本文介绍一种非遗传学方法，利用从稳态外周血中分离的单个核细胞生成人自体肝类球体。
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本文内容
摘要
摘要
人类肝细胞可形成三维（3D）结构，在培养中可持续生长数周，并保持其功能活性。由于这些细胞在低黏附性或无黏附性的培养皿中具有自然聚集的特性，会形成由多个肝细胞组成的聚集体，称为人类肝类球体。三维肝类球体的形成依赖于肝细胞在缺乏黏附基质条件下自发聚集的生物学特性。相较于传统二维培养的细胞，这些三维结构具有更接近体内生理状态的生物学反应，其功能表现也更为接近真实的肝脏组织。 体内 环境。与传统的二维（2D）培养相比，三维肝细胞培养具有多种优势，包括更接近生物学真实的微环境、能够模拟天然器官的结构形态，以及对疾病状态具有更准确的预测能力 体内类药物反应。类球体的来源多样，可来自原代肝组织或永生化细胞系。此外，还可利用人胚胎干细胞（hESCs）或诱导性多能干细胞（hiPSCs）定向分化为肝细胞，从而构建三维肝组织。我们通过激活人外周血中未经过基因操作的膜结合型GPI锚定蛋白，获得血液来源的多能干细胞（BD-PSCs），并将其分化为肝细胞，成功获取人源肝类球体。采用光学显微镜观察及基于人肝细胞标志物的免疫表型分析，对BD-PSCs来源的人肝细胞及人肝类球体进行了鉴定。
引言
近年来，三维（3D）球状体培养系统已成为研究癌症研究、药物发现和毒理学等多个领域的重要工具。这类培养体系引起了广泛关注，因为它们填补了二维（2D）细胞培养单层与复杂器官之间的空白1。
在缺乏黏附表面的情况下，与二维细胞培养相比，类球体的形成基于这些细胞自然聚集为三维结构的特性。这些细胞会自我组织成由一种或多种成熟细胞组成的细胞群。由于不含外源材料，这些细胞之间的相互作用与其原始微环境中的情况类似。三维培养中的细胞彼此之间更为紧密，具有更合理的空间取向，且胞外基质的产生量高于二维培养，从而构建出接近天然的细胞微环境2。
动物模型长期以来被用于研究人类生物学和疾病3在这方面，人类与动物之间存在内在差异，这使得这些模型并不完全适用于外推性研究。三维培养的球状体和类器官是研究类似组织结构、不同类型细胞之间相互作用和串扰的有前景工具 体内 并有助于减少甚至替代动物模型，在研究肝脏疾病发病机制以及作为药物筛选平台方面具有重要意义4.
三维球体培养在癌症研究中具有重要意义，因为它可以减少制备二维培养肿瘤细胞单层所需的胰蛋白酶消化或胶原酶处理，从而消除细胞与其环境之间的不连续....
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方案
已获得伦理批准（ACA CELL Biotech GmbH/25b-5482.2-64-1），以开展这些实验，且所有献血者在采血前均按照机构指南签署了知情同意书。
1. 从人外周血（PB）中制备单个核细胞（MNCs）
- 根据标准操作规程，在训练有素的医务人员协助下，从健康供者体内采集 30 mL 血液。
- 采用密度梯度介质，按照 Becker-Kojić 等人发表的方案13分离外周血单个核细胞（PBMNCs）。用移液器吸取血浆与密度梯度介质之间的界面层，并使用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤所分离的细胞。
- 使用计数板，按照标准方法对细胞数量进行计数。
2. 人GPI锚定糖蛋白激活后单个核细胞的去分化
- 按照 Becker-Kojić 等人的方法13，将 6 × 106 个单个核细胞置于含 1% 牛血清白蛋白（BSA）的 PBS 中，加入特异性抗体，于 37 °C 孵育 30 分钟。
- 在室温下以 300 × g 离心细胞，弃上清，将 PBS/BSA 替换为添加了 10% 胎牛血清（FBS）的 Iscove 改良....
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结果
我们通过应用两步法成功地将人BD-PSCs分化为内胚层/肝祖细胞及肝细胞。肝向分化过程中的形态学变化如图1所示。BD-PSCs分化为肝细胞需经历三个不同阶段：第一阶段为分化为内胚层细胞（L4），第二阶段为分化为肝祖细胞（肝母细胞，L8），呈现典型的多边形形态，第三阶段为向肝细胞（L15-L24）的成熟过程。
通过免疫荧光分析验证BD-PSCs的肝向分化，结果如图2所示。在肝向分化过程的L4至L8阶段，细胞中可检测到内胚层/人肝前体细胞标志物甲胎蛋白（AFP）和转甲状腺素蛋白（TTR）的强表达。其中，AFP是胎儿血清中的主要血浆蛋白，在成体生物体内浓度极低，因此被视为肝细胞前体的标志物15；TTR是一种主要的甲状腺激素结合蛋白，参与将甲状腺素从血液中转运至大脑16。然而，这些标志物在L15阶段表达下降；而白蛋白（ALB）——主要由肝脏产生、在血浆中含量最丰富的蛋白质，对肝.......
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讨论
肝脏是人体内具有多种重要生物学功能的主要器官，例如代谢产物的解毒。由于肝硬化和/或病毒性肝炎等严重肝功能衰竭，全球每年约有200万人因此死亡。在全球实体器官移植中，肝脏移植数量位居第二，但目前仅有约10%的临床需求得到满足22。
原代人肝细胞（PHH）常用于研究肝毒性。这些细胞可在体外培养中短期维持其特定功能。此外，单个供体所能提供的细胞数量有限，且这些细胞无法在培养中扩增，因此供体PHH的短缺仍是肝毒性研究的主要障碍。PSCs代表了一种可再生的人体组织来源，可用于生成三维肝样培养物11。
肝脏三维培养系统相较于二维培养具有多种优势，包括更短的分化时间以及更准确地模拟 体内 这些工艺能够实现对药物诱导毒性的更精确研究，更准确地预测肝脏毒性风险，并且更具成本效益23由于具有自体来源的特性，肝类球体培养物相较于原代人肝细胞（PHH）具有显著优势，可避免使用后者时存在的诸多.......
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披露
通讯作者声明其为与新型人源GPI锚定蛋白相关专利的持有者。她共同创立并就职于ACA CELL Biotech GmbH公司。其他作者声明不存在利益冲突。
致谢
作者特别感谢 Oksana 和 John Greenacre 提供的技术支持。本工作由德国海德堡 ACA CELL Biotech GmbH 资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 白蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | SAB3500217 | 鸡源性 |
| 白蛋白第五组分 | Carl Roth GmbH+Co. KG | T8444.4 | |
| 甲胎蛋白 | Proteintech Germany GmbH | 14550-1-AP | 兔多克隆IgG |
| Biolaminin 111 LN | BioLamina | LN111-02 | 人重组型 |
| CD45微珠 | Miltenyi | 130-045-801 | 纳米级磁性微珠 |
| 细胞筛 | pluriSelect | 43-10040-40 | |
| CellSens | Olympus | 成像软件 | |
| 50 mL离心管 | Greiner Bio-One | 210270 | |
| CEROplate 96孔板 | OLS OMNI Life Science | 2800-109-96 | |
| CKX53 | Olympus | ||
| 市售洗涤剂 | Procter & Gamble | 非离子型洗涤剂 | |
| CYP2E1特异性抗体 | Proteintech Germany GmbH | 19937-1-AP | 兔多克隆抗体IgG |
| CYP3A4 | Proteintech Germany GmbH | 67110-1-lg | 小鼠单克隆抗体IgG1 |
| 细胞角蛋白18 | DakoCytomation | M7010 | 小鼠单克隆抗体IgG1 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14040091 | |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | 已停产。可替换货号：TMS-013-B |
| 14 mm玻璃盖玻片 | R. Langenbrinck | 01-0014/1 | |
| GlutaMax 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | L-谷氨酰胺 |
| 25% 戊二醛 | Sigma-Aldrich | G588.2-50ML | |
| 山羊抗小鼠IgG Cy3 | Antibodies online | ABIN1673767 | 多克隆 |
| 山羊抗小鼠IgG DyLight 488 | Antibodies online | ABIN1889284 | 多克隆 |
| 山羊抗兔IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A-11008 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721-1LGL | |
| HepatoZYME-SFM | Thermo Fisher Scientific | 17705021 | 肝细胞成熟培养基 |
| HGF | Thermo Fisher Scientific | PHG0324 | 人重组型 |
| HNF4α 抗体 | Sigma-Aldrich | ZRB1457-25UL | 克隆4C19 ZooMAb Rbmono |
| 氢化可的松21-半琥珀酸酯（钠盐） | Biomol | Cay18226-100 | |
| Knock out血清替代物 - 多物种Gibco | Fisher Scientific | A3181501 | KSR |
| KnockOut DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12660012 | 已停产。可替换货号：10-828-010 |
| MACS缓冲液 | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | 磁力架 |
| MEM NEAA 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| 巯基乙醇 | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | 50 mM |
| MiniMACS柱 | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Nunclon多孔培养皿 | Sigma-Aldrich | D6789 | 4孔板 |
| 抑癌素M | Thermo Fisher Scientific | PHC5015 | 人重组型 |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| 无菌PBS | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9143.2 | |
| 青霉素/链霉素 | Biochrom GmbH | A2213 | 10000 U/ml |
| 无菌15 mL PS离心管 | Greiner Bio-One | 188171 | |
| 山羊抗鸡IgG Texas red | Antibodies online | ABIN637943 | |
| Roti Cell Iscoves MDM | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9033.1 | |
| Roti Mount FluorCare DAPI | Carl Roth GmbH+Co. KG | HP20.1 | |
| Roti Sep 1077 人用 | Carl Roth GmbH+Co. KG | 0642.2 | |
| 转甲状腺素蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | SAB3500378 | 鸡源性 |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | 1% |
参考文献
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal ....
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