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方法文章

Marsdenia tenacissima 与 Ganoderma lucidum 共发酵及其发酵产物的抗肺癌作用

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DOI：

10.3791/64687

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2022年12月16日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Minzu University of China, 2Ministry of Education, Key Laboratory of Ethnomedicine (Minzu University of China)

本文内容

摘要

本文介绍了一种建立系统性、综合性共发酵体系的方案，该体系以通关藤（Marsdenia tenacissima (Roxb.) Wight et Arn.，MT）作为发酵基质，用于灵芝（Ganoderma lucidum）的发酵，以获得富含辛辣性皂苷的生物转化产物。该方法可为其他民族药物的开发提供方法学参考。

摘要

Marsdenia tenacissima (Roxb.) Wight et Arn.（MT）作为一种传统中药和傣药，具有抗炎、抗菌和抗肿瘤特性。然而，其主要活性物质多为苷元，例如 tenacigenin A 和 tenacigenin B。由于 MT 的生物利用度较低，且药用活性成分难以化学合成，目前主要通过生物转化方式进行研究。本研究旨在以 MT 作为发酵基质，利用Ganoderma lucidum（G. lucidum）进行发酵，制备富含辛辣皂苷的生物转化产物。

通过三种药用真菌的初步筛选发现 G. lucidum 和 Ophiocordyceps sinensis (O. sinensis）通常可在MT培养基中生长；因此，通过肺癌小鼠模型筛选了这两种真菌发酵产物的功效。最后，进行了共发酵 G. lucidum 并选择MT进行进一步研究。对MT反应产物进行非靶向代谢组学分析。 G. lucidum 共发酵。我们从发酵产物中鉴定出12种MT的特异性皂苷, 并从发酵产物中获得了一种单体化合物，tenacigenin A。

大多数去乙酰基海星甾醇含量均呈现显著上升趋势，尤其是去乙酰基海星甾醇A和去乙酰基海星甾醇B的水平。结果表明，经过灵芝（G. lucidum）发酵后，马钱子（MT）的药效得到提升。此外，MT中C21甾体皂苷的生物转化是该发酵过程的核心反应。综上所述，本研究建立了一套系统而全面的马钱子共发酵体系及药效学评价方法，不仅提高了马钱子中有效活性物质的充分利用，也为其他民族药物的开发提供了方法学参考。

引言

肺癌在传统中医中属于"肺痈"的范畴。肺痈的病机为患者正"气"亏虚、阴阳失调、毒邪内蕴及肺络瘀滞，导致肺功能失常，肺中气血瘀阻、津液耗损。久之，肺内瘀血与痰毒积聚，形成肺部肿块1。因此，扶正祛邪是治疗肺癌的基本原则。通过滋阴以调和阴阳、清热解毒、化瘀散结、补气养阴及化痰等治法，用以治疗并防止肺痈的形成2。

Marsdenia tenacissima（MT）是一种隶属于萝藦科（Asclepiadaceae）的药用植物（Marsdenia 属），又名乌骨藤。其具有清热解毒、止咳平喘的功效，并具有抗肿瘤活性3。由MT单味药材制成的小艾平注射液已在临床上广泛应用，显示出良好的抗癌治疗效果4。然而，随着人口增长，对MT的需求急剧上升，导致野生MT资源供应不足，且栽培药材质量参差不齐。药材品质差、成分含量不稳定、生物利用度低等问题严重制约了MT的发展。在这些生物活性成分中，MT皂苷受到广泛关注。目前已鉴定出100多种MT皂苷，主要分为两大类：（1）MT中的C21甾体糖苷，包括tenacissoside A-P、marsdenoside A-M、tenacigenoside A-L和tenacigenin A-D；（2）五环三萜类化合物，如齐墩果酸和熊果酸。多项研究表明，MT的石油醚提取物的抗癌活性高于其高极性分子组分。因此，将MT中主要的皂苷多糖转化为生物利用度和生物活性更高的微量苷元成分具有重要意义5。

生物转化，也称为生物催化，是指利用生物系统中的相关酶对外源性底物进行转化或结构修饰的生理和生化反应6。与传统的化学合成相比，生物转化更具经济性、安全性，并具有区域选择性和立体选择性，能够制备一些通过常规合成化学难以获得的生物活性化合物7,8。因此，发展中医药和天然药物对于推动中医药的现代化和国际化至关重要。

采用生物转化方法建立了MT的共发酵体系 。原始药材通过微生物酶系统进行转化。一方面，以MT提取物作为底物，在该模式下用于真菌发酵培养物的制备；同时，真菌发酵缩短了菌种培养周期，降低了生产成本，并提高了生产效率9。另一方面，真菌发酵可增加活性成分的生成，有利于产生新的化学成分并提升药效10。采用液体双向发酵技术有助于保护中药材中的活性成分，提高药效，节约药材资源，并可通过为中药活性成分的结构修饰提供技术手段而获得更优的疗效。这对提升中药现代化水平具有重要意义。

本研究在文献调研后，选择灵芝（G. lucidum）、冬虫夏草（O. sinensis）和桦褐孔菌（Inonotus obliquus，I. obliquus）作为发酵用微生物进行初期菌株的初步筛选。随后，通过肿瘤小鼠模型考察筛选菌株的功效，确定最终用于发酵的菌株。最后，采用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）对发酵产物中的初级代谢物和次级代谢物进行系统性分析与评价，从中获得了一个单体化合物——tenacigenin A。

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方案

本研究遵循中央民族大学实验动物中心的建议进行（编号：ECMUC2019008AA）。实验方案经中央民族大学实验动物伦理委员会批准。MT 样本采自中国云南省昆明市。

1. 研究前的准备工作

  1. 用热水（100 °C；MT/水 = 1/10，w/v）提取 MT 30 分钟，并收集 MT 提取残渣作为测试材料。
  2. 将 LLC 小鼠肺癌细胞系维持在添加了 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，在 37 °C、5% CO2 的湿化气氛中培养。
  3. 将 6–8 周龄、体重为 19 ± 2 g 的 C57BL/6J 小鼠饲养在环境可控的房间内，保持 12 小时光照/12 小时黑暗的循环，自由摄食和饮水，并定期进行消毒。

2. 菌株的初步筛选

  1. 采用无菌操作技术将三种真菌菌株接种至马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）固体培养基中，在28 °C避光条件下培养。待培养皿被菌丝完全覆盖后，于4 °C保存。
  2. 将保存在PDA固体培养基中的菌株接种至一级摇瓶种子液中，在28 °C、120 rpm振荡条件下培养4–5天。按1:20的体积比将一级真菌液体接种至含有二级真菌液体的摇瓶中，在恒温摇床中继续振荡培养4–5天。
  3. 将MT用水稀释至100 mg/L（MT/水），并将该溶液加入琼脂中制成固体培养基。取每种菌株的二级真菌液体各1 mL，分别接种至仅含MT的固体培养基中，形成G. lucidum-MT、I. obliquus-MT和O. sinensis-MT三种培养体系。将这些培养体系置于28 °C避光静置培养。
  4. 培养一段时间后，观察上述三种培养体系中菌株的生长情况，筛选出仅能在含MT条件下生长的菌株进行进一步筛选。

3. 菌株筛选的重新筛选

注意：经过初步筛选，只有 G. lucidum 和 O. sinensis 能够在含 MT 的固体培养基上正常生长。为了进一步筛选具有较好抗肿瘤效果的体系，采用移植性肿瘤小鼠模型检测其抗肿瘤功效。

  1. 接种 G. lucidum 和 O. sinensis 仅含MT-MT的液体培养基中 G. lucidum 共发酵（MGF）和MT O. sinensis 共发酵（MOF），在28 °C、180 rpm振荡条件下培养10天。
  2. 发酵结束后，用纱布过滤菌丝体并干燥，用80%乙醇提取3次，每次12小时。
  3. 检测发酵与未发酵MT在荷LLC肿瘤细胞的C57BL/6J小鼠中的抗肿瘤活性。
    1. 皮下注射LLC细胞（1.0 × 106 每只小鼠右侧 flank 注射 0.2 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中的细胞（对照组除外）。
    2. 为确认模型成功建立，触诊肿瘤结节并验证其直径约为5 mm。将荷瘤小鼠随机分为模型组、MGF组、MOF组、MT组和顺铂组（阳性对照组），每组10只。对照组（未接种肿瘤细胞）和模型组给予生理盐水处理。连续给药14天后处死小鼠，取肿瘤组织。

4. 发酵产物的化学成分分析

注意：在验证发酵效果后，本研究选用G. lucidum作为发酵菌株。我们通过液相色谱-质谱法（LC-MS）对MGF进行了代谢组学分析11。

  1. 取10 mg的MT、G. lucidum以及MT与G. lucidum共发酵产物（MGF），加入500 µL甲醇:H2O（7:3）进行提取，在4 °C下振荡1分钟，超声处理30分钟，然后在1,200 × g条件下离心20分钟。收集上清液，经0.22 µm聚偏氟乙烯膜过滤后，注入液相色谱-串联质谱系统（LC-MS/MS）中。
    ​注意：采用超高效液相色谱（UPLC）分离代谢物，并通过高分辨质谱建立质量控制（QC）样本数据库（见材料表）。
  2. 使用以下UPLC条件：C18色谱柱（100 mm × 2.1 mm；8 µm），流动相A为含0.1%（v/v）甲酸的超纯水，流动相B为乙腈。设置梯度洗脱程序如下：0分钟时B相为5%；2分钟时为5%；14分钟时升至98%；17分钟时保持98%；17.1分钟时降至5%；20分钟时维持5%，流速为0.3 mL/min。
  3. 采用高分辨质谱检测并鉴定代谢物。设定色谱柱温度为40 °C，自动进样器温度为4 °C，进样体积为2 µL。质谱条件设置如下：电喷雾离子源电压：+5,500/-4,500 V；帘气、离子源1和离子源2的压力分别为35、60和60 psi；离子源温度：600 °C；去聚化电位：±100 V。
  4. 将MT、GL和MGF提取物等体积混合制备质量控制样品（QCs），并将三个重复样品分别命名为QC 1-3。按照相同步骤处理和检测质量控制样品及分析样品。每检测三个样品插入一个QC样品，以评估检测与分析的重复性。

5. 发酵产物的提取与分离

  1. 将从发酵液中获得的发酵提取物溶于蒸馏水中，并充分搅拌。
    注意：此处，从40 L发酵液中获得了2 kg发酵提取物。
  2. 从第4部分开始，使用大孔吸附树脂柱依次洗脱10%、30%、50%、70%和95%乙醇梯度洗脱组分，并收集各洗脱组分。
    注意：此处，获得95%乙醇组分10.72 g、70%乙醇组分34.72 g、50%乙醇组分61.57 g以及30%乙醇组分79.7 g。
  3. 根据各组分的极性，采用硅胶柱色谱法，以乙酸乙酯:甲醇为洗脱剂对70%乙醇组分进行洗脱，并收集各组分。
    注意：此处，收集了Fr. 1至Fr. 7组分。
  4. 对组分（此处为Fr. 3和Fr. 4）进行Sephadex LH-20柱色谱进一步纯化，随后取每份1.0 g进行半制备型液相分离。
    注意：通过半制备型液相色谱和硅胶柱色谱，我们对95%乙醇组分进行了分离与纯化。
  5. 进行显微光谱分析和核磁共振波谱分析，将化合物的结构与600M和700M数据库中的结构进行比对，确定化合物的平面结构。
    注意：此处使用混合型质谱仪测定混合物的分子量。我们鉴定了其中一种化合物的结构（见补充图S1）。

6. 统计分析

  1. 重复所有发酵实验六次。使用 Student's t-检验评估统计学显著性。所有数据均以均值 ± 标准差（SD）表示，所有实验均重复三次，统计学显著性水平设为 p < 0.05（*0.01 ≤ p ≤ 0.05，**0.001 ≤ p ≤ 0.01，***p ≤ 0.001）。
  2. 使用 SCIEX OS 软件，主要依据质荷比误差、保留时间、同位素匹配度、MS/MS 谱库纯度评分以及计算所得的分子式来鉴定代谢物。采用以下谱库设置参数：质荷比误差 < 5 ppm，同位素丰度比差异 < 20，以及谱库匹配评分 > 50。

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结果

菌株初步筛选结果
为了探索能够与MT共同发酵的真菌，我们选取了三种真菌： G. lucidum, I. obliquus，以及 O. sinensis首先，对菌株进行活化： 灵芝，桦褐孔菌 和 O. sinensis 在PDA培养基中接种，如图所示 图1A-C; 图1D-F 显示了接种到液体PDA培养基后的结果。第二步是将继代种子液中的真菌接种到仅含MT的固体培养基中；仅 G. lucidum 和 O. sinensis 能够正常生长（图1G，H）。真菌接种于MT液体培养基中，培养10天后的结果...

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讨论

经过菌株筛选实验发现，并非所有药用真菌都能在药材基质上正常生长。在不添加任何额外培养基的情况下，药用真菌的存活依赖于其自身酶对药材成分的降解，以合成所需的碳源和氮源。由此可推断，I. obliquus 可能不含能够降解蒙药中皂苷的酶类。对于能够与蒙药共发酵的 G. lucidum 和 O. sinensis，这两种药用真菌均能在以蒙药为底物的培养基上正常生长。发酵产物的抗肿瘤效果是评价其药用价值的最佳指标。

通过建立小鼠肿瘤模型，我们发现经过真菌发酵后，MT的抗肿瘤作用显著增强。由此可以推断，药用真菌发酵后，MT中与难吸收和高极性相关的活性成分可能被分解为生物利用度高、极性低的物质。许多研究表明，石油醚提取物的抗癌活性高于MT中的弱极性分子16。 MGF的抗肿瘤效果强于MOF，表明灵芝（G. lucidum）通过生物转化对MT的作用强于冬虫夏草（O. sinensis）。因此，有必要对MGF的成分进行详细分析。

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披露

作者声明，他们不存在任何已知的相互竞争的经济利益或可能被认为影响本文所报告工作的个人关系。

致谢

本工作得到中国国家自然科学基金（81973977）项目的资助。MT 样品由刘彤翔教授鉴定，并保存于中央民族大学药学院。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙腈Tonguang Fine Chemicals Company, Beijing, China20200923
琼脂Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd., USANO.20080107
高压灭菌器BinJiang Medical Co., Ltd., Jiangyin, ChinaLS-50LD
恒温振荡培养箱Zhicheng Inc. All rights reserved., Shanghai, ChinaZWY-100D
Ganoderma lucidumBeNa 培养物保藏中心，中国北京31732
Inonotus obliquusBeNa 培养物保藏中心，中国北京117822
LLC 小鼠肺癌细胞国家细胞资源库，中国北京PUMC000673
雄性 C57BL/6J 小鼠北京维通利华实验动物技术有限公司，中国北京No.110011210107024684
甲醇Tonguang Fine Chemicals Company, Beijing, China20210723
Ophiocordyceps sinensisBeNa 培养物保藏中心，中国北京118371
聚四氟乙烯金腾实验设备有限公司，中国天津No.997
QTRAP 5500 液相色谱-质谱联用仪AB Sciex Pte. Ltd., USACV20231711
旋转蒸发仪BUCHI Co., Ltd., Shanghai, ChinaR-300
注射器智宇医疗器械有限公司，中国江苏V500111
超净工作台博迅医疗生物仪器股份有限公司，中国上海SW-CJ-LFD

参考文献

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