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方法文章

利用荧光原位杂交技术探索卵巢细胞中的X染色体异常

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DOI：

10.3791/64734

⸱

2023年4月7日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Radboudumc, 2Department of Pediatrics, Radboudumc, Amalia Children’s Hospital, 3Department of Reproductive Medicine, Nij Geertgen Center for Fertility

本文内容

摘要

本文介绍了两种基于荧光的方法 原位 通过杂交技术测定染色体异常女性非移植及移植卵巢皮质组织中卵巢细胞的X染色体含量。

摘要

全球数百万人面临生育问题。生育能力下降甚至不孕可能由多种不同原因引起，其中包括遗传性疾病，而染色体异常是最常见的遗传因素。荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）是一种广为人知且常用的技术，用于检测人类染色体的异常。FISH 主要用于分析携带数目或结构染色体异常的男性精子细胞中的染色体畸变。此外，该技术也常用于女性，以检测已知可导致卵巢发育不全的 X 染色体异常。然而，目前仍缺乏关于在淋巴细胞和/或颊细胞中存在 X 染色体异常的女性其卵巢细胞中 X 染色体组成的相关信息。

本研究旨在通过两种基于FISH的技术来鉴定卵巢细胞中的X染色体内容，从而推进关于女性X染色体异常的基础研究。首先，描述了一种用于确定携带X染色体异常的女性未移植卵巢皮质组织中分离出的卵巢细胞（卵母细胞、颗粒细胞和基质细胞）X染色体组成的方法。第二种方法旨在通过分析携带X染色体异常的女性卵巢组织在长期移植至免疫缺陷小鼠后新形成的次级卵泡和腔状卵泡中卵巢细胞的X染色体组成，评估染色体异常对卵泡发生的影响。这两种方法在今后的研究中可能有助于深入了解X染色体异常女性的生殖潜力。

引言

不孕症是影响男性或女性生殖系统的一种健康问题，全球约有1.86亿育龄人群受其困扰1。在至少35%的不孕夫妇中，不孕原因是女性生殖系统疾病2。导致女性不孕的因素有很多，包括遗传因素、生殖道异常、内分泌功能障碍、炎症性疾病以及医源性治疗3。

大约10%的不孕女性存在遗传异常4,5。在所有遗传异常中，X染色体畸变是卵巢发育不全最常见的原因2。多项研究报道，患有特纳综合征（TS）或三X综合征女性的X染色体畸变与卵泡过早衰竭有关，其原因是生殖细胞加速丢失或卵子发生受损6,7,8。

X染色体的畸变可分为两类：1）数目畸变，即X染色体的数量异常，但X染色体本身结构完整；2）结构畸变，即X染色体获得了或丢失了遗传物质3,9。X染色体的数目畸变更常见于结构异常，通常由细胞分裂过程中发生的自发性错误所致3,9。若此类错误发生在减数分裂过程中，可能导致非整倍体配子的产生，最终使后代所有细胞均出现染色体畸变。若染色体缺陷是在个体发育早期有丝分裂过程中出错所致，则可能导致嵌合现象。在这些个体中，同时存在X染色体组成正常的细胞和具有X染色体畸变的细胞。

20世纪80年代，一种名为荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）的细胞遗传学技术被开发出来，用于在中期和间期染色体上可视化并定位特定的核酸序列10,11。该技术利用荧光标记的DNA探针与染色体中的特定序列结合，然后通过荧光显微镜进行观察。

如今，FISH 被广泛用作临床诊断工具，被认为是检测染色体畸变的金标准10。在生殖医学领域，已利用精子的 FISH 分析来研究体细胞中存在数目或结构染色体畸变的男性其精子中 X 染色体的含量12,13,14。这些研究表明，与核型正常的男性相比，存在染色体畸变的男性精液中非整倍体精子的频率更高12,13,14。

与精子细胞不同，目前对于染色体异常个体的卵巢细胞（包括卵母细胞、颗粒细胞/膜细胞及基质细胞）中X染色体的内容知之甚少，这些细胞非整倍性可能对其生殖潜能造成的影响也尚不明确。相较于精子细胞，卵巢细胞核型信息匮乏的一个重要原因是，女性需要接受如卵泡穿刺或手术等侵入性操作，才能获取卵母细胞或卵巢皮质组织。因此，女性配子难以用于科研目的。

目前，荷兰正在进行一项观察性干预研究，旨在探讨对患有特纳综合征（TS）的年轻女性实施卵巢组织冷冻保存的有效性15。本研究中可获得一名患者的卵巢皮质组织片段，用于鉴定卵巢细胞中的X染色体含量16,17。作为该研究的一部分，开发了一种基于解离卵巢皮质组织的荧光原位杂交（FISH）新技术，用于判断在非卵巢体细胞（如淋巴细胞或颊黏膜细胞）中存在染色体异常的女性，其卵巢细胞中是否也存在染色体异常。此外，还评估了卵巢细胞非整倍性对卵泡发生的影响。为此，对已建立的FISH方案进行了改进，使其能够在免疫缺陷小鼠体内进行长期异种移植并人工诱导卵泡发生后，分析卵巢皮质组织切片。本研究介绍了两种基于FISH的方法，用于检测具有X染色体异常的女性在移植前和移植后的卵巢皮质组织中卵巢细胞的X染色体含量，旨在推动该领域基础科学的发展。

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方案

TurnerFertility 研究方案已获得人类受试者研究中央委员会（NL57738.000.16）的批准。本研究中获取了93名特纳综合征（TS）女性的卵巢皮质组织。需要采取安全预防措施的材料列于表1中。

表1：安全注意事项。

材料危害
乙酸严重皮肤灼伤及呼吸道刺激
胶原酶对眼睛、呼吸系统和皮肤有刺激性
DAPI对眼睛、呼吸系统和皮肤有刺激性
DNase I对眼睛、呼吸系统和皮肤有刺激性
乙醇高度易燃
甲醛吸入、摄入和皮肤接触后有毒
甲酰胺
（在荧光探针中）		可能对未出生胎儿造成伤害
Liberase对眼睛、呼吸系统和皮肤有刺激性
甲醇高度易燃，吸入、摄入和皮肤接触后有毒
Nonidet P40对皮肤或眼睛有刺激性
胃蛋白酶对眼睛、呼吸系统和皮肤有刺激性
蛋白酶K吸入后可能导致呼吸困难
二甲苯高度易燃，吸入和皮肤接触后有毒。避免接触眼睛。

表1：需要安全预防措施的材料。

1. 卵巢皮质单个分离细胞的荧光原位杂交

  1. 分离卵巢皮质组织以获得单个细胞
    1. 使用手术刀将冷冻保存/解冻的卵巢皮质组织切成约 1 mm × 1 mm × 1 mm 的小块。
    2. 在 4 mL 预热（37 °C）的 L15 培养基中进行酶消化，该培养基含有 0.1 mg/mL 组织解离酶混合物、10 µg/mL DNase I 和来自 C. histolyticum 的 1 mg/mL 胶原酶 I，于 37 °C 最长消化 75 分钟。每 15 分钟用移液器上下吹打一次消化液。
    3. 加入 4 mL 含 10% 胎牛血清（FBS）的冷 L15 培养基以终止酶消化反应。用 8 mL 冷 L15 培养基在 500 × g 条件下离心洗涤一次解离后的组织，并将沉淀重悬于 500 µL L15 培养基中，避免涡旋震荡以防止细胞损伤。
    4. 将含有大量单个基质细胞和小卵泡（卵母细胞周围包绕单层颗粒细胞）的细胞悬液转移至塑料培养皿中，在体视显微镜下（100 倍放大）观察细胞悬液。
    5. 使用 75 µm 塑料移液管手动挑取小卵泡（<50 µm），并将卵泡转移至含有 10% FBS 的 L15 培养基液滴中，置于 4 °C 以防止卵泡聚集。卵泡挑取操作最长持续 30 分钟。为在 FISH 分析前改善卵泡细胞的铺展，将纯化的卵泡转移至含 0.06% 胰蛋白酶、1 mg/mL 乙二胺四乙酸（EDTA）和 1 mg/mL 葡萄糖的溶液中，于 37 °C 孵育 20 分钟。
    6. 使用 75 µm 塑料移液管从皮质细胞悬液中获取卵巢基质细胞，需特别注意避免混入小卵泡。
  2. 单个卵巢细胞的 FISH 分析
    1. 将经胰蛋白酶/EDTA/葡萄糖处理的卵巢卵泡（建议 n = 5–20）或基质细胞（n > 1,000）转移至载玻片上的液滴中（每滴 5 µL 0.15 mM KCl / 15 µL 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）），于 37 °C 孵育 20 分钟。
    2. 在室温（RT）下用 300 µL 0.05 mM KCl / 7.5% 乙酸 / 22.5% 甲醇对载玻片进行干燥和预固定 2 分钟。随后在室温下用甲醇/乙酸（3:1）覆盖 2 分钟以完成固定。
    3. 通过将 876 g 氯化钠和 441 g 二水合柠檬酸三钠溶于 5 L 蒸馏水中配制 20× 标准柠檬酸钠（SSC）溶液。然后取 100 mL 20× SSC 加入 900 mL 去离子水（demi 水）中，得到 2× SSC。在 73 °C 下用 2× SSC 洗涤样本，加入 100 µL 2% 蛋白酶 K，并用盖玻片密封。在杂交仪中于 37 °C 孵育 10 分钟。
    4. 移除盖玻片，并在室温下用 DPBS 洗涤 5 分钟。在室温下用 1% 甲醛固定 5 分钟。此阶段样本尚未完全附着于载玻片，因此不应置于摇床上。
    5. 在室温下用 DPBS 洗涤 5 分钟，随后依次在 70%、80%、90% 和 100% 乙醇中各脱水 2 分钟。将脱水后的样本空气干燥，并与荧光标记探针进行杂交。
    6. 选择针对 X 染色体的着丝粒特异性探针以及另一条染色体的着丝粒特异性探针作为对照，以确定卵巢细胞中的 X 染色体含量。本实验中使用直接标记荧光染料 SpectrumGreen 的 X 染色体着丝粒探针（CEP X [DXZ1]）和直接标记荧光染料 SpectrumOrange 的 18 号染色体着丝粒探针（CEP 18 [D18Z1]）。
    7. 向样本中加入 1 µL CEP X 探针、1 µL CEP 18 探针和 18 µL 杂交缓冲液，用胶水将盖玻片密封于载玻片上，防止杂交过程中探针蒸发。将载玻片转移至杂交仪中，在 73 °C 变性 3 分钟，随后于 37 °C 过夜孵育进行杂交。
    8. 杂交完成后，移除盖玻片及残留胶水。在 72 °C 下用 0.4× SSC / 0.3% Tween-20 洗涤 2 分钟，随后在室温下用 2× SSC / 0.1% Tween-20 孵育 1 分钟。
    9. 依次在 70%、80%、90% 和 100% 乙醇中各孵育 2 分钟进行脱水，并在避光条件下空气干燥。用含 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂覆盖载玻片。分析前于 -20 °C 至少保存 10 分钟。
  3. 成像
    1. 使用连接图像处理软件的荧光显微镜观察 X 染色体的信号。
      1. 首先选择 荧光染料 DAPI。
        1. 在 630 倍放大下选择 新建细胞 > 实时 > 采集 进行图像采集。将弹出一个包含阈值设置的新窗口。将阈值的蓝色条设为 0 以最小化背景，红色条设为最大值（255）以增强信号亮度。点击 确认。
        2. 将弹出增强窗口，系统建议的参数为明暗度（12）、半径（3）和深度（1）。可使用默认建议值，或根据需要进行调整。
      2. 其次选择 荧光染料 SpectrumOrange 并点击 采集。
        1. 将阈值的蓝色条设为 0 以最小化背景，红色条设为最大值（255）以增强信号亮度。点击 确认。
        2. 增强窗口将弹出，系统建议的参数为明暗度（-11）、半径（2.7）和深度（0.6）。可使用默认建议值，或根据需要进行调整。
      3. 最后选择 荧光染料 SpectrumGreen 并点击 采集。
        1. 将阈值的蓝色条设为 0 以最小化背景，红色条设为最大值（255）以增强信号亮度。点击 确认。
        2. 增强窗口将弹出，系统建议的参数为明暗度（0）、半径（3）和深度（0）。可使用默认建议值，或根据需要进行调整。将图像保存至新建文件中。
          注：仅当对照染色体 18 出现两个信号时，才对体细胞进行评估。大多数卵母细胞中，每条染色体仅能检测到一个信号。
    2. 分析后将载玻片避光保存于 4 °C，以防止信号丢失。

2. 移植卵巢皮质组织石蜡切片的荧光原位杂交（FISH）

注意：将18名特纳综合征（TS）女性的冷冻保存/解冻卵巢皮质组织片段移植到重症联合免疫缺陷（SCID）小鼠体内，持续5个月。异种移植程序此前已有描述，该实验在比利时布鲁塞尔的天主教鲁汶大学（Université Catholique de Louvain）进行，遵循当地动物研究委员会关于动物福利的指导原则（编号2014/UCL/MD/007）18,19。

  1. 选择含有卵泡的异种移植卵巢皮质组织切片
    1. 将异种移植的卵巢皮质组织用4%甲醛固定，并包埋于石蜡中。用解剖刀修整石蜡块以去除多余的石蜡，然后在旋转式切片机上将石蜡块切成4 µm厚的切片。
    2. 从石蜡带中每隔七片选取一片进行苏木精-伊红（HE）染色，以确定哪些切片含有卵泡。将切片置于40–45 °C的水浴中展平，然后贴附于免疫组织化学显微镜载玻片上。
  2. 脱蜡与HE染色
    1. 将载玻片置于60 °C的烘箱中10分钟，随后将载玻片浸入100%二甲苯中5分钟。载玻片无需直接放置在加热板上。在100%乙醇中水化15秒，接着在96%乙醇中浸洗2次，每次15秒。用自来水冲洗载玻片2分钟。
    2. 将载玻片在苏木精中染色10分钟，然后用自来水短暂冲洗。将载玻片短暂浸入碳酸氢盐溶液（5 L蒸馏水中含100 g硫酸镁和10 g碳酸氢钠）中。再用自来水冲洗载玻片5分钟。
    3. 用伊红复染4分钟，随后用100%乙醇脱水三次，再浸入二甲苯中。加盖盖玻片封片，于光学显微镜下观察HE染色切片，选择含有卵泡的切片（100倍放大）。
  3. 石蜡切片DNA FISH的预处理与杂交
    1. 从石蜡带中选择紧邻含卵泡切片之前或之后的新切片。将一片切片贴附于玻璃载玻片上。在56 °C的烘箱中干燥石蜡切片至少45分钟。载玻片无需直接放置在加热板上。
    2. 将切片在二甲苯中脱蜡10分钟。将载玻片浸入99.5%乙醇中，再用自来水冲洗5分钟。使用靶修复液（低pH）在96 °C下预处理10分钟。冷却后，用蒸馏水冲洗载玻片。
    3. 用0.01 M盐酸处理5分钟，随后在37 °C下用胃蛋白酶消化（200 U/mL）15分钟。再次用0.01 M盐酸冲洗，然后用PBS冲洗。
    4. 用1%甲醛/PBS固定5分钟。用PBS短暂冲洗，再用去离子水冲洗。在99.5%乙醇中脱水，然后自然晾干。
    5. 选择一个X染色体着丝粒特异性探针，以及另一个染色体特异性着丝粒探针作为对照，以确定颗粒细胞中的X染色体含量。此处使用18号染色体作为对照。
    6. 在预处理后的切片上直接加入5 µL用SpectrumGreen荧光染料直接标记的CEP 18（D18Z1）探针和用SpectrumRed荧光染料直接标记的CEP X（DXZ1）探针。加盖盖玻片，并用光固化胶密封。将载玻片放入杂交仪中，在80 °C下变性10分钟，随后在37 °C下过夜杂交。
    7. 次日，在42 °C下用2x SSC溶液冲洗5分钟，随后在73 °C下分别用0.3% Nonidet P40冲洗2分钟和1分钟。更换新的2x SSC溶液，并在室温下再次冲洗5分钟。盖上容器盖子，使切片避光保存。
    8. 用蒸馏水短暂冲洗切片。在99.5%乙醇中脱水，再次自然晾干。最后，用含DAPI和封片剂的溶液封片。
  4. 成像
    1. 在荧光显微镜下以630倍放大倍数分析结果。打开计算机上的图像处理软件，选择FISH 作为分析模式。
    2. 检查DAPI的发射波长是否设置为431 nm，激发波长为359 nm；Texas red的发射波长为613 nm，激发波长为595 nm；FITC的发射波长为519 nm，激发波长为495 nm。
    3. 通过选择Live > Capture Single Image获取图像。在左侧的Image 菜单中调节Exposure Slider和Gain Slider，优化曝光和增益参数（例如，曝光：212 ms，增益：7.9），以获得最佳图像质量。不同图像所需的曝光和增益参数可能不同，需在调整过程中观察变化以优化图像。将图像保存至新建的文件中。
    4. 分析完成后，将载玻片置于4 °C避光保存，以防止信号丢失。

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结果

移植前对分离的卵巢细胞进行FISH检测
本研究采用来自45,X/46,XX（患者A）或45,X/46,XX/47,XXX（患者B）特纳综合征（TS）女性的冻存卵巢皮质组织，以展示本方案的应用结果。患者A中，50%的淋巴细胞核型为45,X，50%为46,XX；患者B中，38%的淋巴细胞为45,X，28%为46,XX，34%为47,XXX。使用针对X染色体（绿色）的着丝粒特异性探针和作为对照的18号染色体（红色）探针，检测未经异种移植的特纳综合征患者卵巢皮质组织中分离的单个颗粒细胞、基质细胞和卵母细胞的X染色体含量（图1）。

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讨论

FISH 分析是一种众所周知的技术，可用于检测男性和女性淋巴细胞或颊黏膜细胞中的 X 染色体异常10。已有若干研究报道了对携带 X 染色体异常的男性精子细胞进行 FISH 分析的结果，但针对携带 X 染色体异常的女性卵巢细胞开展 FISH 分析所获得的详细信息仍然缺乏14。本文介绍了一种基于 FISH 的新方法，用于检测非移植及移植的卵巢皮质组织中是否存在卵巢细胞非整倍体。

从非移植的卵巢皮质组织中分离单个卵巢细胞的实验方案主要难点在于组织的酶消化过程，这需要事先进行一定的练习。为了获得足够数量且FISH信号准确的卵巢细胞，必须严格遵循有关酶消化、孵育时间以及指定温度的各个步骤。偏离该方案可能导致在操作过程中卵巢细胞大量丢失，这一点在卵巢储备功能本已较低的患者中尤应避免。该方法中的另一个关键步骤是用胰蛋白酶处理纯化的原始卵泡，以防止卵母细胞和颗粒细胞团块聚集，否则将无法对单个细胞进行分析。如果不进行胰蛋白酶处理，可通过FISH可靠分析的单个颗粒细胞数量将显著减少。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢Marjo van Brakel、Dominique Smeets、Guillaume van de Zande、Patricia van Cleef和Milan Intezar提供的专业知识和技术支持。资助来源：Merck Serono（A16-1395）、Goodlife和Ferring。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙酸Biosolve BV0001070602BS
离心机 1200Hettich Universal4140
胶原酶 ISigma131470
盖玻片VWR0631-0146
DAPIVectorH-1200
DNase IRoche10104159001
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液 LonzaBE17-513Q
EDTAMerck108421
伊红-YSigma1159350100
乙醇EMSURE1009832500
胎牛血清（FBS）Life technology10100147
组织切片荧光显微镜 DM4 BLeica Microsystems 
荧光显微镜 A1Zeiss AXIO
用于解离细胞的荧光标记探针Abbott DiagnosticsCEPX (DXZ1) 05J1023
CEP18 (D18Z1) 05J0818
用于组织切片的荧光标记探针Abbott DiagnosticsCEP X (DXZ1 05J08-023
CEP 18 (D18Z1)  05J10-028
甲醛Sigma252549
葡萄糖Merck108337
胶水（Fixogum）Leica MicrosystemsLK071A
苏木精Sigma1159380025
杂交缓冲液Abott Diagnostics32-804826/06J67-001
杂交仪 DakoS2451
盐酸Merck1003171000
单个卵巢皮质细胞图像处理软件（Cytovision 7.7）Leica Biosystems
石蜡切片图像处理软件 Leica Application Suitex (3.7.5.24914)
免疫组织化学显微镜载玻片DakoK802021-2
L15Lonza12-700Q
Liberase DHRoche05 401 151 001
光学显微镜Zeiss West Germany
硫酸镁MerckA335586
甲醇Honeywell14262-1L
封片介质Vectashield, VectorH-1000
Nonidet P40Sigma7385-1L
石蜡Poth Hile2712.20.10
胃蛋白酶SigmaP7000-25G
磷酸盐缓冲液（PBS）Gibco11530546
塑料移液管CooperSurgical7-72-4075/1
氯化钾 Merck1049361000
蛋白酶KQiagen19131
旋转式切片机 HM 355SThermo sceintific
手术刀Dahlhausen11.000.00.515
用于解离细胞FISH的载玻片Thermo scientificJ1810AM1JZ
碳酸氢钠Sigma55761-500G
标准柠檬酸钠（SSC）Fisher Scientific, Invitrogen10515203
体视显微镜 IX 70Olympus
靶标修复液   DakoGV80511-2
胰蛋白酶SigmaT4799
Tween-20ThermoFisher85113
二甲苯BOOM760518191000

参考文献

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