方法文章

利用双光子显微镜对具有闭合性颅脑损伤及颅窗的小鼠进行荧光蛋白表达的活体成像

2.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/64701

⸱

2023年4月21日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, University of Massachusetts Chan Medical School, 2Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, 3Department of Neurobiology, University of Massachusetts Chan Medical School

本文内容

摘要

本研究展示了对小鼠施加重复性创伤性脑损伤，同时植入颅窗，以便后续通过双光子显微镜对神经元表达的EGFP进行活体成像。

摘要

本实验方案的目的是展示如何在动物大脑特定细胞类型中，于外源性刺激暴露后，对目标蛋白的表达和定位进行长期可视化观察。本文展示了在小鼠中实施闭合性颅脑创伤（TBI）的同时植入颅窗，以便后续进行长期活体成像的操作方法。通过颅内注射腺相关病毒（AAV），该病毒在神经元特异性启动子驱动下表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）。注射后2至4周，利用落锤装置在AAV注射部位施加重复性TBI。在同一手术过程中，小鼠被植入金属头固定基座，随后在TBI作用区域植入玻璃颅窗。在数月时间内，利用双光子显微镜对经历创伤的同一脑区中EGFP的表达及其细胞定位进行观察。

引言

创伤性脑损伤（TBI）可由运动损伤、交通事故和军事冲突引起，是全球关注的健康问题。TBI 可导致生理、认知和行为功能障碍 以及终身残疾或死亡1,2。TBI 的严重程度可分为轻度、中度和重度，其中绝大多数为轻度 TBI（占 75%–90%）3。目前人们日益认识到，TBI 特别是反复发生的 TBI，可能促进神经元退行性变，并成为多种神经退行性疾病的风险因素，包括阿尔茨海默病（AD）、肌萎缩侧索硬化症（ALS）、额颞叶痴呆（FTD）和慢性创伤性脑病（CTE）4,5,6。然而，TBI 引发神经退行性变的分子机制尚不明确，因此仍是当前研究的热点领域。本文介绍了一种在小鼠 TBI 后通过纵向活体成像监测特定神经元内荧光标记的目标蛋白的方法，以深入了解神经元对 TBI 的响应与恢复过程。

为此，本研究展示了如何将一种类似于先前报道的闭颅创伤性脑损伤（TBI）手术操作7,8与Goldey等人9所述的颅窗植入手术相结合，用于后续的活体成像。值得注意的是，无法先植入颅窗再在同一区域实施TBI，因为用于诱导TBI的落锤冲击很可能损坏颅窗并对小鼠造成不可逆的损伤。因此，本方案设计为在同一台手术过程中先实施TBI，随后直接在撞击部位植入颅窗。将TBI与颅窗植入合并于一次手术中的优势在于减少了小鼠接受手术的次数。此外，该方法可实现对TBI后即刻反应（即数小时时间尺度内）的监测，而非在后续单独的手术中植入颅窗（即初始成像始于TBI后数天的时间尺度）。与通过免疫染色固定组织等传统方法监测神经元蛋白相比，颅窗结合活体成像平台还具有多项优势。例如，活体成像所需小鼠数量更少，因为同一只小鼠可在多个时间点被重复观察，而无需为每个时间点准备独立的小鼠群体。此外，可对同一神经元进行长期追踪，从而能够在单个细胞内监测特定的生物学或病理学事件。

作为概念验证，本文展示了在突触素（synapsin）启动子驱动下增强型绿色荧光蛋白（EGFP）在神经元中的特异性表达。10该方法可通过使用其他细胞类型特异性启动子扩展至1）不同的脑细胞类型，例如少突胶质细胞可使用髓鞘碱性蛋白（MBP）启动子，星形胶质细胞可使用胶质纤维酸性蛋白（GFAP）启动子11 ，2）通过将目的蛋白的基因与EGFP基因融合，表达不同的目标蛋白，以及3）共表达与不同荧光蛋白融合的多种蛋白。此处，EGFP被包装并表达 通过 通过颅内注射递送腺相关病毒（AAV）。使用落锤装置实施闭合性颅脑损伤，随后植入颅窗。通过颅窗利用双光子显微镜检测EGFP荧光，实现对神经元EGFP的可视化。 体内利用双光子激光，可以在光损伤最小的情况下更深入地穿透皮层组织，从而实现对同一只小鼠的相同皮层区域进行数天乃至数月的重复纵向成像12,13,14,15总之，将创伤性脑损伤手术与活体成像相结合的方法旨在增进对导致创伤性脑损伤相关疾病病理的分子事件的理解16,17.

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有动物相关实验方案均依照美国国家研究委员会（National Research Council, US）发布的《实验动物护理与使用指南》进行。本研究方案已获马萨诸塞大学陈医学院（University of Massachusetts Chan Medical School, UMMS）机构动物护理与使用委员会批准（许可编号 202100057）。简言之，如研究示意图（图1）所示，动物依次接受病毒注射、创伤性脑损伤（TBI）、颅窗植入，随后按时间序列进行活体成像。

注意：已移除商业术语。请参阅材料表以获取所用的具体设备信息。

1. 使用立体定位仪进行 AAV 的颅内注射

  1. AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP
    1. 使用病毒滴度为每毫升 1 × 1013 病毒基因组（vg/mL）。Syn1 指 Synapsin1，是一种神经元特异性启动子，可限制病毒在神经元中的表达。该病毒可自行制备或外包生产。
  2. 立体定位注射手术前准备（用于 AAV 给药）
    1. 对常规剪刀、手术卡尺、手术弹簧剪、手术镊、蚊式钳、纱布、棉签和玻璃微量注射器进行高压灭菌处理。
    2. 使用 75% 乙醇对手术区域进行消毒。展开一次性无菌手术巾，覆盖立体定位仪平台上的手术区域。
      注：为维持动物在注射手术期间的体温，应使用反馈调节式加热装置。
    3. 称量并记录小鼠体重。
    4. 打开氧气瓶阀门，调节氧气流速至 1.5 L/min。开启麻醉机，并将异氟烷浓度设定为 3。
      注：此步骤中载气可使用室内空气或 100% 氧气。
    5. 将小鼠放入诱导室，持续 5 分钟，以达到完全麻醉状态。
    6. 当小鼠完全麻醉后（即呼吸缓慢而稳定，约每 2 秒一个周期，且无尾夹反射），将其从诱导室中取出，并将头部固定于立体定位仪中。
    7. 将麻醉管路的鼻罩罩住小鼠鼻部。
    8. 手术结束前，持续使用 1.5% 异氟烷维持麻醉，载气流速保持在 1 L/min。定期检查呼吸频率，并在整个手术过程中至少每 15 分钟进行一次尾部或足趾夹捏，以评估麻醉深度。根据需要调整异氟烷浓度，以维持理想的麻醉深度。
    9. 用病毒溶液填充微量注射器（10 µL），然后将注射器固定在立体定位仪配套的微量注射泵上。
  3. 注射手术
    1. 使用一次性胰岛素注射器皮下注射布托啡诺（1 mg/kg） ，并在小鼠眼睛上涂抹润滑性眼膏。
    2. 使用常规剪刀 1 修剪小鼠头顶头皮上的毛发。
    3. 用纱布和棉签清洁头皮皮肤。先用 75% 乙醇消毒，再用聚维酮碘消毒。重复此过程三次（即乙醇后接聚维酮碘），最后一次保留聚维酮碘在皮肤上。
    4. 再次检查麻醉深度，确保小鼠已完全麻醉（即呼吸缓慢而稳定，约每 2 秒一个周期，且无尾夹反射）。沿中线做约 1 cm 的切口（使用常规剪刀 2），暴露右侧顶骨颅骨，并用棉签去除骨膜。
    5. 使用记号笔在颅骨上标记两个点，坐标如下：点 A：前囟后方 2.5 mm，右侧半球中线外侧 1 mm；点 B：前囟后方 2.5 mm，右侧半球中线外侧 2 mm。
    6. 使用电动牙科钻配合精细 EF4 碳化钨钻头，在已标记的坐标处小心钻穿颅骨。
      注：注意避免损伤脑组织。
    7. 调节立体定位仪，使微量注射器针尖对准中线外侧 1 mm 处的颅骨孔。
    8. 将注射器针尖下降至接触脑表面，并将该位置设为零点（z 轴）。随后将针尖进一步插入脑皮层至深度 0.5 mm，以 200 nL/min 的速度缓慢注入 1 µL 病毒溶液。
    9. 病毒溶液完全注入脑组织后，等待 5 分钟再撤出针头，以防止溶液回流。
    10. 缓慢撤出注射器针头。在另一位置重复注射操作。使用无菌不可吸收缝线（6-0 规格）缝合切口。
    11. 手术结束后，在动物仍处于麻醉状态下，肌内注射头孢唑林 [500 mg/kg  (333 mg/mL，通常约为 45 µL)]，以及皮下注射美洛昔康（5 mg/kg）。
    12. 解除小鼠在立体定位仪上的固定，停止麻醉。将小鼠置于清洁笼盒中，笼盒置于加热垫上，持续监测直至其恢复自主活动能力（约 15 分钟），然后转移至饲养笼盒。
    13. 在首次注射布托啡诺后的 8 小时、16 小时和 24 小时，分别再次皮下注射布托啡诺（1 mg/kg）和美洛昔康（5 mg/kg）。
      ​注：病毒注射后 2–4 周，小鼠将在同一位置接受创伤性脑损伤（TBI）及颅窗植入手术。

重复性创伤性脑损伤诱导的实施

注意：TBI 参数根据先前的报道7,8进行了调整，此前 TBI 冲击仅施加一次。本方案采用相同的参数，但将总冲击次数增加至 10 次。

  1. TBI 设备
    1. 使用定制的便携式设备进行闭合性颅脑损伤（TBI）的造模图2A) 按图示位置固定于小鼠头部右侧 图2B.
  2. 术前准备
    1. 高压灭菌手术器械，包括普通剪刀、外科卡尺、外科弹簧剪、外科镊、蚊式钳、头固定装置部件、纱布和棉签。
    2. 在手术前2小时称量并记录小鼠体重。为减少颅窗植入过程中的脑水肿，使用胰岛素注射器将地塞米松磷酸钠按4.8 mg/kg剂量（2 mg/mL，通常约为70 µl，需在两个位点注射）注入股四头肌。注射地塞米松后，在开始TBI手术前，按照步骤3.1所述制备玻璃窗，以备后续使用。
    3. 使用75%乙醇对手术台和TBI设备进行消毒，并铺开一次性无菌手术单覆盖在立体定位仪的手术台上。打开加热装置和温度监测仪，将目标温度设定为37 °C。
    4. 打开氧气瓶阀门，调节氧气流量至1.5 L/min。开启麻醉机，将异氟烷浓度设定为3。
      ​注：100% 纯氧有助于动物耐受创伤性脑损伤（TBI）的影响。
    5. 将小鼠放入诱导室，静置5分钟以达到完全麻醉状态。
    6. 当小鼠完全麻醉后（即呼吸缓慢但稳定，约每2秒一个呼吸周期，且无尾夹反射），将小鼠从诱导室中取出，并将其头部置于立体定位仪框架中。
    7. 将麻醉管鼻罩置于小鼠的口鼻部。
    8. 使用1.5%异氟烷与100%纯氧混合，以1 L/min的流速维持麻醉直至手术结束。定期检查呼吸频率，并在手术过程中至少每15分钟施加一次尾部或足趾夹捏，以评估麻醉深度。根据需要调整异氟烷浓度，以维持所需的麻醉深度。
  3. 创伤性脑损伤手术
    1. 使用一次性胰岛素注射器皮下注射布托啡诺（1 mg/kg），并在小鼠眼睛上涂抹眼用软膏。
    2. 用剪刀1修剪头部顶部的毛发，然后涂抹脱毛剂1分钟。
      ​警告：脱毛剂在头皮上的作用时间不得超过3分钟，因其具有皮肤刺激性。避免脱毛剂接触小鼠的眼睛。
    3. 使用纱布和棉签清洁头皮皮肤。然后依次使用75%乙醇和碘伏对皮肤进行消毒。重复此步骤三次（即先乙醇后碘伏），最后一次保留碘伏在皮肤上。
    4. 重新检查麻醉深度，确保小鼠已完全麻醉（即呼吸缓慢但稳定，约每2秒一个呼吸周期，并且无尾夹反射）。用外科镊子提起皮肤，从眼睛后方约3 mm处开始，做一道长12–15 mm的正中切口。
    5. 使用弹簧剪切除颅骨左右半球上方的皮肤。
    6. 颅骨暴露后，用无菌棉签轻轻擦拭并用无菌生理盐水冲洗，以去除骨膜。
    7. 目视检查颅骨状况，确保除先前病毒注射手术所造成的两个小孔外，颅骨完整无损。
    8. 干燥颅骨区域，并在以下坐标位置标记TBI撞击点：前囟后方2.5 mm，矢状缝右侧2 mm处图2B).
    9. 迅速将小鼠从立体定位仪中取出，并将其头部置于TBI设备下的缓冲垫上。
    10. 将撞击器尖端与标记的撞击位置对齐。
    11. 通过拉动系留的尼龙绳，将金属柱抬升至小鼠头部上方15 cm处，然后释放，使重物自由下落至与颅骨顶部TBI部位接触的换能器杆上。在施加TBI冲击时，切勿触碰小鼠头部。
    12. 将小鼠移至加热毯上，仰卧放置，同时监测其呼吸状况。
    13. 当小鼠从仰卧位恢复至俯卧位后，将其放入异氟烷诱导室中，以1.5 L/min的流速通入含3%异氟烷的100%纯氧，持续约5分钟。
    14. 待小鼠完全镇静后（即呼吸缓慢但稳定，约每2秒一个周期，且无尾夹反射），重复步骤2.3.9-2.3.14，共完成10次撞击。
      注意：在本研究中，十次TBI冲击可诱导出显著的表型且小鼠死亡率较低（数据尚未发表）。可通过增加或减少冲击次数和/或改变下落重量的高度来调整参数，以实现不同严重程度的脑损伤。所有参数须经本地IACUC批准。
    15. 在手术显微镜下检查颅骨，若发现颅骨骨折，则将小鼠剔除出研究。
    16. 假手术组的操作步骤与上述相同，包括将动物放置在撞击装置下，但不施加创伤性脑损伤（TBI）撞击。
    17. 小鼠在仰卧位后自行翻转为俯卧位，耗时10th TBI撞击后，将小鼠放入异氟烷诱导室中约5分钟。按照步骤2.2.6-2.2.8，将小鼠头部固定于立体定位仪上，以进行下述颅窗植入手术。

3. 颅窗植入手术

注意：以下颅窗植入步骤采用自 Goldey 等人9，并应用了其关于头固定装置和成像井的设计参数。

  1. 窗体制备
    注意：在开始TBI手术前，先完成2.2.2步骤中的窗体准备。窗体由两张圆形玻璃盖玻片制成（直径分别为3 mm和5 mm，如图所示）。 图2C通过透明光学胶粘剂连接在一起，如下所述。
    1. 将玻璃盖玻片浸入75%乙醇中消毒15分钟。取出盖玻片，置于无菌表面（如无菌24孔板的盖子）上晾干约10分钟。
    2. 用胰岛素注射器吸取透明光学胶，避免产生气泡。在显微镜1下材料表在0.67倍放大倍数下，于5 mm盖玻片中心滴加一小滴（约1 µL）光学胶。随后立即将3 mm盖玻片置于其上，并与5 mm盖玻片居中对齐。
    3. 使用精细镊子轻轻施压，使胶水均匀铺开。若3 mm盖玻片周围出现气泡或胶壁，应丢弃该玻璃窗。
    4. 将盖玻片放入紫外照射箱中，在20 × 100 µJ/cm²功率下照射150秒，以固化胶水。2检查两个盖玻片是否牢固粘合，用镊子4轻轻推动3 mm盖玻片的侧面。如果盖玻片移动，将其放回紫外箱中再照射60秒。将玻璃窗存放于无菌的24孔板中，以备后续使用。
  2. 粗糙化颅骨表面。
    注意：从此处开始，第3部分的所有步骤均需在手术显微镜下进行。起始放大倍数为10倍，并根据需要调整至合适的放大倍数。
    1. 使用FG4碳化钨钻头在低转子速度（即输出数值设为约1-2）下轻柔缓慢地钻磨颅骨表面，以去除残留的骨膜并使颅骨表面粗糙，从而确保牙科水泥能牢固地与颅骨结合。此处也可选用手术刀代替钻头作为替代方法。
    2. 使用生理盐水冲洗并清除颅骨表面的骨屑。
  3. 分离肌肉。
    注意：分离肌肉可增加暴露的颅骨表面积，该区域将作为牙科水泥的接触点，从而确保植入物的结构完整性。此肌肉分离步骤通常会暴露约 3 mm 的颞骨颅板。
    1. 在眼球后方约 5 mm 处，即顶骨与颞骨颅缝所在位置，轻轻插入闭合的精细镊尖（#5/45 镊子），以分离侧部肌肉与颅骨，然后将闭合的镊尖轻柔地向后移动，直至人字缝。
    2. 分离将要植入颅窗一侧的侧部肌肉。
      注意：分离肌肉时切勿过于靠近眼部，以免损伤眼动脉；否则可能引起严重且持续的出血。不要将肌肉从枕骨处分离，因为小鼠需要这些肌肉来抬起头部。
    3. 用生理盐水冲洗手术部位以清除碎屑，并用纱布擦干该区域。可在手术部位应用明胶海绵以止血。
  4. 植入头固定装置。
    1. 使用定制的钛合金头固定装置（图 2D)，如先前发表的文章所述9，用于在进行开颅手术时牢固固定小鼠头部，以及后续的双光子成像。
    2. 使用记号笔和外科游标卡尺在右侧干燥清洁的颅骨上标记开颅区域的周长。所标记圆的中心位于前囟后方2.5 mm，右侧半球矢状缝外侧1.5 mm处。所标记圆的直径约为3.2–3.5 mm，略大于3 mm的玻璃盖玻片。确保开颅区域覆盖病毒注射位点（注射病毒时形成的两个孔可作为参考）以及创伤性脑损伤（TBI）部位。
    3. 松开耳杆，旋转头部使开颅平面完全水平，然后再次拧紧耳杆。
    4. 使用棉签棒的木柄在头枕的前缘和后缘各添加两小滴瞬间胶。
    5. 将钛合金头固定装置置于颅骨开窗的中心位置，并迅速调整使其与即将植入颅骨窗的位置处于同一平面。施加轻微压力直至超级胶水干燥，通常需要约30秒。
    6. 在预冷的陶瓷混合皿中（于-20 °C冰箱中至少放置10分钟）配制牙科水泥：取300 mg水泥粉、六滴快速基础液和一滴催化剂，混合后搅拌至均匀（约搅拌15次）。
      注意：水泥应呈糊状。如果过稀，可加入少量水泥粉并搅拌；如果过稠，可逐滴加入快干基质液体，边加边搅拌，直至达到糊状 consistency。
    7. 在所标记的圆周外缘迅速涂抹足量的牙科水泥混合物，并覆盖所有暴露的骨面，但切勿覆盖颅骨开窗部位。待牙科水泥干燥并硬化约15分钟后，再继续后续操作。
    8. 松开耳杆，将头固定装置固定到金属框架上，以确保头部稳定，便于沿标记的颅骨开窗范围进行精确钻孔。如果颅骨开窗部位覆盖有水泥，使用 FG4 碳化钨钻头钻除并清理。
  5. 开颅术
    1. 使用手术卡尺验证步骤3.4.2中所标记圆圈的直径，必要时进行调整，以确保颅窗能够紧密地嵌入颅骨开窗内。
    2. 使用电动牙科钻，在标记圆圈的外侧对颅骨进行酸蚀和减薄，先使用FG4碳化硅钻头（转速设定为输出值约9-10）。这将形成一个 "追踪" 用于磨薄颅骨的区域。
      警告：为尽量减少热损伤并形成平滑的钻孔轨迹，操作时应持续移动钻头。同一位置钻孔时间不得超过2秒。
    3. 定期停止钻孔，并用无菌生理盐水冲洗整个区域，以减少钻头产生的热量并清除骨屑。
    4. 继续使用FG1/4碳化钨钻头，按照步骤3.5.2所述方法，将颅骨磨至纸般薄且透明。
      注意：使用双手持握钻机有助于更好地控制钻机，避免钻头插入脑组织。
    5. 使用 EF4 碳化钨钻头完成颅骨磨薄。当骨瓣与周围颅骨之间出现裂纹时，有时会释放出脑脊液（CSF），表明颅骨已被完全钻透。
    6. 继续沿轨迹对余下的颅骨进行减薄和钻孔。避免在明显血管结构穿过颅骨下方的部位钻孔，以防止出血。
    7. 用精细镊子尖端（镊子1）从裂缝处插入约0.5 mm，轻轻向上抬起骨瓣，避免压陷下方脑组织。
    8. 取下骨瓣后，用生理盐水冲洗颅骨开孔区域。脑表面可能比颅骨开孔边缘高1-2 mm。
    9. 从这一步开始，始终用生理盐水覆盖暴露的脑组织，以保护脑组织。
    10. 在原始AAV注射位点抬起颅骨瓣时，可能因注射手术后组织粘连和血管增生而导致出血。若发生出血，应用干燥的棉签轻轻按压出血部位约2分钟（或根据需要更长时间）。可使用明胶海绵控制出血。禁止使用化学止血剂或电凝镊止血，以免造成组织损伤。
    11. 使用镊子1轻轻去除可见的蛛网膜组织。
  6. 植入玻璃窗
    1. 使用手术镊2夹取无菌玻璃窗，使3 mm的玻璃盖片朝下。将玻璃窗置于颅骨开窗部位上方并进行调整，确保玻璃窗能紧密贴合颅骨开窗边缘。上方为5 mm的玻璃盖片。
    2. 制备牙科水泥的步骤如下：取100 mg水泥粉末，加入两滴快干基础液和一滴催化剂，搅拌混合物至充分混匀（约15次）。静置约6分钟，直至水泥呈糊状且变稠。若水泥过稀，则在步骤3.6.4中可能渗入窗下间隙，导致窗口模糊。
    3. 在等待水泥变稠呈糊状的同时，通过立体定位仪对窗口施加适当压力，以确保颅骨能牢固且紧密地贴合玻璃窗口。注意确保3.6.4步骤中的牙科水泥液体不会渗入玻璃下方空间，从而遮挡窗口。
    4. 使用可调节精度的涂布刷，沿窗缘涂抹少量水泥，以将玻璃窗与颅骨密封。等待约10分钟，使水泥完全干燥，然后轻轻松开并移除位于窗口上方的操纵器。至此步骤为止，完成10次TBI冲击并植入头固定装置和颅窗共需约4小时。
    5. 如果覆盖观察窗的牙科水泥过多，使用带有FG4碳化钨钻头的牙科钻头修剪牙科水泥。
      注意：窗口周围过多的水泥可能会阻碍双光子物镜接近窗口表面。
  7. 植入成像窗
    注意：成像孔（图2D是一个外径约为1.6 cm的橡胶环，与头固定装置顶部表面相匹配，用于在颅窗上方保持液体，以便进行双光子成像。
    1. 在完成窗口植入后，钻除头固定柱顶面的牙科水泥碎屑，并使用湿润的外科纱布清洁该区域。让该区域干燥约3分钟。
    2. 使用棉签蘸取少量超级胶水，涂抹于头固定装置的顶面。迅速将橡胶环放置在头固定装置上，施加中等压力约 2 分钟，以确保其与头固定装置紧密贴合。超级胶水用量宜少，否则可能粘附于玻璃窗口，影响双光子成像。
  8. 镇痛药与抗生素给药
    1. 植入成像窗后，但在停止异氟烷麻醉之前，立即给予头孢唑林（500 mg/kg） （333 mg/mL，通常约45 µL），肌肉注射]，以及美洛昔康（5 mg/kg，皮下注射），使用一次性胰岛素注射器给药。
    2. 给药后，停止麻醉，将小鼠从立体定位仪上取下，并放回其位于加热垫上方的饲养笼中。
    3. 密切观察小鼠约15分钟，直至其能够自主活动。
      注意：将小鼠单独饲养，以防止它们啃咬其他小鼠的橡胶成像孔。在笼内靠近小鼠的位置提供食物和水凝胶，以便其取用 随意摄取.
    4. 每8小时皮下注射一次布托啡诺（1 mg/kg）和美洛昔康（5 mg/kg），自上次给药后开始计算时间，持续至颅窗植入手术后48小时。

4. 活体双光子成像

  1. 使用配备可调谐相干多光子激光器和20倍物镜（数值孔径NA 1.0；水浸式）的显微镜2（材料表）进行活体成像18。用于EGFP信号的滤光片为"BP 500-550"。
  2. 准备开颅窗小鼠以进行活体成像。
    1. 从手术当天（定义为第0天）开始，在创伤性脑损伤（TBI）后的预定时间点进行双光子成像。将开颅窗小鼠放入麻醉诱导室，以1.5 L/min的流速通入含3%异氟烷的载气，持续5分钟。
      注：载气可为空气或100%氧气。
    2. 当小鼠完全麻醉后（即呼吸缓慢但稳定，约每2秒一个周期，且无尾夹反射），将小鼠从诱导室中取出，并迅速将其头部固定夹固定在支架上。使小鼠躯干平放在带有支架的圆形塑料板（直径19 cm）上。
      注：在小鼠躯干下方放置加热垫以在活体成像期间提供保温支持。
    3. 在小鼠眼睛上涂抹润滑性眼膏，并将麻醉管鼻罩覆盖于小鼠口鼻部。通过1.5%异氟烷与载气（流速1 L/min）维持麻醉状态。
    4. 定期检查呼吸频率，并在整个成像过程中至少每15分钟进行一次尾部或足趾夹捏，以评估麻醉深度。根据需要调整异氟烷浓度，以维持所需的麻醉深度。
    5. 调整小鼠头部位置，确保开颅窗位于双光子物镜正下方。在开颅窗上方的成像腔内加入适量水，降低物镜使其浸入水中。
  3. 开颅窗小鼠的活体成像
    1. 打开显微镜汞灯，首先通过目镜以落射荧光模式观察脑组织。
      注：血管呈黑色。选择开颅窗清晰的区域。关闭落射荧光，将激光波长设为860 nm以检测EGFP信号，并调节激光参数以获得最佳信号（即明亮但未饱和）。
    2. 将扫描模式设为帧，线步进设为1。设置平均次数为16，位深为8位，模式为线，方法为平均。
    3. 利用血管结构模式作为"参考图谱"，以便在后续纵向成像中定位同一脑区。使用z轴堆叠模式对表层（I层，距软脑膜表面小于100 µm）进行三个成像平面的采集，其中皮层血管占主导，层间间隔为10 µm，如图3A所示。
    4. 在深层（IV层和V层，比表层深约400 µm）使用z轴堆叠模式采集六个成像平面，如图3A所示，层间间隔为10 µm，扫描速度为8。
    5. 完成成像后（每只小鼠约20分钟），停止麻醉，将小鼠从固定架上取下，并放回位于加热毯上方的原饲养笼中。持续监测小鼠直至其恢复自主活动能力，通常需要约7分钟。
    6. 在TBI手术后第0天、1周和4个月时对小鼠进行纵向成像。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

作为本方案的概念验证，将表达 AAV-Syn1-EGFP 的病毒颗粒注射至雄性 TDP-43 小鼠的大脑皮层Q331K/Q331K 小鼠（C57BL/6J 背景）19 在3个月龄时。需要注意的是，也可使用野生型C57BL/6J动物，但本研究是在TDP-43模型中进行的Q331K/Q331K 小鼠，因为该实验室专注于神经退行性疾病研究。在腺相关病毒注射后4周进行创伤性脑损伤（TBI）手术。在同一手术过程中，植入头固定基座和颅窗。使用双光子显微镜对小鼠在TBI手术后第0天、第1周和第4个月进行连续成像（图1）。一般来说，注射手术每只小鼠耗时约30分钟，而创伤性脑损伤（TBI）手术每只小鼠耗时约1小时。在TBI手术过程中，与初始撞击相比，小鼠在后续撞击后从仰卧位恢复至俯卧位所需的时间通常更长。例如，某只小鼠在第一次撞击后可能需要2分钟恢复体位，但在第10次撞击后恢复体位可能需要10分钟th 影响。对于颅窗植入手术，通常需要约3小时完成所有步骤，但如果出现持续性出血，则耗时...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

在本研究中，通过结合腺相关病毒（AAV）注射、创伤性脑损伤（TBI）建模以及颅窗与头固定装置的植入，对小鼠脑皮层（IV层和V层）中EGFP标记的神经元进行纵向成像分析，以观察TBI对皮层神经元的影响。本研究指出，所选择的TBI作用部位位于海马体上方，该区域颅骨相对平坦且宽阔，有利于颅窗的植入。相反，该位置前方的颅骨较窄，因此难以确保头固定装置与颅骨表面有效贴合。而仅针对TDP-43Q331K/Q331K 本研究采用了小鼠模型，考虑到实验室的研究重点是肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶变性（FTD）19，本方案应适用于大多数其他小鼠品系。除了如本文所述标记神经元外，还可采用多种策略对其他细胞类型进行标记，以实现活体成像。其中一种方法是在基因修饰小鼠中利用Cre-Lox重组系统，以细胞特异性方式表达遗传编码的荧光蛋白21另一种方法是利用特定的病毒血清型，实现细胞特异性转导遗传编码的荧光蛋白。通过在脑内目标位置进行颅内注射，可实现定点递送。该方法在表达细胞特异性蛋白方面的效率和操作便捷性 通过 活体成像中，病...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

未声明任何利益冲突。

致谢

感谢马萨诸塞大学陈医学院的 Miguel Sena-Esteves 博士惠赠 AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP 病毒，以及马萨诸塞大学陈医学院的 Debra Cameron 绘制小鼠颅骨示意图。我们还感谢 Bosco、Schafer 和 Henninger 实验室的现任及前任成员所提出的建议与支持。本研究由美国国防部（W81XWH202071/PRARP）资助，受资助者为 DAB、DS 和 NH。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
可调节精密涂布刷ParkellS379
BD胰岛素注射器BDNDC/HRI#08290-3284-385/16" x 31G
聚维酮碘PurdueNDC67618-151-17含7.5%聚维酮碘
丁丙诺啡PAR PharmaceuticalNDC 42023-179-05
头孢唑林HIKMA PharmaceuticalNDC 0143-9924-90
陶瓷混合皿ParkellSKU: S387用于牙科水泥配制
棉签涂药棒ZORO目录号: G9531702
催化剂ParkellS371全称："C" Universal TBB Catalyst
牙科水泥粉末ParkellS396用于C&B Metabond的X线阻射L型粉末
牙科钻头ForedomH.MH-130
牙科钻头控制器ForedomHP4-310
地塞米松PhoenixNDC 57319-519-05
EF4碳化钨钻头Microcopy批号 C150113头部直径/长度/mm 1.0/4.2
乙醇Fisher Scientific04355223EA75%
FG1/4碳化钨钻头Microcopy批号 C150413头部直径/长度/mm 0.5/0.4
FG4碳化钨钻头Microcopy批号 C150309头部直径/长度/mm 1.4/1.1
头固定柱N/AN/A定制生产
加热装置CWETC-1000 Mouse与立体定位仪配套使用，手术过程中使用
加热垫CVS pharmacyE12107额外加热设备，术后使用
异氟烷PivetalNDC 46066-755-03
异氟烷诱导室Vetequip89012-688简称诱导室
异氟烷挥发器Vetequip911103
异氟烷挥发器支架Vetequip901801
Leica手术显微镜LeicaLEICA 10450243
润滑性眼用软膏PicetalNDC 46066-753-55
标记笔DelascoSMP-BK
美洛昔康NorbrookNDC 55529-040-10
微量注射泵及其控制器World Precision Instrumentsmicro4 和 UMP3
微升注射器HamiltonHamilton 800141701 RN，注射器规格10 μL，针头规格32G，长度2英寸，尖端类型3
蚊式止血钳CAROLINA货号: 625314不锈钢，弯型，5英寸
脱毛剂McKesson CorporationN/ANair Aloe & Lanolin脱毛乳液
显微镜1NikonSMZ745用于颅窗制备的尼康显微镜
显微镜2ZeissLSM 7 MP双光子显微镜
多光子激光器CoherentChameleon Ultra II, 型号: MRU X1, VERDI 18W用于双光子显微成像的激光器
不可吸收外科缝线Harvard Apparatus目录号 59-68606-0，带圆针
Norland光学胶81Norland ProductsNOA 81
防钩针持CAROLINA货号: 567912
快速基底液ParkellS398"B" Quick Base For C&B Metabond
普通剪刀1Eurostateurostat es5-300
普通剪刀2World Precision Instruments货号: 501759-G
圆形盖玻片1Warner instrumentsCS-5R 目录号 64-0700适用于直径5 mm
圆形盖玻片2Warner instrumentsCS-3R 目录号 64-0720适用于直径3 mm
橡胶环Orings-Online货号 OO-014-70-50O型圈
生理盐水BioworldL19102411PR
弹簧剪刀1World Precision Instruments货号: 91500-09尖端直型
弹簧剪刀2World Precision Instruments货号: 91501-09尖端弯型
立体定位平台KOPF型号 900LS
超级胶水Henkel货号: 1647358
外科卡尺World Precision Instruments货号: 501200
外科镊1ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES目录号 0508-5/45-PO型号5/45，弯型
外科镊2ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES目录号 0103-5-PO型号5，直型
外科镊3ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES目录号 72912
外科镊4ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES目录号 0508-5/45-PO型号5/45，弯型
外科纱布ZORO目录号: G0593801
手术灯LeicaLeica KL300 LED
紫外交联仪SpectrolinkerXL-1000又称紫外交联器
麻醉气体防护罩Vetequip931401
Vetbond组织粘合剂3M Animal Care部件号: 014006

参考文献

  1. Bowman, K., Matney, C., Berwick, D. M. Improving traumatic brain injury care and research: a report from the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. JAMA. 327 (5), 419-420 (2022).
  2. National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. Traumatic Brain Injury: A Roadmap for Accelerating Progress. , The National Academies Press. (2022).
  3. Xu, X., et al. Repetitive mild traumatic brain injury in mice triggers a slowly developing cascade of long-term and persistent behavioral deficits and pathological changes. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 60(2021).
  4. Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
  5. Mackenzie, I. R., Rademakers, R., Neumann, M. TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. The Lancet. Neurology. 9 (10), 995-1007 (2010).
  6. McKee, A. C., et al. The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathologica. 131 (1), 75-86 (2016).
  7. Henninger, N., et al. Attenuated traumatic axonal injury and improved functional outcome after traumatic brain injury in mice lacking Sarm1. Brain. 139, 1094-1105 (2016).
  8. Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C., Brown, R. H., Henninger, N. Cortical spreading depression denotes concussion injury. Journal of Neurotrauma. 36 (7), 1008-1017 (2019).
  9. Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
  10. Kugler, S., et al. Neuron-specific expression of therapeutic proteins: evaluation of different cellular promoters in recombinant adenoviral vectors. Molecular and Cellular Neurosciences. 17 (1), 78-96 (2001).
  11. von Jonquieres, G., et al. Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain. PLoS One. 8 (6), 65646(2013).
  12. Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
  13. Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. The Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
  14. Yang, Q., Vazquez, A. L., Cui, X. T. Long-term in vivo two-photon imaging of the neuroinflammatory response to intracortical implants and micro-vessel disruptions in awake mice. Biomaterials. 276, 121060(2021).
  15. Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7319-7324 (2003).
  16. Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
  17. Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742(2014).
  18. Mondo, E., et al. A developmental analysis of juxtavascular microglia dynamics and interactions with the vasculature. The Journal of Neuroscience. 40 (34), 6503-6521 (2020).
  19. White, M. A., et al. TDP-43 gains function due to perturbed autoregulation in a Tardbp knock-in mouse model of ALS-FTD. Nature Neuroscience. 21 (4), 552-563 (2018).
  20. Chou, A., et al. Inhibition of the integrated stress response reverses cognitive deficits after traumatic brain injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (31), 6420-6426 (2017).
  21. Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. Implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice. Journal of Visualized Experiments. (172), e62633(2021).
  22. Foda, M. A., Marmarou, A. A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).
  23. Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).
  24. Sun, W., et al. In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421(2019).
  25. Li, D., et al. A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice. eLight. 2 (1), 1-18 (2022).
  26. Paveliev, M., et al. Acute brain trauma in mice followed by longitudinal two-photon imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51559(2014).
  27. Han, X., et al. In vivo two-photon imaging reveals acute cerebral vascular spasm and microthrombosis after mild traumatic brain injury in mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 210(2020).
  28. Jang, S. H., Kwon, Y. H., Lee, S. J. Contrecoup injury of the prefronto-thalamic tract in a patient with mild traumatic brain injury: A case report. Medicine. 99 (32), 21601(2020).
  29. Courville, C. B. The mechanism of coup-contrecoup injuries of the brain; a critical review of recent experimental studies in the light of clinical observations. Bulletin of the Los Angeles Neurological Society. 15 (2), 72-86 (1950).
  30. Drew, L. B., Drew, W. E. The contrecoup-coup phenomenon: a new understanding of the mechanism of closed head injury. Neurocritical Care. 1 (3), 385-390 (2004).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

EGFP

相关文章