一种用于研究多孔介质中生物堵塞的微流控平台

摘要

本方案描述了一种微流控平台，通过结合高分辨率显微成像与同步压力差测量，用于研究生物膜在准-二维多孔介质中的发育过程。该平台可量化多孔介质中孔隙尺寸和流体流速对生物堵塞的影响。

摘要

细菌生物膜存在于多种环境和工业多孔介质中，包括土壤和过滤膜。在特定的流动条件下，生物膜会生长并堵塞孔隙，从而改变局部流体的流动路径。生物膜堵塞孔隙的能力，即所谓的生物堵塞（bioclogging），可能显著影响多孔介质的局部渗透性，导致系统内压力积聚，并影响物质的流动。为了理解在不同物理条件（例如，不同流速和孔径大小）下生物膜生长与流体流动之间的相互作用，本研究开发了一种微流控平台，可在外部施加且受控的物理条件下，利用显微镜观察生物膜的发育过程。同时，可通过压力传感器测量生物膜引起的多孔介质内压力积聚，并进一步与生物膜的表面覆盖率进行关联分析。该平台为系统性研究流动条件下多孔介质中生物膜引起的生物堵塞提供了基础，且可进一步调整用于研究环境分离菌株或多物种生物膜。

引言

生物膜——嵌入由胞外多聚物（EPS）构成的自分泌基质中的细菌群落——广泛存在于自然多孔介质中，如土壤和含水层¹，以及在技术与医学应用中，例如生物修复²、水过滤³和医疗器械⁴。生物膜基质主要由多糖、蛋白质纤维和胞外DNA^5,6组成，其组成高度依赖于微生物种类、营养物质的可利用性以及环境条件⁷。然而，基质的功能具有普遍性：它构成生物膜结构的支架，保护微生物群落免受机械和化学胁迫，并在很大程度上决定了生物膜的流变特性⁵。

在多孔介质中，生物膜的生长可堵塞孔隙，导致所谓的生物堵塞。生物膜的发育受流体流动和多孔介质孔隙尺寸的控制，其中孔隙尺寸定义为两个支柱之间的间距。^8,9,10孔径大小和流体流动共同控制着营养物质的传输以及局部剪切力。反过来，生长的生物膜会堵塞孔隙，从而影响流体的速度分布。

方案

1. 硅片制备

1. 使用计算机辅助设计（CAD；参见材料表）软件设计微流控通道的几何结构，并将其打印到透明胶片上以制作光掩模（图1A）。
2. 通过软光刻技术（在洁净室条件下）按照以下步骤制备主模具。
   1. 将硅片在 200 °C 下烘烤 2 小时。
   2. 将硅片置于匀胶机中心，并在其表面倒入 SU8 3050 光刻胶（参见材料表）。以 10 秒/100 转的升速时间，于 1,700 rpm 转速下旋涂 40 秒。
      注：旋涂参数设定旨在使 SU8 3050 达到目标厚度 100 µm。
   3. 旋涂完成后，在 65 °C 下预烘 600 秒，随后在 95 °C 下烘烤 2,700 秒。让硅片在室温下冷却过夜。
      注：过夜冷却有助于增强 SU8 与硅片之间的附着力。
   4. 将光掩模（步骤 1.1）放置于硅片上，并用波长为 350 nm、曝光能量为 250 mJ/cm² 的紫外光进行曝光。
   5. 曝光后，将已曝光的基底在 65 °C 下烘烤 60 秒，随后在 95 °C 下烘烤 300 秒。
   6. 通过将硅片浸入盛有 mrDev600 显影液（参见材料表）的烧杯中....

结果

本研究采用一种具有三个不同孔径的平行微流控通道的微流控装置（图1），以系统研究多孔介质中的生物膜形成过程。通过明场显微镜对生物膜的形成过程进行可视化观察。细菌细胞和生物膜在图像中表现为较暗的像素（图2）。此外，观察到逐渐堵塞的过程；在持续24小时的实验中，最初随机生长的生物膜几乎定植了整个多孔介质。

在流速 Q = 1 mL/h（对应初始平均流体流速为 0.96 mm/s）条件下，随时间生长的生物膜表面覆盖率针对三种不同孔径（75 µm、150 µm 和 300 µm）进行了量化分析（图3，黑色曲线）。结果表明，以表面覆盖率作为生物堵塞程度的代理指标，在 t = 20 h 时，最小孔径（75 µm）下的表面覆盖率比最大孔径（300 µm）下快约 10%。随后，将表面覆盖率与生物膜引起的压力建立关联（图3，蓝色曲.......

讨论

结合压力传感器的微流控多孔介质模拟装置为研究多孔介质中生物膜的发育提供了合适的工具。微流控多孔介质设计具有高度灵活性，特别是柱状结构的排列方式，包括直径、不规则形状和孔隙尺寸，可用来研究多种几何构型。这些几何构型涵盖从单个孔隙到高度复杂、无序排列的障碍物，能够模拟不同的天然（如土壤）和工业（如膜和滤器）多孔介质。在本微流控平台中，通过规则排列的圆柱形柱体构建了三种多孔介质几何结构（孔隙尺寸分别为75 µm、150 µm和300 µm），且每次实验可选择不同的流体流速。该平台也可轻松改造，用于在固定水头压力而非设定流速条件下研究生物堵塞。在此情况下，流量控制装置应采用带有培养基储液器的压力控制器，而非注射泵。由于生物堵塞引起的流速变化，可通过流量传感器随时间测量流出液来实时监测。

进行具有生物膜生长的微流控实验时，必须考虑几个关键点。为避免实验过程中微流控通道内形成气泡，需对微流控通道和培养基进行脱气处理（步骤4.3）。接下来，必须快速但小心地将脱气后的培养基注入微流控通道，以实现通道完全饱和且无任何气泡。若多孔介质中滞留了气泡，可通过短暂提高流速冲洗微流控通道来去除气泡。第二个关键.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Acrodisc 25 mm 注射器滤器，1.2 µm Versapor 膜	Pall Corporation	PN4190	1.2 µm 滤器
BD 10 mL 注射器（鲁尔锁）	BD	300912	用于以去离子水填充通道
培养箱	Life Imaging Services		用于在生物膜生长实验期间维持稳定温度
细胞密度计 CO8000	WPA biowave		OD 测定仪
离心管	Eppendorf	30120086	1.5 mL
CETONI Base 120	CETONI GmbH		注射泵
CorelCAD	CorelDRAW		用于设计微流控通道几何结构的软件
培养管（14 mL，无菌）	greiner bio-one		培养管
干燥烘箱，VENTI-Line	VWR		用于固化 PDMS
Handy	Migros		洗涤剂溶液
带温度控制的加热板	VRW		用于等离子处理后固化 PDMS-玻璃键合
ImageJ	FIJI		图像分析软件
Innova 42 Inc 摇床（New Brunswick）	Eppendorf		培养箱
异丙醇（> 99.8%）	Sigma Aldrich	67-63-0
Masterflex 转移软管	Masterflex	HV-06419-05	内径 0.020''，外径 0.06''
载玻片，平片，75 x 60 mm	Corning	2947-75X50	玻璃载玻片
微流控压力传感器（1 bar）	Elveflow		压力传感器
Miltex 活检打孔器，直径 1.5 mm	Integra		用于制作微流控通道的进样口和出样口孔洞
mrDev600 显影液	Microresist
Nikon Eclipse Ti2	Nikon Instruments		显微镜
营养肉汤 n°3	Sigma Aldrich
Omnifix 带鲁尔锁的注射器	B.Braun		不同体积的注射器
等离子腔体 Zepto	Diener Electronic	ZEPTO-1	用于将 PDMS 与玻璃载玻片进行等离子键合
精密擦拭纸（Kimtech Science）	Kimberly Clark	KCP-7552	用于干燥玻璃载玻片
天平	VWR-CH	611-2605	用于称量弹性体与交联剂的比例
硅晶圆（10 cm）	Silicon Materials Inc.		N//Phos <100> 1-10 Ω cm
匀胶机，Spin 模块 SM150	Sawatec
SU8 3050 光刻胶	Kayakuam
Süss MA6 掩模对准器	SUSS MicroTec Group		用于对准铬-玻璃掩模
Sylgard 184	Dow Corning		硅酮弹性体套件；固化剂
Techni Etch Cr01	Technic		Technic
组织培养皿 150	TPP	93150
三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷	Sigma Aldrich	Sigma Aldrich	用于硅烷化硅晶圆
Veeco Dektak 6 M	Veeco		轮廓仪