一种用于研究多孔介质中生物堵塞的微流控平台

摘要

本方案描述了一种微流控平台，通过结合高分辨率显微成像与同步压力差测量，用于研究生物膜在准-二维多孔介质中的发育过程。该平台可量化多孔介质中孔隙尺寸和流体流速对生物堵塞的影响。

摘要

细菌生物膜存在于多种环境和工业多孔介质中，包括土壤和过滤膜。在特定的流动条件下，生物膜会生长并堵塞孔隙，从而改变局部流体的流动路径。生物膜堵塞孔隙的能力，即所谓的生物堵塞（bioclogging），可能显著影响多孔介质的局部渗透性，导致系统内压力积聚，并影响物质的流动。为了理解在不同物理条件（例如，不同流速和孔径大小）下生物膜生长与流体流动之间的相互作用，本研究开发了一种微流控平台，可在外部施加且受控的物理条件下，利用显微镜观察生物膜的发育过程。同时，可通过压力传感器测量生物膜引起的多孔介质内压力积聚，并进一步与生物膜的表面覆盖率进行关联分析。该平台为系统性研究流动条件下多孔介质中生物膜引起的生物堵塞提供了基础，且可进一步调整用于研究环境分离菌株或多物种生物膜。

引言

生物膜——嵌入由胞外多聚物（EPS）构成的自分泌基质中的细菌群落——广泛存在于自然多孔介质中，如土壤和含水层¹，以及在技术与医学应用中，例如生物修复²、水过滤³和医疗器械⁴。生物膜基质主要由多糖、蛋白质纤维和胞外DNA^5,6组成，其组成高度依赖于微生物种类、营养物质的可利用性以及环境条件⁷。然而，基质的功能具有普遍性：它构成生物膜结构的支架，保护微生物群落免受机械和化学胁迫，并在很大程度上决定了生物膜的流变特性⁵。

在多孔介质中，生物膜的生长可堵塞孔隙，导致所谓的生物堵塞。生物膜的发育受流体流动和多孔介质孔隙尺寸的控制，其中孔隙尺寸定义为两个支柱之间的间距。^8,9,10孔径大小和流体流动共同控制着营养物质的传输以及局部剪切力。反过来，生长的生物膜会堵塞孔隙，从而影响流体的速度分布。^11,12,13，多孔介质的质量传输和水力传导率^14,15水力传导率的变化通过封闭系统中压力的升高体现出来^16,17,18,19当前关于生物膜形成与生物堵塞的微流控研究主要集中在均质几何结构中流速影响的探讨^16,20 （即具有单一孔径） 或非均质多孔介质^12,21,22然而，为了厘清流速和孔径对生物膜发育及其在生物堵塞多孔介质中引起的压力变化的影响，需要一个高度可控且多功能的实验平台，以并行研究不同多孔介质结构和环境条件下的情况。

本研究介绍了一种微流控平台，该平台结合了压力测量与对多孔介质内动态生物膜的同步成像。由于聚二甲基硅氧烷（PDMS）具有透气性、生物相容性以及通道几何结构设计的灵活性，由PDMS制成的微流控装置是研究多孔介质中生物膜发育的合适工具。微流控技术使得 以高精度控制物理和化学条件（例如，流体流动和营养物质浓度），以模拟微生物生境的环境²³此外，可使用光学显微镜以微米级分辨率对微流控装置进行成像，并可结合在线测量（如局部压力）。

本研究通过在受控的施加流动条件下，使用均质多孔介质模拟物，重点探究孔隙尺寸对生物堵塞过程的影响。采用注射泵驱动培养基流经微流控通道，同时利用压力传感器实时测量通道内的压差变化。通过向微流控通道中接种浮游态的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）启动生物膜的形成。在不同实验条件下，定期对发育中的生物膜进行成像并开展图像分析，从而获得孔隙尺度上表面覆盖率的详细信息。压力变化与生物堵塞程度之间的关联数据，为估算生物堵塞多孔介质的渗透率提供了关键依据。

方案

1. 硅片制备

1. 使用计算机辅助设计（CAD；参见材料表）软件设计微流控通道的几何结构，并将其打印到透明胶片上以制作光掩模（图1A）。
2. 通过软光刻技术（在洁净室条件下）按照以下步骤制备主模具。
   1. 将硅片在 200 °C 下烘烤 2 小时。
   2. 将硅片置于匀胶机中心，并在其表面倒入 SU8 3050 光刻胶（参见材料表）。以 10 秒/100 转的升速时间，于 1,700 rpm 转速下旋涂 40 秒。
      注：旋涂参数设定旨在使 SU8 3050 达到目标厚度 100 µm。
   3. 旋涂完成后，在 65 °C 下预烘 600 秒，随后在 95 °C 下烘烤 2,700 秒。让硅片在室温下冷却过夜。
      注：过夜冷却有助于增强 SU8 与硅片之间的附着力。
   4. 将光掩模（步骤 1.1）放置于硅片上，并用波长为 350 nm、曝光能量为 250 mJ/cm² 的紫外光进行曝光。
   5. 曝光后，将已曝光的基底在 65 °C 下烘烤 60 秒，随后在 95 °C 下烘烤 300 秒。
   6. 通过将硅片浸入盛有 mrDev600 显影液（参见材料表）的烧杯中进行显影，以获得主模具。轻轻摇动烧杯 1,800 秒以洗去未聚合的光刻胶。然后用异丙醇喷淋冲洗硅片并自然风干。
   7. 将硅片在 200 °C 下高温烘烤 1,800 秒。
3. 对主模具进行硅烷化处理：将 20 µL 三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷（参见材料表）滴加在靠近模具的玻璃载片上，在真空干燥器中静置 40 分钟，维持表压为 100 mbar，通过气相沉积完成修饰。

2. 微流控装置的制备

注意：此处描述的制造流程适用于具有单个微流控通道的微流控装置。然而，相同的方法也可用于并行制造具有多个微流控通道的微流控装置。

1. 按10:1的比例将弹性体与其交联剂混合（见材料表），制备PDMS混合物。搅拌混合物直至均匀混合，并因包裹的气泡而变为不透明。
2. 将混合物置于真空干燥器中脱气，使表压达到100 mbar，直至夹带的气泡完全去除，混合物呈现透明状态。脱气所需时间通常为30分钟。
3. 将母模（步骤1）放入细胞培养皿中（见材料表）。在母模上倒入20 g PDMS混合物，以形成最终厚度为5 mm的通道。
4. 在70 °C下烘烤母模2小时。
5. 使用刀片在固化后的PDMS上沿微流控通道边缘约3 mm处进行切割，然后将PDMS微流控通道从母模上剥离下来。
6. 为创建微流控通道的进样口和出样口，使用活检打孔器（直径1.5 mm）在通道两端（三角形顶端，见图1A）打孔。在进样口三角形中心额外打一个孔，以便后续安装压力传感器。
7. 用市售的1%洗涤剂溶液（见材料表）清洗载玻片和微流控通道5分钟，然后用去离子水冲洗。随后，用异丙醇清洗PDMS微流控通道和载玻片，再用去离子水再次冲洗。使用1 bar的压缩空气吹干PDMS微流控通道和载玻片，持续1分钟。
   注意：PDMS的多孔结构必须完全干燥，以确保键合效果。
8. 将载玻片和微流控通道放入等离子清洗机中（见材料表），确保待键合的表面朝上。开启等离子清洗机，以1 SL/h（标准升每小时）的气流速率用空气等离子体处理微流控通道和载玻片1分钟。取出后立即将其相互接触，完成微流控通道与载玻片的键合。
   注意：请勿触碰已处理的表面，以免影响键合效果。当制备包含多个微流控通道的器件时，应同时暴露所有通道，并在一步内完成键合。
9. 将键合好的微流控器件置于80 °C的加热板上，至少放置15分钟。
10. 将微流控器件存放在洁净的细胞培养皿中，直至实验开始。

3. 细菌悬液的制备

1. 实验开始前 20 小时，从冷冻甘油菌种中直接接种 3 mL 营养肉汤第 3 号培养基（见材料表）至 15 mL 培养管中，用于培养 Bacillus subtilis NCIB 3610 菌株。在 30 °C、200 rpm 条件下于摇床培养箱中过夜培养（16 小时）。
2. 实验开始前 4 小时，取 3 µL 过夜培养物加入 3 mL 新鲜培养基（1:1,000 稀释）至 15 mL 培养管中，制备预培养物。在 30 °C、200 rpm 条件下于摇床培养箱中培养 3.5–4 小时，使菌液在 600 nm 处的光密度（OD₆₀₀）达到 0.1。

4. 生物膜生长实验

1. 在实验开始前3小时打开显微镜的培养箱，以确保温度稳定在25 °C。安装注射泵和压力传感器（见材料表）。
2. 将进样和出样管路连接至微流控装置。将一根外径为0.6 mm的针头直接插入进样管路，以固定管路与注射器之间的连接。
3. 将微流控装置、30 mL去离子水和30 mL培养基放入真空干燥器中，脱气至少1小时。然后，缓慢将培养基和去离子水分别吸入两个30 mL注射器中。
   注意：此步骤至关重要，可防止在用培养基冲洗时通道内产生气泡。
4. 将微流控装置安装在显微镜上，并将出样管路置于废液容器中。
   1. 通过微流控管路将装有去离子水的注射器连接至微流控通道，并缓慢注入水，直至水从压力传感器出口流出。用水充满压力传感器，并冲洗连接微流控通道与压力传感器的管路中的所有气泡。使用专用于压力传感器的螺钉封闭压力传感器的出口。
      注意：上述填充程序可确保精确记录微流控通道入口处的压力变化。在进行多通道微流控实验时，应将每个通道连接至独立的注射器，以确保所有通道内的流动条件一致。
5. 用去离子水填充其余的微流控通道。
6. 在培养基注射器上安装一个1.2 µm滤膜（见材料表）。然后取下装有水的注射器，小心地将装有培养基的注射器连接至微流控进样管路。将注射器安装在注射泵上，并以2 mL/h的流速用培养基冲洗通道1小时。
   注意：该滤膜可防止在加样过程中细菌进入注射器。用培养基冲洗微流控通道可去除多孔结构中残留的气泡。
7. 在实验过程中将注射泵设定至所需流速（此处为1 mL/h），并将压力传感器的压力读数归零。
   注意：通过将初始压力读数设为零，仅测量实验期间生物膜发育引起的压力变化。
8. 取1 mL OD₆₀₀为0.1的细菌培养液置于1.5 mL离心管中。将出样管插入离心管，将细菌培养液加载至微流控通道中。等待5分钟以排除管路出口可能存在的气泡后，以1 mL/h的流速回抽150 µL细菌溶液，直至微流控通道完全充满细菌培养液。
9. 小心取下培养基注射器上的滤膜，并将出样管放入废液容器中。让细菌在微流控通道中处于无流动条件下静置3小时，以促进其在多孔介质表面的附着。
   注意：3小时的无流动静置时间是针对本研究所用菌株的附着条件优化的，同时可保证细菌培养处于良好供氧状态。其他细菌菌株可能需要更长或更短的时间。
10. 开始实验时，将注射泵设定至所需流速（此处为1 mL/h）以启动流动，同时以1 Hz频率开始记录压力数据。
11. 在设定的时间间隔、光学配置和放大倍数下采集生物膜生长过程的图像 。
    ​注意：在本研究中，采用明场模式、4倍放大倍数，在多孔介质全区域范围内选取18个位置，每隔6分钟采集一次图像，持续24小时。

5. 图像分析

1. 使用图像分析软件（参见材料表）和拼接算法²⁴，通过拼接18个位置采集的图像序列，重建整个多孔介质。
2. 将拼接后的图像序列保存为一系列独立图像。
   注意：如果文件过大，此时可对图像进行缩放和像素合并，以调整至适合后续处理的合理尺寸。
3. 创建多孔介质中柱体的掩膜，以将其从分析中去除。
4. 通过将各图像除以 t = 0 h 时采集的背景图像（图2A）来去除图像背景，并在适合分割生物膜的阈值下对图像进行二值化处理（图2B）。
5. 通过计算生物膜覆盖面积（归属于生物膜的像素数量）占多孔区域孔隙面积的比例，计算生物膜的饱和度（图3）。

结果

本研究采用一种具有三个不同孔径的平行微流控通道的微流控装置（图1），以系统研究多孔介质中的生物膜形成过程。通过明场显微镜对生物膜的形成过程进行可视化观察。细菌细胞和生物膜在图像中表现为较暗的像素（图2）。此外，观察到逐渐堵塞的过程；在持续24小时的实验中，最初随机生长的生物膜几乎定植了整个多孔介质。

在流速 Q = 1 mL/h（对应初始平均流体流速为 0.96 mm/s）条件下随时间生长的生物膜表面覆盖率，针对三种不同孔径（75 µm、150 µm 和 300 µm）进行了量化分析（图3，黑线）。结果表明，以表面覆盖率作为生物堵塞程度的代理指标，在 t = 20 h 时，最小孔径（75 µm）下的表面覆盖率比最大孔径（300 µm）下快约 10%。随后，将表面覆盖率与生物膜引起的压力建立关联（图3，蓝线）。较...

讨论

结合压力传感器的微流控多孔介质模拟装置为研究多孔介质中生物膜的发育提供了合适的工具。微流控多孔介质设计具有高度灵活性，特别是柱状结构的排列方式，包括直径、不规则形状和孔隙尺寸，可用来研究多种几何构型。这些几何构型涵盖从单个孔隙到高度复杂、无序排列的障碍物，能够模拟不同的天然（如土壤）和工业（如膜和滤器）多孔介质。在本微流控平台中，通过规则排列的圆柱形柱体构建了三种多孔介质几何结构（孔隙尺寸分别为75 µm、150 µm和300 µm），且每次实验可选择不同的流体流速。该平台也可轻松改造，用于在固定水头压力而非设定流速条件下研究生物堵塞。在此情况下，流量控制装置应采用带有培养基储液器的压力控制器，而非注射泵。由于生物堵塞引起的流速变化，可通过流量传感器随时间测量流出液来实时监测。

进行具有生物膜生长的微流控实验时，必须考虑几个关键点。为避免实验过程中微流控通道内形成气泡，需对微流控通道和培养基进行脱气处理（步骤4.3）。接下来，必须快速但小心地将脱气后的培养基注入微流控通道，以实现通道完全饱和且无任何气泡。若多孔介质中滞留了气泡，可通过短暂提高流速冲洗微流控通道来去除气泡。第二个关键...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Acrodisc 25 mm 注射器滤器，1.2 µm Versapor 膜	Pall Corporation	PN4190	1.2 µm 滤器
BD 10 mL 注射器（鲁尔锁）	BD	300912	用于以去离子水填充通道
培养箱	Life Imaging Services		用于在生物膜生长实验期间维持稳定温度
细胞密度计 CO8000	WPA biowave		OD 测定仪
离心管	Eppendorf	30120086	1.5 mL
CETONI Base 120	CETONI GmbH		注射泵
CorelCAD	CorelDRAW		用于设计微流控通道几何结构的软件
培养管（14 mL，无菌）	greiner bio-one		培养管
干燥烘箱，VENTI-Line	VWR		用于固化 PDMS
Handy	Migros		洗涤剂溶液
带温度控制的加热板	VRW		用于等离子处理后固化 PDMS-玻璃键合
ImageJ	FIJI		图像分析软件
Innova 42 Inc 摇床（New Brunswick）	Eppendorf		培养箱
异丙醇（> 99.8%）	Sigma Aldrich	67-63-0
Masterflex 转移软管	Masterflex	HV-06419-05	内径 0.020''，外径 0.06''
载玻片，平片，75 x 60 mm	Corning	2947-75X50	玻璃载玻片
微流控压力传感器（1 bar）	Elveflow		压力传感器
Miltex 活检打孔器，直径 1.5 mm	Integra		用于制作微流控通道的进样口和出样口孔洞
mrDev600 显影液	Microresist
Nikon Eclipse Ti2	Nikon Instruments		显微镜
营养肉汤 n°3	Sigma Aldrich
Omnifix 带鲁尔锁的注射器	B.Braun		不同体积的注射器
等离子腔体 Zepto	Diener Electronic	ZEPTO-1	用于将 PDMS 与玻璃载玻片进行等离子键合
精密擦拭纸（Kimtech Science）	Kimberly Clark	KCP-7552	用于干燥玻璃载玻片
天平	VWR-CH	611-2605	用于称量弹性体与交联剂的比例
硅晶圆（10 cm）	Silicon Materials Inc.		N//Phos <100> 1-10 Ω cm
匀胶机，Spin 模块 SM150	Sawatec
SU8 3050 光刻胶	Kayakuam
Süss MA6 掩模对准器	SUSS MicroTec Group		用于对准铬-玻璃掩模
Sylgard 184	Dow Corning		硅酮弹性体套件；固化剂
Techni Etch Cr01	Technic		Technic
组织培养皿 150	TPP	93150
三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷	Sigma Aldrich	Sigma Aldrich	用于硅烷化硅晶圆
Veeco Dektak 6 M	Veeco		轮廓仪