本方案描述了病毒载体的导管内注射方法 通过 乳头，以将目的基因递送至乳腺上皮细胞。
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本文内容
摘要
摘要
小鼠乳腺由导管树组成，其内衬有上皮细胞，并在每个乳头尖端有一个开口。上皮细胞在乳腺功能中起主要作用，也是大多数乳腺肿瘤的起源。将目的基因导入小鼠乳腺上皮细胞是评估基因在上皮细胞中功能以及建立小鼠乳腺肿瘤模型的关键步骤。该目标可通过将携带目的基因的病毒载体经乳腺导管内注射至小鼠乳腺导管树中实现。注射后的病毒会感染乳腺上皮细胞，从而导入目的基因。所用病毒载体可以是慢病毒、逆转录病毒、腺病毒或腺相关病毒（AAV）。本研究展示了如何通过小鼠乳腺导管内注射病毒载体将目的基因递送至上皮细胞。使用携带GFP的慢病毒以展示递送基因的稳定表达，使用携带Erbb2（HER2/Neu）的逆转录病毒以展示由癌基因诱导的非典型增生性病变及乳腺肿瘤。
引言
乳腺的上皮细胞在腺体功能中起主要作用，并且是乳腺癌发生的主要起源细胞。在乳腺生物学和肿瘤发生研究中，常需将目的基因导入这些细胞。每侧小鼠乳腺由上皮细胞排列形成的导管树构成，导管树在乳头尖端处具有单一开口。该结构使得乳腺上皮细胞易于接触病毒载体，后者可被直接递送至导管树的管腔内。 通过 导管内注射1.
乳腺管内注射技术最初用于山羊、兔子和大鼠等体型较大的动物1。对于小鼠这类体型较小的动物，管内注射需要许多精细的工具以及操作者经过更多训练。小鼠管内注射有两种方法：一种是经乳头开口向上注射1，另一种是在手术暴露第3或第4对乳腺主乳腺管后进行直接注射1。由于前者在操作者经过良好训练后具有无创性和操作快速的优点，因此该方法更为常用，本文将对此技术进行详细描述。
与广泛使用的传统转基因小鼠模型相比，通过受精卵显微注射引入目的基因的方法2,3,4，经导管病毒注射递送基因具有诸多优势，包括：（1）避免了为每个目的基因建立转基因小鼠品系所耗费的长时间过程；（2）避免了目的基因可能对乳腺正常发育造成的干扰；（3）可在出生后的任意时间点引入目的基因；（4）可轻松共递送多个目的基因；（5）更接近自然的肿瘤发生过程，因为被感染并携带癌基因的细胞周围存在正常细胞；（6）结合TVA（肿瘤病毒A，一种禽类细胞表面蛋白，也是逆转录病毒RCAS载体的受体）技术5，可将目的基因特异性地导入特定细胞群体，从而研究肿瘤发生的细胞起源，并在乳腺组织中进行细胞谱系示踪分析6,7,8,9。
可使用源自逆转录病毒10、慢病毒11，12、腺病毒13以及腺相关病毒（AAV）14的任何载体进行遗传物质的导管内递送。逆转录病毒和慢病毒载体可永久整合到宿主基因组中，因此能够将目的基因稳定地导入乳腺上皮细胞。慢病毒可在其接触的任何细胞中实现基因组整合15，而逆转录病毒的高效基因组整合则需要靶细胞处于增殖状态16。腺病毒和AAV载体不会整合到感染细胞的基因组中，因此仅能实现目的基因的瞬时表达17，18。当目的基因仅需短时间表达时，这一特性可能具有优势，例如使用Cre重组酶删除两侧带有loxP位点的肿瘤抑制基因。
慢病毒、腺病毒和腺相关病毒（AAV）可感染其接触到的任何小鼠细胞。但由于管腔上皮层与基底层之间存在较大隔离，而基底层又通过基底膜与间质层相分离，因此导管内注射可将感染主要限制在乳腺癌主要起源细胞——管腔上皮细胞。在该管腔上皮层内，还存在多种不同的细胞亚型，包括干细胞、前体细胞以及多类分化细胞。为了特异性感染管腔细胞群体中的特定细胞亚群，可采用TVA技术：该技术利用源自禽白血病病毒的RCAS载体5,10或假型化的慢病毒载体11，选择性感染那些在细胞类型特异性启动子（例如仅在干细胞6、特定前体细胞6,7、腺泡细胞8或Wnt信号通路激活细胞9中具有活性的启动子）驱动下表达tva转基因的小鼠体内的TVA表达细胞。
本方案介绍了通过乳腺导管内注射病毒载体将目的基因导入乳腺上皮细胞的技术。随后展示了导入基因的表达检测，以及由此产生的增生性病变和肿瘤的观察方法。
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方案
所有使用小鼠的操作均按照机构动物护理和使用委员会批准的动物实验方案进行。本研究使用了9至12周龄的FVB/N或MMTV-tva雌性小鼠。小鼠来自商业购买或自行培育（见材料表）。实验中使用了Lenti-EGFP（FUCGW）和RCAS-Erbb2 (Neu)病毒。病毒制备及滴定测定均参照已发表的文献方法10,12。
1. 注射器准备
- 将33 G金属针头（参见材料表）剪成约1 cm长。将针头和50 µL注射器在高压灭菌后置于70%酒精中保存。
- 从酒精中取出注射器和针头，推动注射器将残留的酒精排出。拆开注射器，放置于经高压灭菌的吸水垫上晾干。
- 干燥后重新组装注射器。
2. 病毒制备
- 根据需要从 -80 ˚C 冰箱中取出一个或多个病毒储存管，在冰上融化病毒。
注意：根据待感染细胞的数量，此时可能需要用 1× PBS 将病毒稀释至所需的滴度。 - 将移液器吸头插入溴酚蓝粉末中约 1 cm 深度以沾取溴酚蓝（参见材料表），然后将附着的微量溴酚蓝加入病毒悬液中。
注意：本研究中，病毒储存液通常每管为 200 µL，因此最终染料浓度约为 0.2%（0.2 µg/100 µL）。溴酚蓝应使用微波辐射在 1250 W 高功率下灭菌 45 秒 （参见 材料表）。整个操作过程须在无菌环境中进行。 - 通过上下吹打 10 次，将溴酚蓝与病毒溶液充分混匀。
- 将病毒置于冰上，并将冰桶带至动物实验房。
3. 动物准备
- 通过腹腔注射 2 µL/g 麻醉剂（37.6 mg/mL 氯胺酮、1.92 mg/mL 赛拉嗪和 0.38 mg/mL 乙酰丙嗪，参见 材料表）。通过夹捏脚趾检查麻醉深度。在眼睛上涂抹眼膏以防止麻醉期间眼睛干燥。
注意：小鼠的脚趾必须无反应 在良好麻醉条件下进行夹捏。也可使用异氟烷对小鼠进行麻醉。 - 将小鼠仰卧置于温热垫上，并用胶带将其四肢固定在实验台上。
- 确定一个（或多个）需注射的乳头（本研究推荐选择第4对）。使用剪刀修剪周围毛发以暴露乳头。
- 应用 对乳头区域用70%酒精和碘伏棉签擦拭三遍 清洁并暴露乳头。
4. 病毒的导管内注射
注意：可使用放大灯帮助观察乳头开口。
- 使用无菌的 显微解剖弹簧剪横切乳头远端尖部，直至在放大灯下可见一个小的中央导管开口（参见材料表）。
- 将10 µL病毒/溴酚蓝混合液吸入注射器中。
注：本实验演示中使用Lenti-EGFP（FUCGW）和RCAS-Erbb2 (Neu)。 - 在放大灯辅助下，小心将针头插入乳头开口处。轻微调整针头方向，从内侧向外侧倾斜，以与主导管对齐。
- 将全部10 µL病毒液注入导管系统。
注：若注射成功，皮下导管应变为蓝色。若遇到阻力或出现局部颜色改变，则提示注射失败。 - 将小鼠置于设定为45 °C的载玻片加热器上，直至小鼠完全苏醒（约30–60分钟）。
5. 使用荧光体视显微镜检测感染细胞
- 注射携带GFP或其他荧光基因的病毒后3至5天，以每克体重4 µL的麻醉剂（37.6 mg/mL氯胺酮、1.92 mg/mL赛拉嗪和0.38 mg/mL乙酰丙嗪）过量注射，处死小鼠。
- 打开胸腔。使用剪刀沿腹侧中线以及上下肢剪开皮肤。提起皮肤，暴露乳腺组织。
- 使用镊子和剪刀将注射过的乳腺组织从皮肤上分离并取出。同时取出未注射的乳腺组织作为对照。
- 将乳腺组织置于载玻片上，并将其展开至原有形态。
- 在荧光体视显微镜下观察并成像乳腺组织。
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结果
本文展示了代表性数据，以证明导管内注射成功、病毒感染成功以及递送基因对乳腺肿瘤发生的影响。注射病毒的量必须根据每个实验的具体目的进行调整。为了说明乳腺导管树可被感染的范围，需要使用携带可成像基因（如GFP）的大量病毒。另一方面，为了模拟自然发生的自发性肿瘤形成过程，必须使用少量携带癌基因的病毒，从而使少数细胞被感染，并在 otherwise 完全正常的乳腺组织区域内逐步发展为癌前病变，最终形成侵袭性癌症。
通过暴露乳腺并观察到蓝色的导管树，可立即确认导管内注射的成功图1。注射Lenti-后两到五天EGFP (FUCGW) 病毒（约106 IUs12，可通过整体封片制备后在荧光体视显微镜下观察来评估乳腺上皮细胞的感染情况（图2）或者，用于分析病毒表达的荧光蛋白或细胞表面标志物的流式细胞术6,
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讨论
本文演示了通过病毒导管内注射技术将基因导入小鼠乳腺上皮细胞，以建立散发性乳腺癌模型的方法。通常选择至少5周龄或更年长的小鼠进行注射，以确保在乳腺发育完成后才启动致癌过程。此外，小于5周龄的小鼠乳头开口通常过小，难以实施注射。另一方面，过老小鼠的乳头有时会发生退化，横切后可能无法暴露导管开口。还需要注意的是，某些转基因或基因敲除肿瘤模型小鼠由于生殖系基因突变导致乳腺发育异常，其乳头也可能难以注射。
除了在操作病毒时需规范使用标准的个人防护装备（PPE）外，还必须注意避免实验人员手部发生意外的针刺伤。尽管目前尚无禽白血病病毒可感染人类的证据，但用于啮齿类动物癌症建模的慢病毒同样可能感染人类。当病毒携带强效的癌基因时，防止意外感染的防护措施尤为重要25。
当需要将多个目的基因导入上皮细胞时，可通过携带各个基因的不同载体混合物进行递送，或使用设计为携带所有待测基因的单一载体进行递送。前一种方法可利用已构建好的病毒，但共感染仅发生在被感染细胞群体中的少数细胞中。而后者通常需要构建新的病毒，...
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披露
两位作者均声明不存在利益冲突。
致谢
感谢 Gary Chamness 博士对本文手稿提出的宝贵意见。本研究由美国国防部（DOD）CDMRP 项目 BC191649（YL）和 BC191646（YL）以及美国国立卫生研究院（NIH）CA271498（YL）资助。作者谨此感谢由 SPORE P50CA186784 支持的乳腺中心病理学核心设施，以及在 Joel M. Sederstrom 协助下由 CPRIT-RP180672、NIH CA125123 和 RR024574 支持的细胞计量与细胞分选核心设施。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗HA抗体 | Covance | MMS-101P | 稀释比例：1 : 1000 |
| 人工泪液 | Covetrus | NDC 11695-0832-1 | |
| 溴酚蓝 | Sigma | B5525 | 在1250W微波炉中高火微波辐射45秒 |
| FACSCantoII | BD Biosciences | V96100899 | |
| 荧光体视显微镜 | Leica | MZ16 FA | |
| FUCGW慢病毒 | 自制 | N/A | 参见参考文献#12 |
| FVB/N | The Jackson Laboratory | JAX:001800 | |
| Hamilton针头 | Hamilton | 91033 | 已高压灭菌 |
| Hamilton注射器 | Hamilton | 201000 | 已高压灭菌 |
| LED放大灯 | Intertek | 3165273 | |
| 显微解剖弹簧剪 | Roboz | RS-5621 | 已高压灭菌 |
| MMTV-tva | 自制 | 参见参考文献#10 | |
| RCAS-Neu (HA) | 自制 | N/A | 参见参考文献#10 |
| 啮齿类动物复合麻醉剂III | 兽药房 | 兽医处方 | 37.6 mg/mL氯胺酮，1.92 mg/mL赛拉嗪，和0.38 mg/mL乙酰丙嗪 |
参考文献
- Nguyen, D. -A., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. Eds Margot. Ip, M. M., Asch, B. B. , Springer US. 259-270 (2000).
- Gordon, J. W., Ruddle, F. H. Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei. Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).
- Costantini, F., Lacy, E. Introduction of a rabbit beta-globin gene into the mouse germ line. Nature. 294 (5836), 92-94 (1981).
- Brinster, R. L., et al. Somatic expression of herpes thymidine kinase in mice following injection of a fusion gene into eggs. Cell. 27 (1), 223-231 (1981).
- Du, Z., Li, Y. RCAS-TVA in the mammary gland: an in vivo oncogene screen and a high fidelity model for breast transformation. Cell Cycle. 6 (7), 823-826 (2007).
- Bu, W., et al. Mammary precancerous stem and non-stem cells evolve into cancers of distinct subtypes. Cancer Research. 79 (1), 61-71 (2019).
- Bu, W., et al. Keratin 6a marks mammary bipotential progenitor cells that can give rise to a unique tumor model resembling human normal-like breast cancer. Oncogene. 30 (43), 4399-4409 (2011).
- Haricharan, S., et al. Contribution of an alveolar cell of origin to the high-grade malignant phenotype of pregnancy-associated breast cancer. Oncogene. 33 (50), 5729-5739 (2014).
- Bu, W., Zhang, X., Dai, H., Huang, S., Li, Y. Mammary cells with active Wnt signaling resist ErbB2-induced tumorigenesis. PLoS One. 8 (11), 78720(2013).
- Du, Z., et al. Introduction of oncogenes into mammary glands in vivo with an avian retroviral vector initiates and promotes carcinogenesis in mouse models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17396-17401 (2006).
- Siwko, S. K., et al. Lentivirus-mediated oncogene introduction into mammary cells in vivo induces tumors. Neoplasia. 10 (7), 653-662 (2008).
- Bu, W., Xin, L., Toneff, M., Li, L., Li, Y. Lentivirus vectors for stably introducing genes into mammary epithelial cells in vivo. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 14 (4), 401-404 (2009).
- Russell, T. D., et al. Transduction of the mammary epithelium with adenovirus vectors in vivo. Journal of Virology. 77 (10), 5801-5809 (2003).
- Wagner, S., Thresher, R., Bland, R., Laible, G. Adeno-associated-virus-mediated transduction of the mammary gland enables sustained production of recombinant proteins in milk. Scientific Reports. 5, 15115(2015).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
- Mitani, K., Kubo, S. Adenovirus as an integrating vector. Current Gene Therapy. 2 (2), 135-144 (2002).
- McCarty, D. M., Young, S. M., Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annual Review of Genetics. 38, 819-845 (2004).
- Bu, W., Li, Y. Intraductal injection of lentivirus vectors for stably introducing genes into rat mammary epithelial cells in vivo. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 389-396 (2020).
- Dong, J., et al. Genetic manipulation of individual somatic mammary cells in vivo reveals a master role of STAT5a in inducing alveolar fate commitment and lactogenesis even in the absence of ovarian hormones. Developmental Biology. 346 (2), 196-203 (2010).
- Haricharan, S., et al. Mechanism and preclinical prevention of increased breast cancer risk caused by pregnancy. eLife. 2, 00996(2013).
- Reddy, J. P., et al. Defining the ATM-mediated barrier to tumorigenesis in somatic mammary cells following ErbB2 activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3728-3733 (2010).
- Dong, J., et al. The PR status of the originating cell of ER/PR-negative mouse mammary tumors. Oncogene. 35 (31), 4149-4154 (2016).
- Young, A., et al. Targeting the pro-survival protein BCL-2 to prevent breast cancer. Cancer Prevention Research. 15 (1), 3-10 (2022).
- Schlimgen, R., et al. Risks associated with lentiviral vector exposures and prevention strategies. Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).
- Holloway, K. R., et al. Krt6a-positive mammary epithelial progenitors are not at increased vulnerability to tumorigenesis initiated by ErbB2. PLoS One. 10 (1), 0117239(2015).
- Holloway, K. R., et al. Targeting oncogenes into a defined subset of mammary cells demonstrates that the initiating oncogenic mutation defines the resulting tumor phenotype. International Journal of Biological Sciences. 12 (4), 381-388 (2016).
- Hein, S. M., et al. Luminal epithelial cells within the mammary gland can produce basal cells upon oncogenic stress. Oncogene. 35 (11), 1461-1467 (2015).
- Annunziato, S., et al. In situ CRISPR-Cas9 base editing for the development of genetically engineered mouse models of breast cancer. EMBO Journal. 39 (5), 102169(2020).
- Annunziato, S., et al. Modeling invasive lobular breast carcinoma by CRISPR/Cas9-mediated somatic genome editing of the mammary gland. Genes & Development. 30 (12), 1470-1480 (2016).
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