实验进化群体中结构变异动态的追踪

摘要

我们开发了一种经济高效的方法，用于追踪非单核苷酸多态性等位基因的动态变化，该方法可轻松适用于实验进化过程中的冷冻样本库。通过将三重PCR技术与自动化平行毛细管电泳相结合，可在实验进化的整个过程中定量检测插入等位基因的相对频率。

摘要

结构变异（SVs）（即缺失、插入、重复和倒位）现已被证实对表型变异具有重要作用，因此在疾病决定或适应新环境等过程中也具有重要意义。然而，单核苷酸变异受到的关注远多于结构变异，这可能是因为单核苷酸变异更容易被检测，且其表型效应更易于预测。短读长和长读长深度测序技术的发展已显著提高了结构变异的检出能力，但从群体测序（poolseq）数据中定量分析其频率在技术上仍然复杂且成本较高。

本文介绍了一种相对简单且成本较低的方法，可使研究人员追踪结构变异（SV）等位基因频率的动态变化。作为应用示例，我们追踪了细菌实验进化群体中插入序列（IS）插入突变频率的变化。该方法基于在结构变异边界周围设计三引物组合，使得扩增野生型（WT）和衍生等位基因所产生的扩增子在大小上至少相差5%，同时保证两者的扩增效率相近。随后通过毛细管电泳平行检测各扩增子的产量，并依据标准曲线进行归一化定量。该方法可轻松拓展应用于其他类型结构变异（如缺失、重复和倒位）频率的定量分析，以及自然群体（包括患者体内病原体群体）的pool-seq研究。

引言

结构变异（SV）是指基因组序列的改变，通常影响50个碱基对或更多。已描述的SV可分为四类：大片段插入、大片段缺失、倒位和重复。直到最近，相较于结构变异，单核苷酸变异（SNV）在表型效应、作为疾病遗传决定因素的作用或对适应性的贡献方面受到了更多关注。这可能是因为检测SNV并预测其表型效应相对更容易。然而，短读长和长读长深度测序技术已显著提高了SV的检出能力，至少在单个个体或克隆基因组中是如此¹。与此同时，SV的表型效应也得到了更深入的表征，并已有大量文献记录了其作为人类疾病遗传决定因素^2,3或对新环境适应⁴的实例。

缺失和插入突变通常由可移动遗传元件（MGE）插入引起，其破坏性远大于单核苷酸多态性（SNPs），可导致移码突变和蛋白质结构改变。基因内部的缺失及MGE插入几乎总是导致基因失活，而插入到非编码区时，若插入序列（ISs）包含启动子或终止序列，则可能导致邻近基因的抑制或组成型表达⁵。虽然必需基因的敲除会对细菌适应性产生明显的不利影响，但在某些情况下，非必需基因的丢失反而具有优势。尽管基因重复本身存在固有的代价，但在某些条件下也可能带来益处，并参与适应过程，因其可改变基因剂量；特定蛋白质活性的增加在特定环境下可能是有....

方案

建立本实验方案需要精确掌握祖先序列中插入、缺失、倒位或重复的位置。这些信息通常通过末端或中间时间点样品的全基因组测序（WGS）获得。在以下方案中，每一步均以插入突变为例说明其基本原理，并结合一个代表性案例进行阐述：追踪大肠杆菌（E. coli）实验进化群体中mutS基因内IS10插入事件的频率变化。在该群体中，终点群体的全基因组测序结果显示，在第2,463至2,471位点之间插入了一个1,329 bp的IS10元件，导致该插入位点发生重复。本方法同样适用于其他三种结构变异类型，各类情况的具体注意事项将在讨论部分予以说明。

1. 三引物设计

1. 采用经典的引物设计原则（18-24 bp，40%-60% GC 含量，尽可能以 G/C 碱基对起始或终止，T_m 差异 < 5 °C）设计引物 FW1 和 RV1。设计引物以扩增野生型等位基因上突变等位基因插入位点附近的短片段（图1）。
   注意：扩增片段大小可在 100 bp 至 3,000 bp 范围内，需与毛细管电泳所用的 DNA 分子量标准相匹配。在本示例中，扩增了一个 155 bp 的片段。此处选择的小片段尺寸可防止对完整的 IS10 插入序列进行非特异性扩增（见第 2 节）。
2. 在插入序列内部设计第二个正向引物 FW2，以产生第二个扩....

结果

利用从 S2.11 群体第 1,000 代分离得到的祖先克隆和高突变克隆中提取的 DNA，我们建立了如图 2所示的校准曲线。通过毛细管电泳并行仪器测定的实验室制备 DNA 混合物中的实际突变体比例之间呈现出线性关系，斜率为 1.0706，R² 为 0.9705。此外，生物学重复之间具有良好的一致性；在校准曲线的九个数据点中，标准差介于 0.61 至 17.74 之间。

讨论

在此，我们提出了一种经济高效的方法，可用于追踪实验进化群体中新出现的适应性结构变异（SV）等位基因的动态变化。该方法结合了经典的PCR技术与自动化并行毛细管电泳，能够测定两个等位基因的相对含量。方法建立后，可并行对大量样本中的等位基因比例进行定量，且成本远低于全基因组测序（WGS）。该方法可视为非SNP突变检测中与扩增子测序相当的技术。 以及作为解决大SV扩增子测序技术局限性的方案。我们已证明，该方法利用可克服PCR偏好性的校准曲线，能够准确量化非SNP突变体的比例。图2).

表征结构变异等位基因的动态变化有助于通过其平行的时间动态识别连锁突变，或计算选择系数并鉴定其随时间的变化。在本文所展示的应用实例中，我们通过终点全基因组测序（WGS）发现，高突变表型个体在多个实验进化的 E. coli 种群中处于分离或固定状态¹⁸。这些种群被视为高突变表型，因其在甲基化错配修复（MMR） 基因之一中存在破坏性突变（插入序列IS插入），并且在1,00.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96 孔裙边 PCR 板	4titude	4Ti - 0740	PCR
分子生物学级琼脂糖	Eurogentec	EP-0010-05	琼脂糖凝胶电泳
Agilent DNF-474 HS NGS 片段分析试剂盒（用于 Fragment Analyzer 系统）快速指南	Agilent		PDF 操作指南
TBE 缓冲液	Panreac appliChem	A4228,5000Pc	琼脂糖凝胶电泳
校准型一次性接种环和接种针	LABELIANS	8175CSR40H	细菌培养
DNeasy 血液与组织提取试剂盒	Qiagen	69506	DNA 提取
电泳电源	Amilabo	ST606T	琼脂糖凝胶电泳
Fragment Analyzer 自动化毛细管电泳系统	Agilent		并行毛细管电泳
片段 DNA 标准分子量标记物	Agilent	DNF-396，范围 1–6000 bp	并行毛细管电泳
硫酸庆大霉素盐生物试剂	Sigma-Aldrich	G1264-1G	细菌培养
高灵敏度稀释标记物	Agilent	DNF-373	并行毛细管电泳
高灵敏度 NGS 定量分析试剂盒	Agilent	DNF-474	并行毛细管电泳
Ladder 快速上样 1 kb Plus DNA 标准分子量标记物	NEB	N0469S	琼脂糖凝胶电泳
LB 肉汤，VegitoneNutriSelect Plus	Millipore	28713	细菌培养
Phusion Flash 高保真 PCR 预混液	Thermo Fisher Scientific	F548L	PCR
引物	Eurogentec		PCR
Prosize 数据分析软件 v.4	Agilent	V.4	并行毛细管电泳
Qubit 检测试剂	Invitrogen	MAN0010876	DNA 定量
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒	LIFE TECHNOLOGIES SAS	Q32854	DNA 定量
PCR 仪（热循环仪）	Eppendorf	Ep gradients	PCR
UV 凝胶成像系统，eBOX VX5	Vilber Lourmat		琼脂糖凝胶电泳可视化
注射用配制用水	Aguettant	PROAMP	PCR