小鼠脉络丛的显微切割和全安装扫描电子显微镜可视化

Summary

脉络丛（CP）是神经科学中研究不足的组织，在中枢神经系统的健康和疾病中起着关键作用。该协议描述了用于分离CP的显微切割技术，并使用扫描电子显微镜来获得其细胞结构的整体视图。

Abstract

脉络丛（CP）是一种突出到脑室的高度血管化结构，是神经科学中最缺乏研究的组织之一。随着越来越清楚的是，这种微小的结构在中枢神经系统（CNS）的健康和疾病中起着至关重要的作用，因此以允许下游处理的方式正确解剖脑室CP至关重要，从功能到结构分析。这里描述了侧脑室和第四脑室小鼠CP的分离，而无需专门的工具或设备。这种分离技术保留了CP内细胞的活力，功能和结构。由于其高血管化，可以使用双目显微镜可视化漂浮在大脑心室腔内的CP。然而，下游分析所需的经心灌注会使 CP 组织的鉴定复杂化。根据进一步的处理步骤（例如，RNA和蛋白质分析），这可以通过经心灌注溴酚蓝 可视化 CP来解决。分离后，可以使用多种技术（包括RNA，蛋白质或单细胞分析）处理CP，以进一步了解这种特殊大脑结构的功能。在这里，整个安装CP上的扫描电子显微镜（SEM）用于获得结构的整体视图。

Introduction

紧密的屏障将中枢神经系统 （CNS） 与外围隔离开来，包括血脑屏障 （BBB） 和血脑脊液 （CSF） 屏障。这些屏障保护中枢神经系统免受外部侮辱，并确保平衡和受控的微环境¹，^2，3。虽然BBB随着时间的推移得到了广泛的研究，但位于脉络丛（CP）的血液 - 脑脊液屏障在过去十年中才获得了越来越多的研究兴趣。后一种屏障可以在大脑的四个脑室中找到（图1A，B），其特征在于围绕中央基质的单层脉络丛上皮（CPE）细胞，渗漏的毛细血管，成纤维细胞以及淋巴和骨髓细胞群（图1C）⁴，^5，6.CPE细胞通过紧密的连接牢固地相互连接，从而防止从下面的开窗毛细血管渗漏到脑脊液和大脑中。此外，通过CPE细胞的运输受到许多向内和向外运输系统的调节，这些系统管理有益化合物（例如，营养物质和激素）从血液流入脑脊液以及有害分子（例如，代谢废物，过量的神经递质）在^{另一个方向的}外排1^，<....

Protocol

本研究中描述的所有动物实验均根据国家（比利时法律14/08/1986和22/12/2003，比利时皇家法令06/04/2010）和欧洲立法（欧盟指令2010/63 / EU，86/609 / EEC）进行。所有关于小鼠和动物实验方案的实验均已获得根特大学伦理委员会的批准（许可证号LA1400091和EC 2017-026）。

1. 准备

1. 麻醉药:准备终末麻醉药。例如，可以制备磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的戊巴比妥钠（≥100mg / kg）溶液。
2. 经心灌注溶液:制备10mL（每只小鼠）PBS/肝素（含0.2%肝素）溶液，补充有0.5%溴酚蓝。
   注意:如果下游处理步骤允许（例如，在RNA和蛋白质分析的情况下），可以通过溴酚蓝经心灌注 可视化 脉络丛（CP）。如果溴酚蓝与进一步的处理步骤（例如，用于成像）不相容，请使用PBS/肝素进行灌注。
3. 准备 SEM 分析所需的解决方案。
   1. 制备0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.4）。在0.1M二甲胂酸钠缓冲液中制备2%多聚甲醛和2.5%戊二醛的溶液。每个样品制备 20 mL 该溶液。
   2. 在 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液（每个样品 5 mL）中制备 2% 四氧化锇。
   3. 准备 50%、70%、85% 和 100% 乙醇溶液。每个样品制备 5 mL 的每种 EtOH 溶液。<....

Results

所描述的方案有助于将CP与小鼠脑侧（图2A-C）和第四（图2D-F）心室有效分离。分离整个大脑后，使用镊子对大脑进行骨状半球化，并识别漂浮在侧脑室中的CP。来自第四脑室的CP可以从大脑的小脑侧分离出来。溴酚蓝灌注可用于可视化CP（图2A，D）;然而，当在进一步的处理步骤中不允许溴酚蓝时，可以进行PBS /肝素灌注（图2C，F）或不灌注（图2B，E）。将CP从脑室中分离出来后，可以对组织进行一整套分析。其中包括基因表达谱 （RT-qPCR）²⁸、细胞类型谱分析（流.......

Discussion

这里描述了一种将脉络丛（CP）从小鼠大脑的侧脑室和第四脑室中分离出来的方法。CP 的整个安装方法有助于使用一系列技术进行进一步分析，以获得 CP 形态、细胞组成、转录组、蛋白质组和分泌组的完整视图。这种分析对于更好地了解从大脑脑室突出的这种显着结构至关重要。这些知识具有巨大的研究兴趣，因为越来越清楚的是，CP在健康和疾病中起着至关重要的作用⁹，10，¹¹，12，^13，14，¹⁵，^16，17，18。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
26G x 1/2 针	Henke Sass Wolf	4710004512
铝制标本支架	EM Sciences	75220
二甲胂酸盐缓冲液	EM Sciences	11652
碳钢手术刀片	Swann-Morton	0210	尺寸：0.45 毫米 x 12 毫米
碳胶片 -12 毫米	EM Sciences	77825-12
临界点干燥机	Bal-Tec	CPD030
Crossbeam 540	蔡司		SEM 系统
镊子	Fine Science Tools GmbH	91197-00
戊二醛	EM Sciences	16220
肝素	Sigma-Aldrich	H-3125
Ismatec Reglo ICC 数字蠕动泵 2 通道	瑞士万通比利时 N.V	CPA-7800160
四氧化二锇	EM Sciences	19170
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Lonza	BE17-516F
铂金	仲裁	Q150T ES	PBS 不含 Ca++ Mg++ 或酚红;无菌过滤
戊巴比妥钠	Kela NV	514
不锈钢标本篮	EM Sciences	70190-01
Stemi DV4 体视显微镜	蔡司
手术剪刀	Fine Science Tools GmbH	编号：91460-11