方法文章

利用荧光 原位 杂交探索卵巢细胞中的X染色体畸变

DOI：

10.3791/64734

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2023年4月7日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Radboudumc, 2Department of Pediatrics, Radboudumc, Amalia Children’s Hospital, 3Department of Reproductive Medicine, Nij Geertgen Center for Fertility

本文内容

摘要

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本文提出了两种基于荧光 原位 杂交的方法，以确定X染色体畸变女性非移植和移植卵巢皮层组织中卵巢细胞的X染色体含量。

摘要

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全世界有数百万人处理有关生育的问题。生育能力下降，甚至不孕症，可能是由于许多不同的原因，包括遗传性疾病，其中染色体异常是最常见的。荧光 原 位杂交（FISH）是检测人类染色体畸变的众所周知且常用的方法。FISH主要用于分析具有数值或结构染色体畸变的雄性精子中的染色体异常。此外，该技术也经常应用于女性，以检测已知会导致卵巢发育不良的X染色体畸变。然而，仍然缺乏关于淋巴细胞和/或颊细胞中X染色体畸变的女性卵巢细胞的X染色体含量的信息。

本研究的目的是通过提出两种基于FISH的方法来鉴定卵巢细胞的X染色体含量，从而推进有关女性X染色体畸变的基础研究。首先，描述了一种测定X染色体畸变女性非移植卵巢皮层组织中分离的卵巢细胞（卵母细胞，颗粒细胞和基质细胞）的X染色体含量的方法。第二种方法旨在通过确定卵巢组织中新形成的二级和窦卵泡的卵巢细胞的X染色体含量来评估染色体畸变对卵泡发生的影响，这些卵巢组织中来自长期移植到免疫功能低下小鼠后具有X染色体畸变的雌性。这两种方法都可能有助于未来的研究，以深入了解具有X染色体畸变的女性的生殖潜力。

引言

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不孕症是男性或女性生殖系统的健康问题，影响全世界约1.86亿育龄人1。在至少35%的不孕夫妇中，不孕症是由女性生殖系统疾病引起的2。导致女性不孕的因素很多，如遗传因素、生殖道异常、内分泌功能障碍、炎症性疾病、医源性治疗等3。

遗传异常存在于大约 10% 的不育女性中4，5。在所有遗传异常中，X染色体畸变是卵巢发育不全的最常见原因2。一些研究报告，患有特纳综合征 （TS） 或三重 X 综合征的女性的 X 染色体畸变与生殖细胞加速丢失或卵子生成受损导致的卵巢早衰有关6，7，8。

X染色体畸变可分为:1）数值畸变，其中X染色体数量不同但X染色体完整;2）结构畸变，其中X染色体获得或失去遗传物质3，9。X染色体的数值畸变比结....

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方案

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特纳生育研究方案已获得涉及人类受试者研究的中央委员会（NL57738.000.16）的批准。本研究共获取93例TS女性卵巢皮层组织。需要安全预防措施的材料列于 表1中。

表 1:安全预防措施。

材料危险
醋酸严重的皮肤灼伤和呼吸系统刺激
胶原 酶刺激眼睛、呼吸系统和皮肤
达皮刺激眼睛、呼吸系统和皮肤
脱氧核糖核酸酶 I刺激眼睛、呼吸系统和皮肤
乙醇高度易燃
甲醛

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结果

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移植前分离卵巢细胞上的 FISH
使用具有45，X / 46，XX（患者A）或45，X / 46，XX / 47，XXX（患者B）TS的女性冷冻保存的卵巢皮层组织来说明使用该协议的结果。在患者A中，50%的淋巴细胞具有45，X核型，50%具有46，XX。在患者B中，38%的淋巴细胞为45，X，28%为46，XX，34%为47，XXX。X号染色体（绿色）和18号染色体的着丝粒特异性探针作为对照（红色）用于确定从未接受异种移植的TS患者的卵巢皮层组织中分离的单个颗粒细胞，基质细胞和卵母细胞的X染色体含量（图1）。

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图1:移植前从卵巢皮层组织中分离的卵巢细胞的FI.......

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讨论

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FISH 分析是一种众所周知的技术，用于检测男性和女性淋巴细胞或颊细胞中的 X 染色体畸变10.一些研究已经描述了FISH对X染色体畸变的男性配子的影响，但FISH获得的关于X染色体畸变女性卵巢细胞的详细信息仍然缺乏14。本文提出了基于FISH的新方法，以确定X染色体畸变女性的非移植和移植卵巢皮层组织的卵巢细胞中是否存在非整倍性。

在非移植卵巢皮层组织中分离单个卵巢细胞的方案的主要挑战在于组织的酶消化，这需要事先进行一些练习。为了获得足够的卵巢细胞的准确FISH信号，重要的是要严格遵循有关酶消化，孵育时间和指示温度的步骤。在此过程中，偏离方案会导致卵巢细胞大量损失，对于卵巢储备已经较低的患者尤其应避免这种情况。该方法的另一个关键步骤是用胰蛋白酶处理纯化的原始卵泡，以防止卵母细胞和颗粒细胞团聚集，从而排除了对单个细胞的分析。如果不用胰蛋白酶处理，可以通过FISH可靠分析的单个颗粒细胞的数量会严重减少。

对长期移植后取出的卵巢皮层组织.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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作者感谢Marjo van Brakel，Dominique Smeets，Guillaume van de Zande，Patricia van Cleef和Milan Intezar的专业知识和技术援助。资金来源:默克雪兰诺（A16-1395），Goodlife和Ferring。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙酸Biosolve BV0001070602BS
离心机 1200Hettich Universal4140
胶原酶 ISigma131470
盖玻片VWR0631-0146
DAPI载体H-1200
DNase I罗氏10104159001
杜尔贝科s 磷酸盐缓冲盐水 龙沙BE17-513Q
EDTA默克108421
曙红-YSigma1159350100
乙醇EMSURE1009832500
胎牛血清 （FBS）生命技术10100147
用于切片的荧光显微镜 DM4 B徕卡显微系统 
荧光显微镜范围 A1蔡司 AXIO
解离细胞的荧光标记探针雅培诊断CEPX （DXZ1） 05J1023
CEP18 （D18Z1） 05J0818
组织切片荧光标记探针雅培诊断CEP X （DXZ1 05J08-023
CEP 18 （D18Z1）  05J10-028
甲醛Sigma252549
葡萄糖Merck108337
胶 （Fixogum）徕卡显微系统LK071A
苏木精Sigma1159380025
杂交缓冲液Abott Diagnostics32-804826/06J67-001
杂交站 DakoS2451
盐酸Merck1003171000
图像处理软件 单个卵巢皮质细胞 （Cytovision 7.7）Leica Biosystems
石蜡切片图像处理软件 Leica Application Suitex （3.7.5.24914）
免疫组织化学显微镜载玻片DakoK802021-2
L15Lonza12-700Q
Liberase DHRoche05 401 151 001
光学显微镜蔡司西德
镁默克A335586
甲醇霍尼韦尔14262-1L
封固剂Vectashield， VectorH-1000
Nonidet P40Sigma7385-1L
石蜡Poth Hile2712.20.10
胃蛋白酶SigmaP7000-25G
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）Gibco11530546
塑料移液管CooperSurgical7-72-4075/1
氯化钾 Merck1049361000
蛋白酶 KQiagen19131
旋转切片机 HM 355SThermo 舞台
手术刀Dahlhausen11.000.00.515
用于分离细胞上 FISH 的载玻片Thermo ScientificJ1810AM1JZ
氢钠Sigma55761-500G
标准柠檬酸钠 （SSC）Fisher Scientific， Invitrogen10515203
Stereomicroscope IX 70奥林巴斯
靶标检索解决方案   DakoGV80511-2
蛋白酶SigmaT4799
吐温-20ThermoFisher85113
二甲苯BOOM760518191000
用于 硫酸 碳酸胰

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vander Borght, M., Wyns, C. Fertility and infertility: Definition and epidemiology. Clinical Biochemistry. 62, 2-10 (2018).
  2. Yatsenko, S. A., Rajkovic, A. Genetics of human female infertility. Biology of Reproduction. 101 (3), 549-566 (2019).
  3. Yahaya, T. O., et al....

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标签

FISH

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