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人外周血CD14+单核细胞向功能性破骨细胞的分化

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DOI：

10.3791/64698

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2023年1月27日

 ,  ,  , 
1School of Infection & Immunity, University of Glasgow

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

破骨细胞是体内关键的骨吸收细胞。本方案描述了一种可靠的破骨细胞 体外 从人外周血单核细胞分化破骨细胞。该方法可作为重要工具，进一步理解破骨细胞在稳态及疾病中的生物学特性。

摘要

破骨细胞（OCs）是负责骨吸收的细胞，在骨骼发育和成人骨重塑过程中发挥关键作用。多种骨疾病由破骨细胞的分化和活化增强引起，因此抑制这一病理过程是重要的治疗原则。破骨细胞由髓系前体细胞分化而来，其分化过程主要依赖于两种关键因子：巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子κB受体活化因子配体（RANKL）。人外周血循环中的CD14+ 单核细胞在体外分化为破骨细胞（OCs）的现象早已为人所知。然而，RANKL的刺激时间和浓度会影响其分化效率。事实上，人破骨细胞生成的实验方案 体外 已有相关描述，但这些方法往往导致分化效率低下且耗时较长。本文提供了一种高效且标准化的方案，可及时获得功能活跃的成熟人类OCs。CD14+ 从人外周血单个核细胞（PBMCs）中富集单核细胞，并用M-CSF进行预处理以上调RANK表达。随后通过RANKL刺激，以剂量和时间依赖的方式诱导破骨细胞（OCs）的生成。通过抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色结合光学显微镜分析对OCs进行鉴定与定量。利用细胞核和F-actin的免疫荧光染色识别功能活跃的OCs。此外，OSCAR+CD14− 成熟的破骨细胞通过流式细胞术分选进一步富集，并通过矿质（或牙本质/骨）吸收实验和肌动蛋白环形成来定量其功能。最后，使用已知的破骨细胞抑制剂鱼藤酮处理成熟破骨细胞，证明三磷酸腺苷（ATP）的生成对肌动蛋白环完整性和破骨细胞功能至关重要。综上所述，本研究建立了一种高效诱导大量破骨细胞分化的稳定实验方法，结合肌动蛋白环染色与ATP检测 提供了一种有用的 体外 用于评估成骨细胞功能并筛选可调节分化过程的新型治疗化合物的模型。

引言

破骨细胞（OC）是来源于造血系的多核巨细胞，具有独特的骨吸收能力，负责骨骼的发育及持续性重塑1,2。在骨骼发育阶段，OC 和组织驻留型巨噬细胞来源于红系-髓系前体细胞，并定植于骨微环境及器官组织中。在生理条件下，红系-髓系前体细胞对正常的骨骼发育和牙齿萌出至关重要，而循环血液中的单核细胞进入骨微环境后，可维持出生后 OC、骨量及骨髓腔的稳态3。在病理条件下，单核细胞被募集至活动性炎症部位，可能参与病理性骨破坏过程4,5。

多种类型的关节炎患者会出现关节炎症，导致破骨细胞（OCs）引起的进行性关节破坏6。例如，在类风湿关节炎（RA）中，过度活化的破骨细胞是病理性骨侵蚀和关节破坏的根源7,8，而目前的治疗方法通常无法改善或阻止骨损伤9,10,11。已有研究报道，RA患者的循环单核细胞在群体分布、转录组和表观遗传特征方面均存在异常12,13,14。此外，有研究指出，单核细胞对炎症刺激的反应异常会影响活动期RA患者的破骨细胞生成15,16,17。

破骨细胞（OC）的分化是一个复杂的多步骤过程，包括髓系前体细胞定向分化为破骨细胞前体。在破骨细胞形成过程中，破骨细胞通过细胞间融合、不完全胞质分裂以及一种被称为裂变与融合的核再循环过程，逐渐发育为巨大的多核巨细胞。18,19,20. 破骨细胞分化能力 体外 极大地推动了对骨生物学的理解21破骨细胞（OCs）在巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子κB受体活化因子配体（RANKL）的作用下由前体细胞分化而来。其中，RANKL对破骨细胞的正常发育和功能至关重要。 体外 和 体内，即使在炎症条件下6,22,23RANKL由成骨细胞和骨细胞呈递，同时也由炎症性类风湿关节炎滑膜中的活化T细胞和成纤维细胞呈递2,24,25在OC分化过程中，暴露于M-CSF的单核细胞会使其细胞膜上核因子κB受体活化因子（RANK）的表达上调；随后在RANKL的刺激下，进一步分化为抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）阳性的单核前体破骨细胞，继而形成多核破骨细胞。15,26破骨细胞产生多种酶，其中最主要的是抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP），该酶能够降解骨内的磷酸化蛋白。27OC分化的调节因子和标志物是破骨细胞相关受体（OSCAR）。该受体在向破骨细胞谱系分化的前体细胞中早期上调。28成熟的大型多核破骨细胞可通过形成由环绕皱褶缘的肌动蛋白环构成的广阔封闭区，降解（吸收）骨骼基质。21,29,30破骨细胞的骨吸收能力依赖于细胞骨架的重组，以及随之发生的极化和皱褶缘（ruffled border）的形成。皱褶缘周围环绕着一个富含F-actin的大型环状结构，即肌动蛋白环（actin ring），也称为封闭区（sealing zone）。肌动蛋白环的完整性对于破骨细胞执行骨吸收功能至关重要 体外 和 体内，且皱褶缘形成缺陷与空泡型腺苷三磷酸酶（V-ATPase）表达水平降低相关31,32,33此外，破骨细胞是富含线粒体的细胞，三磷酸腺苷（ATP）与位于皱褶缘处破骨细胞中的线粒体样结构相关联。31,32,33鱼藤酮是一种强效的线粒体复合物I抑制剂，可影响ATP的生成。研究表明，鱼藤酮还可抑制成骨细胞的分化与功能34.

本方案描述了一种高效且经过优化的方法 体外 破骨细胞生成 来自人外周血样本。在人外周血中，CD14+ 单核细胞是破骨细胞的主要来源15,35,36在此方案中，M-CSF 和 RANKL 的暴露时间和浓度已针对最佳成骨细胞生成进行了优化。首先通过分离全血中的红细胞和粒细胞，将单核细胞分离出来 密度梯度；随后对CD14进行富集+ 使用磁珠阳性选择法分离单核细胞。分离的CD14+ 单核细胞随后与M-CSF共孵育过夜。这会促使单核细胞上调RANK的表达15,26随后加入RANKL可诱导破骨细胞生成及多核化，且呈时间依赖性。具有活性并处于吸收状态的破骨细胞在细胞膜边缘呈现出特征性的F-actin环状分布。30,32 以及TRAP染色。通过定量TRAP来分析成熟的破骨细胞+ 多核（超过三个细胞核）细胞。成熟破骨细胞的功能能力可通过其骨吸收活性、肌动蛋白环完整性以及ATP生成水平进行评估。此外，已分化的CD14− OSCAR+ OCs 可被富集并用于评估特定化合物对 OC 功能的影响 通过 矿质（或牙本质）吸收及F-肌动蛋白的组织结构。此外，本研究采用已知的破骨细胞抑制剂鱼藤酮作为影响破骨细胞功能的代表性化合物。在鱼藤酮作用下，破骨细胞吸收活性降低，伴随三磷酸腺苷（ATP）生成减少及肌动蛋白环断裂。综上所述，本实验方案建立了一种可靠的检测方法，可作为研究破骨细胞分化与功能多个生物学方面的参考方法 体外

该方法可用于评估（1）循环单核细胞在健康和疾病状态下分化为破骨细胞（OC）的潜力，以及（2）候选治疗药物对OC分化和功能的影响。这一可靠的破骨细胞生成实验方案，能够确定靶向骨组织的治疗手段在前体细胞向OC分化及成熟OC功能两方面的作用效果及其作用机制。

方案

来自苏格兰国家血液 transfusion 服务（爱丁堡）的血沉棕黄层以及来自 NHS 血液与移植中心（纽卡斯尔）的白细胞锥形管，均以完全匿名（不可识别）的形式提供给格拉斯哥大学的研究人员，供血者均为已签署完全知情同意书的 NHS 献血者。这些血沉棕黄层和白细胞锥形管血液成分来源于在苏格兰或英格兰 NHS 献血中心进行的标准 NHS 献血。献血者在献血时已明确同意，将其血液中未用于标准 NHS 临床用途的多余部分用于经批准的医学研究项目。NHS 研究伦理委员会的伦理审批文件以及献血者签署的知情同意书均由 NHS 献血服务机构保存。获取并使用这些已获同意的血液捐赠样本开展经批准的医学研究项目，已通过苏格兰国家血液 transfusion 服务和英格兰 NHS 血液与移植中心的标准内部申请及评审流程获得许可。因此，使用这些血液成分进行经批准的医学研究项目无需再次获得 NHS 研究伦理委员会或格拉斯哥大学内部伦理委员会的额外审批。

1. 开始前的一般注意事项

  1. 处理血液相关操作时应谨慎进行，注意样本中可能存在的各种传染性病原体所带来的潜在危害。
  2. 所有操作均应在生物安全实验室中谨慎进行，并在无菌条件下佩戴手套和实验服。
  3. 按照当地指南进行生物安全废弃物的处置。
  4. 根据当地主管部门的规定，在样本采集前须获得适当的知情同意和伦理审批。
  5. 通常情况下，1 mL 新鲜血液可获得约 100 万 PBMCs，其中 CD14+ 单核细胞约占 PBMCs 的 10%-30%。相比之下，10 mL 白细胞富集层可含有 5 x 108-15 x 108 个 PBMCs。有关 PBMC 分离的更多细节，请参考先前的实验方案37。

2. 从全血中分离外周血单个核细胞（PBMCs）

  1. 从健康供体采集所需体积的新鲜血液，收集至含锂肝素的采血管中。
    ​注意：也可使用含其他适当抗凝剂的采血管（例如，钠肝素管）。如需更高细胞数量，可使用白细胞锥体或血沉棕黄层。
  2. 为分离外周血单个核细胞（PBMCs），将血液转移至新的50 mL离心管中，并按1:1（新鲜血液）或1:3（白细胞锥体/血沉棕黄层）的比例，用无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）进行稀释。
  3. 通过反复倒置，轻柔混匀细胞数次。
  4. 准备含3 mL密度梯度介质的15 mL离心管。将8–10 mL稀释后的血液缓慢铺加在密度梯度介质上方，于室温（RT）以400 × g 离心30分钟，不启用刹车。
    注意：应小心将血液加至密度梯度介质上层，避免混合。混合可能导致PBMCs丢失。
  5. 用巴斯德吸管小心弃去上层液体（含血浆），收集下方含有PBMCs的界面层（白色环状结构），并将该层转移至新的50 mL离心管中。
  6. 用无菌1×PBS将细胞悬浮至50 mL，于室温以300 × g 离心10分钟（启用全刹车），以洗去残留的密度梯度介质。
  7. 为去除残留血小板，重复洗涤步骤，但离心条件改为室温下200 × g 离心10分钟，不启用刹车。
  8. 可选步骤：为去除残留红细胞，将红细胞裂解缓冲液（10×，材料表）用蒸馏水按1:10稀释，取3 mL稀释缓冲液加入细胞沉淀中。混匀后室温孵育3分钟。用最多50 mL的1×PBS洗涤细胞沉淀，并于室温以300 × g 离心10分钟（启用全刹车）。
  9. 将分离纯化的PBMCs重悬于20 mL 1×PBS中，使用血细胞计数板或其他标准方法进行细胞计数。
    注意：应根据所用细胞密度及计数设备，相应调整细胞稀释与计数方法。

3. 从PBMCs中富集CD14+单核细胞

  1. 分离CD14+ 从PBMCs中分离人CD14单核细胞+ 根据制造商方案使用筛选试剂盒（材料表).
    注意：经典CD14+CD16− 单核细胞是破骨细胞前体的主要来源35；也可考虑其他纯化方法。
  2. 转移 1 × 107 将PBMCs转入合适的聚苯乙烯圆底管（即适配筛选试剂盒磁铁的管子），并在300 x g条件下离心收集细胞沉淀 g 5 分钟。
  3. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于细胞分离缓冲液（PBS，2% 胎牛血清 [FBS]，1 mM 乙二胺四乙酸 [EDTA]）中，调整终浓度为 1 x 108 细胞/mL，并孵育 10 µL 每份抗体混合物 100 µL 盖上盖子孵育10分钟。
    注意：细胞重悬于 1 x 108 细胞/mL；相应调整体积。
  4. 孵育后，加入 10 µL 每磁性纳米颗粒珠 100 µL，盖上盖子孵育3分钟。
    注意：调整抗体混合液和磁珠的体积，以获得指定浓度 10 µL/mL.
  5. 用细胞分离缓冲液将体积补至2.5 mL，将试管放入磁架（不加盖），孵育3 min。试管仍置于磁架中时，通过一次连续倒置操作弃去阴性细胞群体。
    注意：如果使用 >2 x 108 PBMC 和较大的磁铁，根据制造商说明书，用细胞分离缓冲液补至 5 mL 或 10 mL。
  6. 将试管从磁铁上取下，洗涤富集的 CD14+ 将单核细胞与磁珠通过在2.5 mL细胞分离缓冲液中重悬而结合。如前所述，在磁铁中孵育3分钟，弃去阴性组分，并重复一次。
  7. 将所有收集的细胞在 300 x g 5分钟，弃去上清液，将细胞重悬于5 mL α-最小必需培养基（α-MEM； 材料表添加1% L-谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素（完全α-MEM）和10%胎牛血清（FBS）。
    注意：富集后的纯度检测 通过 建议使用流式细胞术，预期纯度应达到≥96%。额外的洗涤步骤（步骤3.6）可提高纯度。

4. 破骨细胞分化 体外

  1. 使用血细胞计数板对富集的 CD14+ 单核细胞进行计数。
  2. 在 300 × g 条件下离心 5 分钟，将细胞沉淀后重悬于完全 α-MEM 培养基中，调整细胞密度为 1 × 106 个细胞/mL，培养基中添加 10% 胎牛血清（FBS）。
  3. 为诱导破骨细胞（OC）分化，在细胞悬液中加入 M-CSF，使其终浓度为 25 ng/mL。
    注意：对于 1 mL 细胞悬液，从 100 µg/mL 的储存液中加入 0.25 µL M-CSF。
  4. 使用移液器充分吹打混匀细胞悬液，随后每孔加入 100 µL 至平底 96 孔板中，使最终细胞密度为每孔 1 × 105 个细胞。
  5. 在接种了细胞的孔周围各孔中加入 200 µL/孔的无菌蒸馏水，以防止培养体系中培养基蒸发及边缘效应。
  6. 将细胞置于 37 °C、5% CO2 条件下培养过夜，时间约为 18–20 小时。
  7. 过夜培养后，使用 P200 移液器小心吸除每孔一半的培养基（50 µL/孔），避免接触孔底，随后更换为新鲜的预温完全 α-MEM 培养基，其中含 10% FBS、25 ng/mL M-CSF 和 50 ng/mL RANKL，使 M-CSF 的终浓度为 25 ng/mL。
    注意：对于 1 mL 培养基，从 100 µg/mL 的储存液中加入 0.25 µL M-CSF 和 0.5 µL RANKL。
  8. 每 3 天更换一次培养基，持续培养 7–14 天以诱导细胞分化为破骨细胞（OC）（图 1）。
    注意：在整个培养过程中保持 M-CSF 和 RANKL 的浓度恒定。

单核细胞分离示意图：血液离心、CD14+ 分离、破骨细胞成熟过程。
图1：破骨细胞（OC）分化流程图。 从外周血单个核细胞（PBMCs）中分离CD14+单核细胞，并在M-CSF和RANKL存在下分化为成熟破骨细胞的示意图，过程持续7-14天。RT = 室温。图像由BioRender.com制作。 请点击此处查看此图的放大版本。

5. 破骨细胞的TRAP染色

  1. 小心吸除培养基，每孔加入100 µL预先配制的固定液固定已分化的贴壁破骨细胞，孵育1分钟。操作时避免触碰孔底，以防刮伤贴壁细胞。
    注意：固定液的配制方法如下：取TRAP染色试剂盒中的柠檬酸盐溶液12.5 mL、丙酮32.5 mL和37%甲醛5 mL混合。
  2. 用300 µL无菌蒸馏水洗涤各孔三次，每次洗涤后轻拍培养板使其干燥。
  3. 根据生产商说明书（材料表）配制染色液；取5 µL快红（Fast Garnet）和5 µL亚硝酸钠配制快红溶液，颠倒混匀，室温孵育3分钟。取900 µL无菌蒸馏水、10 µL萘酚（naphthol）、40 µL醋酸盐溶液、50 µL酒石酸盐溶液和10 µL快红溶液混合，配制成1 mL染色液。
  4. 每孔加入100 µL新鲜配制的染色液，将培养板置于37 °C避光环境中孵育20分钟。
  5. 孵育结束后，通过倒置去除染色液，再用每孔300 µL蒸馏水洗涤三次。
  6. 将培养板轻拍于纸巾上以去除多余水分，敞开放置并避光，过夜自然干燥。
    注意：干燥后的培养板可保存长达6个月。有时残留的缓冲液可能促进霉菌生长，在显微镜下可见；此时可用蒸馏水冲洗受污染的孔，再次风干即可去除。
  7. 使用明场显微镜结合拼图功能，在10x或20x放大倍数下拍摄整个孔表面的图像。
  8. 使用带有细胞计数插件的图像分析软件，手动计数被染成紫色且含有三个以上细胞核的TRAP+破骨细胞。
    ​注意：每孔TRAP+破骨细胞的数量因供体而异，通常在约200–1,600个/孔之间，平均约为1,000个/孔。此外，数据分析时应测定三个不同孔中的破骨细胞数量（技术重复），并针对每种实验条件和每个生物学重复样本计算平均值。

6. 骨吸收实验

  1. 将 freshly enriched CD14+ 单核细胞以每孔 1 × 105 个细胞的密度接种于涂有磷酸钙的 96 孔骨化分析板中，并按照步骤 4.1–4.8 所述方法诱导破骨细胞分化 7–14 天，每 3 天更换一次培养基。
    注意：可使用牙本质/象牙质或牛皮质骨切片替代骨化分析板。若使用此类材料，由于底物更难被吸收，总培养时间应延长至 14–21 天。
  2. 在实验终点，小心移除培养基，避免触碰孔底，使用 10% 次氯酸钠溶液裂解细胞，随后用蒸馏水洗涤孔板三次。
  3. 使用明场显微镜扫描干燥后的孔板，并利用图像分析软件对获得的骨吸收陷窝图像进行分析和定量。

7. 肌动蛋白环荧光染色

  1. 将分离的 CD14+ 单核细胞以每孔 100 µL 的体积接种于 18 孔板腔室载玻片中，细胞密度为每孔 1 × 105 个细胞。在 M-CSF 和 RANKL 存在下诱导破骨细胞分化，方法如前所述（步骤 4.1–4.8），包括每 3 天更换一次培养基。
  2. 在实验终点时，轻轻吸去培养基，每孔用 200 µL 预热至 37°C、pH 7.4 的 PBS 洗涤两次。各步骤之间切勿让孔内干燥。
  3. 每孔加入 100 µL PBS 配制的 4% 甲醛溶液固定样本，在室温下于旋转摇床上轻柔振荡孵育 10 分钟。
    注意：甲醇可能在固定过程中破坏肌动蛋白结构，因此应避免使用含甲醇的固定剂。推荐使用无甲醇的甲醛固定液。本实验步骤中所用旋转摇床的功率设定为 10 档中的 3 档。
  4. 每孔用 200 µL PBS 洗涤两次，每孔加入 100 µL 用 PBS 稀释的 0.1% Triton X-100 溶液进行细胞通透处理，在室温下于旋转摇床上轻柔振荡孵育 10 分钟。
  5. 每孔用 200 µL PBS 洗涤两次。为阻断非特异性结合并增强信号，每孔加入 100 µL 用 2% 牛血清白蛋白（BSA）/PBS 溶液配制的封闭液，在室温下于旋转摇床上轻柔振荡孵育 20 分钟。
  6. 吸去封闭液，每孔加入 100 µL 用 2% BSA/PBS 溶液稀释的荧光标记鬼笔环肽（phalloidin）溶液，在室温下于旋转摇床上轻柔振荡避光孵育 20 分钟。
    注意：鬼笔环肽染料的浓度应根据生产商的建议进行调整。
  7. 每孔用 200 µL PBS 洗涤两次，每孔加入含 300 nM DAPI 的 PBS 溶液 100 µL 对细胞核进行染色，在室温下于旋转摇床上轻柔振荡避光孵育 10–15 分钟。
    注意：DAPI 用蒸馏水配制成 14.3 mM（5 mg/mL）的母液，再将母液稀释至终浓度为 300 µM，最后将 300 µM 的 DAPI 溶液进一步用 PBS 稀释至终浓度为 300 nM。
  8. 孵育 10–15 分钟后，吸去 DAPI 溶液，每孔替换为 100 µL PBS。
    注意：根据所选腔室载玻片的类型，可选择加入适量 PBS（18 孔腔室载玻片每孔 100 µL）保存样本，或使用盖玻片和适当的封片剂封片。腔室载玻片可在冰箱中保存最多 1 周。对于 18 孔腔室载玻片，染色时使用 50–100 µL 染色体积，洗涤时使用 200–300 µL。其他规格腔室载玻片应按比例调整体积。为防止蒸发，在孵育期间应将盖玻片置于带盖容器内。建议使用旋转摇床，但非必需。
  9. 使用合适的免疫荧光或共聚焦显微镜，以 4× 至 40× 的放大倍数观察染色结果。

8. 成熟破骨细胞及破骨细胞前体的富集 通过 流式细胞术分选

  1. 将 freshly enriched CD14+ 单核细胞重悬于 1 x 106 个细胞/mL，加入 M-CSF 和 RANKL，按照上述方法（步骤 4.1–4.8）将其分化为成熟的破骨细胞（OCs）。
    注意：当从 96 孔板扩增至更大规格的培养板时，请参照表 1；这些体积基于 1 x 106 个细胞/mL 的溶液计算，可提供细胞-细胞融合的最佳密度。
  2. 第 7 天，用预热的 PBS 洗涤孔板一次，加入 50 µL 至 1 mL（根据所用培养板规格确定体积）的 accutase。在 37 ˚C、5% CO2 条件下孵育 20 分钟。
  3. 孵育后，在光学显微镜下观察孔板，确认细胞是否已脱落。进一步通过轻敲孔板各侧并用移液器反复吹打使细胞完全脱落。
  4. 将细胞悬液收集至 15 mL 圆锥形离心管中。用预热的 PBS（不含 Ca2+，不含 Mg2+）洗涤孔板，并将洗涤液合并至细胞悬液中。重复步骤 8.2–8.3 一次或两次，直至大部分细胞脱落。
    注意：在进行流式细胞术表面染色前推荐使用的 accutase 方法无法有效脱落非常大的破骨细胞。细胞回收率约为 50%–70%。
  5. 在 300 x g 条件下离心 5 分钟，将细胞沉淀重悬于 1 mL PBS 中，并通过台盼蓝排斥法计数细胞。
  6. 将细胞重悬至 1 x 106 个细胞/mL，取出对应 1 x 105 个细胞的 100 µL，转移至新的聚丙烯试管中。加入 200 µL 细胞分选缓冲液，置于冰上作为未染色对照。
  7. 用活/死细胞染料（按 1:750 稀释）对剩余细胞在室温避光条件下染色 10 分钟。
    注意：为避免背景染色过高，活/死细胞染色必须在不含 FBS 的条件下进行。
  8. 用预热的细胞分选缓冲液（1x PBS，不含 Ca2+，不含 Mg2+，含 1% FBS 和 5 mM EDTA）补满含有活/死染色细胞悬液的 15 mL 收集管，于 300 x g 离心 5 分钟以收集细胞沉淀。
    注意：分选缓冲液中建议使用高浓度 EDTA 和低浓度 FBS，以防止细胞聚集成团。
  9. 取出相当于 1 x 105 个细胞的体积，转移至另一新的聚丙烯试管中作为 OSCAR 同型对照。将所有剩余细胞转移至另一个聚丙烯试管中用于染色和细胞分选。
    注意：使用聚丙烯试管进行分选，因为细胞在聚丙烯管中的黏附性低于聚苯乙烯管。
  10. 在 400 x g 条件下离心 5 分钟以收集细胞沉淀，倒置去除多余上清液。
  11. 将细胞沉淀重悬于根据表 2 配制的抗体主混合液中。OSCAR 同型对照管使用 CD14 抗体和 OSCAR 同型对照抗体替代 OSCAR 抗体进行染色。
  12. 在 4 ˚C 避光条件下孵育 30 分钟。
  13. 30 分钟后，加入五倍体积的细胞分选缓冲液洗涤细胞，在 4 ˚C、400 x g 条件下离心 5 分钟。
  14. 将细胞重悬于 300–1,000 µL 冷的细胞分选缓冲液中，使用配备 100 μm 喷嘴的流式细胞分选仪进行分选。
    注意：破骨细胞具有很强的黏附性，因此在分选前必须通过无菌 70 μm 滤膜过滤。
  15. 根据 CD14−OSCAR+ 标记圈选破骨细胞（OCs）和前体破骨细胞（pre-OCs）。OSCAR+ 门控应基于 OSCAR 同型对照管设定。
  16. 将分选后的细胞收集至含有补充 20% FBS 的完全 α-MEM 的聚丙烯试管中，置于 8 ˚C 保存。
  17. 分选完成后，在室温下以 300 x g 离心 5 分钟收集细胞，计数后重悬，用于后续实验。
    ​注意：通常，为获得约 1 x 105 个分选后的 pre-OCs/OCs，需从第 0 天接种的约 10 x 106 个细胞开始。较低的回收率主要受 accutase 脱落过程中的细胞损失以及染色和分选处理的影响。建议整个操作过程使用无菌缓冲液和试剂，并在无菌条件下进行。

9. 线粒体活性的ATP检测

  1. 将富集的 CD14 细胞孵育+ 在96孔板中，按照之前所述方法（步骤4.1–4.8），在M-CSF和RANKL存在下培养单核细胞。额外设置四个条件，每组设三个复孔，作为对照。
  2. 使用荧光ATP检测试剂盒，按照制造商说明书进行ATP检测。简而言之，配制ATP溶液时，将10 mL底物缓冲液加入冻干底物中，室温孵育30 min。
    注意：可采用不同方法检测细胞内ATP生成。本文中，我们使用了基于发光法的ATP生成检测。
  3. 孵育期间，按如下方式将对照品直接加入对照孔中：10 mM 和 100 mM 的 2-脱氧-D-葡萄糖（2DG），寡霉素 1 µM，以及100 mM 2DG联合使用 1 µM 寡霉素。在37°C下孵育30分钟 37 °C 含5% CO2.
    注意：2DG 可阻断糖酵解，而寡霉素是氧化磷酸化的抑制剂。联合使用这两种抑制剂将完全抑制 ATP 的生成。 通过 糖酵解和氧化磷酸化，因此可作为ATP检测的内参对照。对于10 mM和100 mM 2DG对照组，添加 0.5 µL 和 5 µL 每份 2M 2DG 储存液 100 µL 培养孔，分别。对于 1 µM 寡霉素，将5 mM的储存液用培养基按1:100稀释后加入 2 µL/well 至专用的对照孔。对于最后一个对照，添加 5 µL 2DG 和 2 µL 每孔加入稀释的寡霉素溶液。
  4. 添加 50 µL 向每孔加入ATP溶液以终止反应，并在避光条件下于室温下以700 rpm振荡孵育5-10分钟。
  5. 转移 100 µL 将上清液加入专用于ATP检测的96孔白色底板中，使用化学发光仪读板。

结果

从CD14+单核细胞生成破骨细胞+ 单核细胞
该方法旨在从人外周血CD14细胞中简便地大量分化出破骨细胞+ 单核细胞 体外，通常在1周内完成。首先，CD14+ 单核细胞从外周血单个核细胞中富集，并用M-CSF孵育过夜以诱导RANK上调，方法如前所述15单核细胞经预处理后，为确定RANKL在破骨细胞分化与成熟过程中的最佳浓度，分别使用1 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL的RANKL，并联合25 ng/mL M-CSF进行处理。随着RANKL浓度增加，TRAP阳性多核破骨细胞的数量呈剂量依赖性增多，通过TRAP染色进行评估。成熟的破骨细胞定义为TRAP阳性且具有多个细胞核（通常超过三个）的细胞。 图2A,B 和 补充图1）。此外，通过在2至14天的培养期内使用TRAP染色和光学显微镜观察，研究了单核细胞向破骨细胞（OC）分化的动力学过程。在此实验中，选用50 ng/mL RANKL的中等浓度来评估OC在体外培养中的分化速度。在此培养条件下，自第5天起即可观察到多核的破骨细胞，至第7天时分化达到最佳状态（图2C培养物在塑料器皿上孵育超过10天会导致异常巨大的融合细胞。在本方案中，通常将第6至第8天作为成骨细胞生成的最佳终点。此时的成骨细胞可用于定量分析或后续实验。

分化破骨细胞的功能评估
为了确定所生成破骨细胞（OCs）的功能活性，我们通过在矿化表面诱导OCs分化，检测其吸收活性。由于较大的破骨细胞仅在培养7天后形成，且需要足够时间以吸收矿化基质，因此培养持续至第10天。仅在同时接受M-CSF和RANKL处理的细胞所在的孔板矿化表面观察到圆形孔洞（即吸收陷窝）的形成（图3）。因此，矿化表面溶解面积百分比（吸收陷窝）可用于评估破骨细胞的吸收能力。此外，按照本方案在塑料或玻璃培养皿上培养至第7天的破骨细胞均显示出结构良好的肌动蛋白环，可通过免疫荧光染色清晰观察（补充图2）。

抑制剂对成熟破骨细胞功能的影响
上述培养条件被用于确定功能能力 体外 在已知的破骨细胞抑制剂鱼藤酮存在下生成的破骨细胞34OCs 经 6-8 天诱导分化，CD14−OSCAR+ OCs 和 OC 前体细胞被富集 通过 流式细胞术图4). 将富集的细胞以每孔50,000个细胞的密度接种至矿化涂层96孔板中，使用促破骨细胞生成培养基（含25 ng/mL M-CSF和RANKL）培养3天。随后用鱼藤酮处理图5A，B剂量依赖性地抑制了矿化表面的吸收，与未经处理的对照孔相比结果一致，符合以往研究。34此外，还评估了成骨细胞的功能活性 通过 ATP 生成与肌动蛋白环形成。鱼藤酮依赖性抑制 OC 吸收与 ATP 生成的抑制相关（图5C）。破骨细胞（OCs）是高度极化的细胞，通过调控细胞骨架的组织来调节其骨吸收能力。使用Alexa Fluor 647标记的鬼笔环肽对在有或无鱼藤酮存在条件下培养的成熟OCs中的F-actin细胞骨架进行染色。鱼藤酮导致RANKL诱导形成的成熟OCs肌动蛋白环发生断裂图 5D).

静态平衡，TRAP+ 分化；图表和显微镜图像显示M-CSF/RANKL随时间的作用效果。
图2：CD14高效分化为OCs+ 单核细胞前体 CD14+ 单核细胞通过磁珠富集后，以1 x 105 96 孔板中每孔接种细胞，密度为每孔一定数量的细胞，并加入 25 ng/mL M-CSF，于 37°C 培养箱中孵育过夜。A经M-CSF预处理的单核细胞用不同浓度RANKL（1 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL）刺激，在第7天固定并进行TRAP染色。采集图像，并检测TRAP+ 计数多核细胞（MNCs）。TRAP染色的代表性图像如下所示： 补充图1误差线表示均值 ± 标准差（n = 3）。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）及Holm-Sidak多重比较检验对配对数据进行分析；* P ≤ 0.05 且 ** P ≤ 0.005. (B96孔板中TRAP染色孔的代表性图像，显示在第7天，25 ng/mL RANK-L条件下预期的典型破骨细胞数量/孔及其形态，与M-CSF诱导的巨噬细胞相比较。比例尺： 1000 µm. (C在50 ng/mL RANKL条件下破骨细胞形成的代表性图像评估 通过 从第2天到第14天进行TRAP染色。从第5天起可见破骨细胞（OCs）。10天后出现巨大且异常融合的破骨细胞。比例尺： 200 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。

骨吸收示意图；仅M-CSF与M-CSF联合RANKL的骨吸收百分比数据对比图。
图3：由CD14+单核细胞分化而来的具有吸收功能的破骨细胞（OCs）。从外周血单个核细胞（PBMCs）中分离的CD14+细胞在含有25 ng/mL M-CSF（M）和RANKL（R）的矿物检测表面（骨化检测）培养板上培养10天，诱导其向破骨细胞分化。（A）在10倍放大倍数下拍摄的代表性重建孔图像，用于分析第10天的骨吸收情况（灰色为矿物基质，白色为吸收陷窝）。比例尺：1000 µm。（B）骨吸收面积百分比的定量分析。采用Wilcoxon配对分析法对吸收数据进行统计分析。误差线表示均值±标准差（n = 7）。请点击此处查看该图的放大版本。

流式细胞术示意图，显示细胞分选；FSC、SSC 图；CD14、OSCAR 分析；细胞活力。
图 4：CD14−OSCAR+ 破骨细胞的流式细胞术富集。 从 PBMCs 中富集 CD14+ 单核细胞，并如前所述诱导其分化为破骨细胞（OCs）。使用 accutase 脱落贴壁生长的 OC 培养物，并进行流式细胞术染色。（A-C）在第 8 天根据 CD14 和 OSCAR 的表达对 OCs 进行分选。（A）代表性分选设门策略。细胞首先设门为单细胞群体，并排除死细胞染色阳性细胞，随后分选出 CD14+ OSCAR+（红色）和 CD14− OSCAR+（蓝色）亚群。（B）代表性图谱显示 RANKL 诱导的 OCs（青色）与对照 M-CSF 诱导的巨噬细胞（橙色）中 OSCAR 染色的重叠情况。红色曲线为 RANKL 诱导 OCs 的同型对照染色。（C）将分选后的细胞群体接种于塑料培养皿中，在促破骨细胞培养基（含 25 ng/mL M-CSF 和 50 ng/mL RANKL）中孵育 2 小时使其贴壁，随后进行 TRAP 染色与观察。代表性图像显示 CD14+ 亚群（红色）中无 TRAP+ 细胞，而 CD14− 亚群（蓝色）中存在单核和多核的 TRAP+ 前体破骨细胞及成熟破骨细胞。比例尺：200 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

骨吸收分析；鱼藤酮效应；图解、图表、显微镜观察；破骨细胞活性研究
图5用于评估成熟破骨细胞功能的检测方法 为了评估成熟破骨细胞的功能，CD14+ 从外周血单个核细胞（PBMCs）中分离的细胞在含有M-CSF（M）或联合RANKL（R）的培养条件下培养7天，随后富集破骨细胞（OCs） 通过 流式细胞术，然后用抑制剂鱼藤酮处理破骨细胞24小时。（A成熟破骨细胞被分选 通过 流式细胞术（CD14−OSCAR+) 在存在或不存在鱼藤酮的情况下，在矿物测定表面培养3天，随后对细胞进行漂白，并在10倍镜下成像以显示骨吸收区域（白色部分为吸收陷窝）。A代表性重建的孔板图像。比例尺： 1000 µm. (B) 重吸收面积百分比的定量分析。(中的数据B) 采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合邓恩多重比较检验（Dunn's multiple comparisons test）进行分析（n = 7）；* P ≤ 0.05 和** P ≤ 0.01。误差线表示均值 ± 标准差。 (C未分化细胞及经RANKL诱导分化7天的成熟破骨细胞在溶剂或鱼藤酮（10 nM和30 nM）处理后的总细胞内ATP含量。实验中使用2-脱氧-D-葡萄糖（2DG）和寡霉素作为检测的阳性对照，于细胞裂解和ATP定量前30分钟加入。误差线表示均值±标准差（n = 4）。数据采用单因素方差分析（one-way ANOVA）及Dunnett多重比较检验进行配对分析。** P ≤ 0.01. (D代表性20倍放大图像显示成熟破骨细胞经染色后呈现肌动蛋白环（红色）和细胞核（蓝色），可见使用抑制剂后肌动蛋白环消失。比例尺： 100 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。

培养板规格96 孔板48 孔板24 孔板12 孔板6 孔板
体积100 µL225–250 µL450–500 µL0.8–1 mL1.8–2 mL

表1：不同培养板规格所需的细胞悬液体积。 体积基于浓度为 1 × 106 个细胞/mL 的细胞悬液计算，可提供适合细胞间融合的最佳密度。

荧光染料，克隆每 106 个细胞所需体积 (μL)
CD14PE/Cyanine7, HCD145 μL
OSCARFITC, REA49410 μL
细胞分选缓冲液80 μL

表2：抗体混合溶液。

补充图1：RANKL剂量反应的TRAP染色。 通过磁珠富集CD14+单核细胞，以每孔1 × 105个细胞的密度接种于96孔板中，并如图2所示，在25 ng/mL M-CSF条件下培养过夜。代表性TRAP染色图像显示，经M-CSF预处理的单核细胞在RANKL浓度梯度（1 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL）刺激下培养至第7天，随后固定并进行TRAP染色。比例尺：400 µm。请点击此处下载该文件。

补充图 2：完全分化的破骨细胞中的肌动蛋白环染色。 （A）在 TC 塑料上分化并用 AF647 鬼笔环肽（红色）染色的破骨细胞的 10 倍放大图像。比例尺：400 µm。（B）在玻璃培养皿上分化并用 AF488 鬼笔环肽（黄色）染色的破骨细胞的 40 倍放大图像。比例尺：100 µm。细胞核经 DAPI 染色，在（A）中显示为蓝色，在（B）中显示为青色。请点击此处下载该文件。

补充图3：不同批次FBS对成骨细胞分化效率的影响。 从CD14+单核细胞在含有25 ng/mL M-CSF和50 ng/mL RANKL（MR）的条件下培养7天以诱导分化为成骨细胞（OC）。对照孔仅含有M-CSF（M）。(A) 代表性10倍放大图像（比例尺：400 µm）；(B) 来自同一供体的细胞在两种不同批次FBS中分化的TRAP染色成骨细胞的定量分析。误差线表示三次技术重复的均值±标准差。请点击此处下载该文件。

讨论

大量功能性破骨细胞的简易培养与分离 体外 对于推进骨生物学和破骨细胞介导的疾病的理解具有重要意义。传统上，破骨细胞通过成骨细胞或基质细胞与来自脾脏或骨髓的造血细胞共培养而生成。38,39破骨细胞生成研究领域的一项重大突破是确定了RANKL为破骨细胞形成、分化及存活的主要调控因子40早期的RANKL依赖性培养系统采用外周血单个核细胞（PBMCs）生成破骨细胞21,41,42然而，这些混合培养耗时较长，且存在诸多混杂因素，限制了对成骨细胞分化和功能直接效应的检测能力。本方案描述了一种高效且可靠的 体外 人外周血CD14+细胞分化的破骨细胞生成模型+ 可在7天内获得最佳成骨细胞生成的单核细胞（图1 和 图2），相较于其他一些方案，速度明显更快43,44,45,46该方案的主要特点包括：（1）使用纯化的CD14+ 单核细胞，（2）在暴露于RANKL之前用M-CSF对单核细胞进行预刺激，（3）培养时间<7天），以及（4）使用抑制剂可靠地检测破骨细胞形成的抑制（TRAP染色）及其功能抑制（骨吸收、ATP生成、肌动蛋白环重组）。

在方法学优化过程中，发现了若干关键点。已观察到 体外 OC的分化在很大程度上依赖于CD14细胞的接种密度+ 单核细胞。因此，在本方案中，细胞以高密度接种（1 x 105 96孔板中每孔100 µL培养基内接种细胞），因为细胞必须能够相互接触并紧密相邻，才能融合并发育为成熟的破骨细胞（OCs）。同样，若接种密度过高，会因培养基成分限制及细胞生长空间不足而抑制其分化与增殖。此外，为确保本实验方案的最佳效果，需谨慎进行密度梯度分离，并确保获得富集的CD14⁺细胞群体+ 细胞应尽可能纯净。例如，洗涤步骤不充分会导致血小板去除不完全，从而抑制破骨细胞的分化47,48同样，分离的CD14⁺细胞中存在少量T细胞污染+ 仅用M-CSF刺激的样本可能导致OC分化，潜在地 通过 T细胞分泌RANKL49因此，每次实验都应设置M-CSF对照。尤其在使用新的分离试剂盒时，建议进行常规纯度检测，以确保样本的纯度。

使用添加了核苷和L-谷氨酰胺的α-MEM培养基可获得最佳的破骨细胞数量（范围：约200–1,600个破骨细胞/孔）。其他常规培养基，包括达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）和罗斯韦尔公园纪念研究所（RPMI）1640培养基，会影响破骨细胞的产量。胎牛血清（FBS）的来源也可能影响破骨细胞生成。不同批次的FBS可能导致RANKL诱导的破骨细胞生成减少，并在M-CSF对照组中出现少量TRAP+多核细胞（补充图3）。因此，为获得一致的结果，建议在使用前对新批次的FBS进行测试，并在整个实验过程中持续使用同一批次，以尽量减少分化过程中的变异。此外，当使用本方案比较不同样本（例如健康供体与患者）时，不同供体之间在最终时间点所获得的分化破骨细胞总数上存在的个体间差异，构成了该方法的一个局限性。在此类情况下，必须严格使用完全相同的条件以及相同批次的培养基、FBS和其他试剂。

为了实现破骨细胞（OC）的最佳分化和成熟，另一个必要的步骤是在添加RANKL之前，先用M-CSF对单核细胞进行预处理。在加入RANKL前18-24小时使细胞暴露于M-CSF，可促使单核细胞上调RANK的表达15,26。在此时间点添加RANKL可确保以剂量依赖的方式实现最佳的OC分化。OC分化的程度因供体而异；然而，通常25 ng/mL的RANKL足以在大多数供体中诱导大量OC的分化。此外，在化合物初筛实验中也可使用25 ng/mL RANKL，因为它有助于评估待测化合物的促进和抑制作用。其他培养体系曾采用更长的M-CSF预孵育时间后再添加RANKL，但这会导致骨吸收细胞生成过程的培养时间延长50。此外，将预处理后的单核细胞过夜孵育可使其附着于培养板上，尽管尚未达到完全贴壁状态。因此，首次加入RANKL时，必须非常小心地进行半量换液，而不是完全更换培养基，以防止预处理后的单核细胞脱落和丢失。培养基还需每3-4天更换一次，以避免耗尽并防止细胞死亡。此外，由于本实验使用的体积较小（96孔板中每孔100 µL），在实验孔周围设置一圈装有水溶液（如无菌蒸馏H2O或PBS）的空孔至关重要，以防止培养基蒸发和边缘效应。

最后，对于代谢检测（例如ATP检测），必须确保细胞具有活性，以避免重复样本之间出现较大的标准差（图5）。细胞的高存活率对于细胞分选以及分选后的破骨细胞（OC）的后续培养也至关重要（图4）。然而，该方法存在若干局限性。完全成熟的破骨细胞具有很强的黏附性，难以从培养板上脱离。较大的破骨细胞通常无法完全脱离，可能导致细胞收获量较低。因此，在分选后、接种至所需浓度之前必须对细胞进行计数。此外，本方案中采用非酶法（accutase）来解离破骨细胞，以避免在后续用于流式细胞术的表面染色过程中发生细胞膜结构改变。我们还测试了使用细胞刮刀（包括软头和硬头刮刀），但会导致较高的细胞死亡率。当后续实验不要求维持细胞膜完整性时，可使用含0.05%胰蛋白酶/EDTA的溶液进行酶法解离，以获得更高的破骨细胞解离产量。另外，为防止破骨细胞发生聚集，强烈建议在细胞解离后的所有缓冲液中使用高浓度EDTA，并在流式细胞术检测前进行适当的过滤处理。需要注意的是，破骨细胞培养物是由成熟破骨细胞、破骨细胞前体以及巨噬细胞组成的异质性细胞群体。巨噬细胞可以很容易地与破骨细胞区分开来，但单核前体破骨细胞和多核破骨细胞均表达OSCAR，因此使用本方法无法将二者区分开（图4）。事实上，这一问题构成了该方法的主要局限性。此外，在仅含M-CSF的培养体系中也观察到较低水平的OSCAR表达（图4B），这可能提示部分巨噬细胞已处于向破骨细胞谱系分化的启动状态。重要的是，应根据FMO染色信号来设定OSCAR+细胞的设门范围，如图4B所示。

综上所述，本方案描述了一种优化且稳健的方法，可高效地从循环原代人单核细胞诱导产生具有活性且功能成熟的破骨细胞（OC）。该方案的优势在于能够在较短时间内诱导生成大量已分化的破骨细胞。该方法为研究破骨细胞分化与功能背后的基本机制提供了可行途径。

披露

作者声明不存在任何竞争利益。

致谢

作者们衷心感谢感染与免疫学院内的流式细胞核心设施和格拉斯哥影像设施（GIF）在本研究工作中提供的支持与帮助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
µ-Slide 18 孔板载玻片ibidi81816
8 孔玻璃腔室载玻片 Ibidi 80807 
96 孔 TC 培养板 Corning 3596 
96 孔骨分析条板  Corning 3989 
乙酸溶液Sigma Aldrich386-3来自试剂盒目录号 387A-1KT
丙酮 VWR 20066.330 
酸性磷酸酶，白细胞（TRAP）试剂盒 SIGMA-ALDRICH 387A-1KT 
Alexa Fluor 488 鬼笔环肽Theremo Fisher - Invitrogen A12379 AF488   
Alexa Fluor 647 鬼笔环肽Thermo Fisher - InvitrogenA22287AF647
Alfa Aesar 2-脱氧-D-葡萄糖 Fisher Scientific 11321867 2DG, 98% 
α-最低必需培养基 gibco 22571-020 
ATPlite 1step PerkinElmer 6016731 化学发光 ATP 检测试剂系统 
BD FACSAria III 细胞分选仪BD Biosciences
牛血清白蛋白 (BSA) Sigma-Aldrich A9418-100G 
细胞培养微孔板，96 孔，PS，F 型底 Greiner bio-one 655083 白色底板 
柠檬酸溶液Sigma Aldrich91-5来自试剂盒目录号 387A-1KT
Corning 6 ml 圆底聚苯乙烯试管Fisher Scientific352054
Corning 骨分析表面多孔板Sigma-Aldrich CLS3989
Corning 骨分析表面多孔板 1 x 8 条板CorningCLS3989-2EA
DAPI Theremo Fisher  D3571 
EasySep 人 CD14 阳性选择试剂盒 STEMCELL Technologies 17858 
EasySep 红细胞裂解缓冲液 (10x)StemCell Technologies 20110
eBioscience 可固定活力染料 eFluor 780Theremo Fisher - Invitrogen 65-0865-14
乙二胺四乙酸 Sigma-Aldrich E7889-100ML 
EVOS FL auto 成像系统Thermo FisherA32678
Falcon 圆底聚丙烯试管（带盖）Fisher Scientific10314791
Falcon 15 mL 离心管Corning 430790 
Falcon 50 mL 离心管 Corning  430828 
Fast Garnet GBC 基液Sigma Aldrich387-2来自试剂盒目录号 387A-1KT
胎牛血清 gibco 10500-064 FBS
Ficoll-Paque Plus cytiva 17144003 
甲醛 Sigma-Aldrich F-8775 
人 sRANK 配体 PEPROTECH 310-01-100UG 核因子 κB 受体活化因子配体 (RANKL)
ImageJ 图像分析软件Image J版本 2.9.0
L-谷氨酰胺 gibco 25030-024 
锂肝素管 (9 mL) VACUETTE 455084 
巨噬细胞集落刺激因子 PEPROTECH 300-25-100UG  M-CSF
萘酚 AS-BI 磷酸溶液Sigma Aldrich387-1来自试剂盒目录号 387A-1KT
Neubauer 血细胞计数板计数室 CamlabSKU 1127885
来自淀粉色链霉菌的寡霉素 Sigma-Aldrich Q4876-5MG 
OSCAR 抗体，抗人，Vio Bright FITC，REAfinityMiltenyi Biotec130-107-661 和 130-107-617克隆 REA494
PE/Cyanine7 抗人 CD14 抗体Biolegend325618克隆 HCD14 
青霉素/链霉素 SIGMA P0781 
PHERAstar 仪器及软件BMG LABTECH
磷酸盐缓冲液 (DPBS, 1x) gibco 14190-094 
REA 对照抗体 (S)，人 IgG1，Vio Bright FITC，REAfinityMiltenyi Biotec130-113-443
次氯酸钠溶液  Sigma-Aldrich 425044-1L 
亚硝酸钠溶液Sigma Aldrich91-4来自试剂盒目录号 387A-1KT
酒石酸溶液Sigma Aldrich387-3来自试剂盒目录号 387A-1KT
吐温 X-100 Sigma-Aldrich 9002-93-1 
台盼蓝 Sigma-Aldrich T8154-100ML 

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