验方案。该培养系统在单虫培养孔周围设置棕榈酸屏障，以防止线虫逃逸，从而允许使用具有厌恶性干预条件，包括致病菌和化学应激物。

摘要

Caenorhabditis elegans 被广泛用于研究衰老生物学。在 C. elegans 衰老研究中的常规做法是将线虫群体培养在固体线虫生长培养基（NGM）上，从而高效地收集群体水平的生存数据及其他生理表型数据，并定期取样亚群以定量荧光生物标志物。该方法的局限性在于无法（1）对个体线虫进行长期追踪，以建立感兴趣表型的年龄轨迹；以及（2）在培养环境中直接监测荧光生物标志物。其他替代性培养方法采用液体培养或微流控技术对个体动物进行时间序列监测，部分情况下包括荧光定量，但其代价是培养环境与固体NGM在情境上存在显著差异。WorMotel 是一种先前报道的微加工多孔装置，可用于在固体NGM上培养分离的线虫。每条线虫被维持在一个含有固体NGM的孔中，孔周围由充满硫酸铜的护城河包围，硫酸铜是一种对 C. elegans 具有接触驱避作用的物质，从而实现对个体动物的纵向监测。我们发现，当施加衰老研究中常见的厌恶干预（包括饮食限制、致病菌和诱导细胞应激的化学试剂）时，硫酸铜不足以阻止线虫逃逸。此外，这些多孔装置由聚二甲基硅氧烷（PDMS）模制而成，会在荧光成像中产生较高的背景伪影。本实验方案描述了一种新方法，利用市售的聚苯乙烯微孔板（最初设计用于人类白细胞抗原（HLA）分型）在固体NGM上培养分离的线虫，可在整个生命周期内测量生存率、生理表型和荧光信号。棕榈酸屏障可防止线虫逃逸，即使在存在厌恶条件的情况下亦然。每块微孔板最多可培养96条动物，且可轻松适应多种实验条件，包括饮食限制、RNA干扰（RNAi）和化学添加剂，并兼容自动化系统以采集寿命和活动数据。

引言

C. elegans 是遗传学、细胞生物学和分子生物学研究中一种强大的模式生物，因为它们易于在实验室中培养，具有较短的世代时间和寿命，与哺乳动物在蛋白质序列上具有高度同源性，并且其透明的身体结构使得能够在活体（in vivo）中直接观察荧光蛋白和染料的分布¹。由于 C. elegans 长期被广泛用作发育生物学、衰老等多个研究领域的重要模型系统，其生长与发育过程已被深入理解，基因组已实现全序列测定，同时已开发出一系列强大的遗传学工具，包括全基因组范围的RNAi饲喂文库，以及数千种突变体和转基因品系。传统上，C. elegans 在固体琼脂线虫生长培养基（NGM）上以群体形式培养，表型通过直接观察或成像结合后续分析进行人工评估。荧光显微镜可用于检测个体 C. elegans 中由染料或转基因表达的荧光标签所呈现的多种分子表型。荧光成像通常需要将线虫固定或麻痹在载玻片上的薄层琼脂糖垫中，该过程具有侵入性，且常导致动物死亡。此外，该方法还需使用化学试剂（如左旋咪唑或叠氮化钠），这些试剂可能干扰所研究的分子过程^2,3。上述方法能够获取涵盖多种表型的横断面群体水平数据，但无法实现对单个动物随时间的连续追踪。

近年来，多种方法被开发用于....

方案

1. 配方

注意：在开始微孔板制备之前，请先配制储备液。

1. 低熔点琼脂糖线虫生长培养基（lmNGM）的储备溶液
   1. 制备 1 M K₂HPO₄ 通过溶解174.18 g的K₂在1 L无菌去离子水中加入HPO4，置于1 L瓶中。121 °C、15 psi条件下高压灭菌30分钟，室温（RT）保存。
   2. 配制 1 M KP_i （pH 6.0）通过溶解136.09 g KH₂HPO₄ 在1 L无菌去离子水中，于1 L瓶中。用1 M K滴定该溶液。₂HPO₄ 调节至 pH 6.0。在 121 °C、15 psig 条件下高压灭菌 30 分钟，室温保存。
   3. 制备 1 M CaCl₂₂ 通过溶解73.5 g的CaCl₂ 在500 mL瓶中的500 mL无菌去离子水中。121 °C、15 psig条件下高压灭菌30分钟，室温保存
   4. 制备 1 M MgSO₄₄ 通过溶解123.25 g的MgSO₄ 在500 mL瓶中的500 mL无菌去离子水中溶解。121 °C、15 psig条件下高压灭菌30分钟，室....

结果

本文所述基于微培养板的单虫培养环境可用于监测多种表型，包括寿命与健康寿命、活动能力与运动行为、身体形态与爬行轨迹几何特征，以及随时间推移对个体动物中转基因表达的荧光生物标志物的检测。该微培养板系统适用于通过人工评分或图像采集结合下游成像分析来进行寿命分析。与在培养皿上的标准培养方法²¹类似，可通过刺激后是否产生运动（例如轻敲培养皿或暴露于蓝光）来人工判断线虫的存活或死亡状态。对于基于图像的寿命分析，可通过比较施加刺激后连续图像帧之间的差异，确定每条线虫何时停止运动。该方法可与自动化的图像采集和分析系统兼容，并能提供额外数据，即每个时间点个体动物的活动水平。这些信息不仅可用于估算寿命（运动停止），还可用于评估健康寿命（活动水平下降至某一阈值；目前已有多种定义被提出）。此外，还可从这些图像中测量其他参数（如体型、形态和姿势）。

该微型培养板系统的特征包括：（1）能够长期追踪单个动物的个体变化；（2）培养系统与厌恶性干预措施（如饮食限制或化学应激剂）具有良好的兼容性；（3）能够在培养环境中直接测量荧光信号。为展示这些特性，我们将线虫暴露于2.......

讨论

在此，我们介绍一种新型培养系统，该系统采用原本用于人类白细胞抗原组织分型检测的微孔板，以实现单个细胞的分离与表征 秀丽隐杆线虫 在与基于琼脂的NGM标准培养基环境相似的固体培养基中，随时间推移 秀丽隐杆线虫 研究。该系统可兼容多种干预措施，包括饮食限制、外源性药物处理、化学或环境应激物刺激以及RNAi。此外，还可实现对荧光生物标志物的长期纵向监测 体内 在个体动物中。在群体中追踪个体动物的能力，使得能够评估具有明显时间成分的表型在个体内部的变异性，包括行为、发病过程、对压力条件的反应以及健康状况的下降。同时，该方法还可将群体中个体早期生命特征的变化与晚期生命结局（包括寿命和健康状况）相联系。与其它单虫成像技术类似，这种基于微孔板的培养系统可实现对个体动物在整个生命周期中多个时间点的监测，同时避免了潜在的混杂因素，例如当线虫在液体环境中培养时所引发的应激反应通路激活（许多微流控装置即存在此类情况）。因此，该培养系统所获得的数据可更直接地与以往大多数研究结果进行比较 秀丽隐杆线虫 在固体培养基上进行的工作。近期的技术进步使得许多方面的自动化成为可能 秀丽隐杆线虫.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3D打印的Terasaki插件	定制打印公司	Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 -2021.STL	使用标准PLA增强型细丝，FDM打印，喷嘴尺寸0.6 mm
AirClean系统AC624LF垂直层流通风柜	菲舍尔科技公司	36-100-4376
胰蛋白胨	赛默飞世尔科技公司	211677
CaCl2	Acros有机物	349615000
秀丽隐杆线虫 N2	秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）	N2	野生型菌株
羧苄青霉素	Goldbio	C-103-25
胆固醇	ICN生物医学公司	101380
大肠杆菌 OP50	秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）	OP50	C. elegans的标准实验室食物
乙醇	密理博公司	ex0276-4
菲舍尔Vortex Genie 2涡旋振荡器	菲舍尔科技公司	G-560
FUdR	研究产品国际公司	F10705-1.0
吸水性水凝胶晶体	M2高分子技术公司	型号S	型号S超强吸水性聚合物
异丙基-ß-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）	GoldBio	I2481C100
K2HPO4	菲舍尔化学	P288-500
Kimwipes纸巾	KimTech	34155	实验用擦拭纸
LB肉汤，Lennox配方	BD Difco	240230
Leica K5 sCMOS黑白相机	徕卡显微系统公司	11547112
Leica M205 FCA荧光体视显微镜	徕卡显微系统公司	10450826
低熔点琼脂糖	研究产品国际公司	A20070-250.0
MgSO4	菲舍尔化学	M-8900
NaCl	菲舍尔生物试剂	BP358-1
Nunc OmniTray单孔板	赛默飞世尔科技公司	264728
制霉菌素	西格玛公司	N1538
棕榈酸	Acros有机物	129700010
纸巾	Coastwide Professional	365374
Parafilm M封口膜	Parafilm	16-101
Stratagene UV Stratalinker 2400	Stratagene	400075	紫外交联仪
Terasaki板（Lambda）	One Lambda	151431
Thermolyne Dri-bath干浴器	Thermolyne	DB28125
Tween	赛默飞世尔科技公司	J20605-AP