本文介绍了两种基于荧光的方法 原位 通过杂交技术测定染色体异常女性非移植及移植卵巢皮质组织中卵巢细胞的X染色体含量。
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本文内容
摘要
摘要
全球数百万人面临生育问题。生育能力下降甚至不孕可能由多种不同原因引起，其中包括遗传性疾病，而染色体异常是最常见的遗传因素。荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）是一种广为人知且常用的技术，用于检测人类染色体的异常。FISH 主要用于分析携带数目或结构染色体异常的男性精子细胞中的染色体畸变。此外，该技术也常用于女性，以检测已知可导致卵巢发育不全的 X 染色体异常。然而，目前仍缺乏关于在淋巴细胞和/或颊细胞中存在 X 染色体异常的女性其卵巢细胞中 X 染色体组成的相关信息。
本研究旨在通过两种基于FISH的技术来鉴定卵巢细胞中的X染色体内容，从而推进关于女性X染色体异常的基础研究。首先，描述了一种用于确定携带X染色体异常的女性未移植卵巢皮质组织中分离出的卵巢细胞（卵母细胞、颗粒细胞和基质细胞）X染色体组成的方法。第二种方法旨在通过分析携带X染色体异常的女性卵巢组织在长期移植至免疫缺陷小鼠后新形成的次级卵泡和腔状卵泡中卵巢细胞的X染色体组成，评估染色体异常对卵泡发生的影响。这两种方法在今后的研究中可能有助于深入了解X染色体异常女性的生殖潜力。
引言
不孕症是影响男性或女性生殖系统的一种健康问题，全球约有1.86亿育龄人群受其困扰1。在至少35%的不孕夫妇中，不孕原因是女性生殖系统疾病2。导致女性不孕的因素有很多，包括遗传因素、生殖道异常、内分泌功能障碍、炎症性疾病以及医源性治疗3。
大约10%的不孕女性存在遗传异常4,5。在所有遗传异常中，X染色体畸变是卵巢发育不全最常见的原因2。多项研究报道，患有特纳综合征（TS）或三X综合征女性的X染色体畸变与卵泡过早衰竭有关，其原因是生殖细胞加速丢失或卵子发生受损6,7,8。
X染色体的畸变可分为两类：1）数目畸变，即X染色体的数量异常，但X染色体本身结构完整；2）结构畸变，即X染色体获得了或丢失了遗传物质3,9。X染色体....
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方案
TurnerFertility 研究方案已获得人类受试者研究中央委员会（NL57738.000.16）的批准。本研究中获取了93名特纳综合征（TS）女性的卵巢皮质组织。需要采取安全预防措施的材料列于表1中。
表1：安全注意事项。
| 材料 | 危害 | ||
| 乙酸 | 严重皮肤灼伤及呼吸道刺激 | ||
| 胶原酶 | 对眼睛、呼吸系统和皮肤有刺激性 | ||
| DAPI | 对眼睛、呼吸系统和皮肤有刺激性 | ||
| DNase I | 对眼睛、呼吸系统和皮肤有刺激性 | ||
| 乙醇 | |||
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结果
移植前对分离的卵巢细胞进行FISH检测
本研究采用来自45,X/46,XX（患者A）或45,X/46,XX/47,XXX（患者B）特纳综合征（TS）女性的冻存卵巢皮质组织，以展示本方案的应用结果。患者A中，50%的淋巴细胞核型为45,X，50%为46,XX；患者B中，38%的淋巴细胞为45,X，28%为46,XX，34%为47,XXX。使用针对X染色体（绿色）的着丝粒特异性探针和作为对照的18号染色体（红色）探针，检测未经异种移植的特纳综合征患者卵巢皮质组织中分离的单个颗粒细胞、基质细胞和卵母细胞的X染色体含量（图1）。
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讨论
FISH 分析是一种众所周知的技术，可用于检测男性和女性淋巴细胞或颊黏膜细胞中的 X 染色体异常10。已有若干研究报道了对携带 X 染色体异常的男性精子细胞进行 FISH 分析的结果，但针对携带 X 染色体异常的女性卵巢细胞开展 FISH 分析所获得的详细信息仍然缺乏14。本文介绍了一种基于 FISH 的新方法，用于检测非移植及移植的卵巢皮质组织中是否存在卵巢细胞非整倍体。
从非移植的卵巢皮质组织中分离单个卵巢细胞的实验方案主要难点在于组织的酶消化过程，这需要事先进行一定的练习。为了获得足够数量且FISH信号准确的卵巢细胞，必须严格遵循有关酶消化、孵育时间以及指定温度的各个步骤。偏离该方案可能导致在操作过程中卵巢细胞大量丢失，这一点在卵巢储备功能本已较低的患者中尤应避免。该方法中的另一个关键步骤是用胰蛋白酶处理纯化的原始卵泡，以防止卵母细胞和颗粒细胞团块聚集，否则将无法对单个细胞进行分析。如果不进行胰蛋白酶处理，可通过FISH可靠分析的单个颗粒细胞数量将显著减少。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Marjo van Brakel、Dominique Smeets、Guillaume van de Zande、Patricia van Cleef和Milan Intezar提供的专业知识和技术支持。资助来源：Merck Serono（A16-1395）、Goodlife和Ferring。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙酸 | Biosolve BV | 0001070602BS | |
| 离心机 1200 | Hettich Universal | 4140 | |
| 胶原酶 I | Sigma | 131470 | |
| 盖玻片 | VWR | 0631-0146 | |
| DAPI | Vector | H-1200 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液 | Lonza | BE17-513Q | |
| EDTA | Merck | 108421 | |
| 伊红-Y | Sigma | 1159350100 | |
| 乙醇 | EMSURE | 1009832500 | |
| 胎牛血清（FBS） | Life technology | 10100147 | |
| 组织切片荧光显微镜 DM4 B | Leica Microsystems | ||
| 荧光显微镜 A1 | Zeiss AXIO | ||
| 用于解离细胞的荧光标记探针 | Abbott Diagnostics | CEPX (DXZ1) 05J1023 CEP18 (D18Z1) 05J0818 | |
| 用于组织切片的荧光标记探针 | Abbott Diagnostics | CEP X (DXZ1 05J08-023 CEP 18 (D18Z1) 05J10-028 | |
| 甲醛 | Sigma | 252549 | |
| 葡萄糖 | Merck | 108337 | |
| 胶水（Fixogum） | Leica Microsystems | LK071A | |
| 苏木精 | Sigma | 1159380025 | |
| 杂交缓冲液 | Abott Diagnostics | 32-804826/06J67-001 | |
| 杂交仪 | Dako | S2451 | |
| 盐酸 | Merck | 1003171000 | |
| 单个卵巢皮质细胞图像处理软件（Cytovision 7.7） | Leica Biosystems | ||
| 石蜡切片图像处理软件 | Leica Application Suitex (3.7.5.24914) | ||
| 免疫组织化学显微镜载玻片 | Dako | K802021-2 | |
| L15 | Lonza | 12-700Q | |
| Liberase DH | Roche | 05 401 151 001 | |
| 光学显微镜 | Zeiss West Germany | ||
| 硫酸镁 | Merck | A335586 | |
| 甲醇 | Honeywell | 14262-1L | |
| 封片介质 | Vectashield, Vector | H-1000 | |
| Nonidet P40 | Sigma | 7385-1L | |
| 石蜡 | Poth Hile | 2712.20.10 | |
| 胃蛋白酶 | Sigma | P7000-25G | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Gibco | 11530546 | |
| 塑料移液管 | CooperSurgical | 7-72-4075/1 | |
| 氯化钾 | Merck | 1049361000 | |
| 蛋白酶K | Qiagen | 19131 | |
| 旋转式切片机 HM 355S | Thermo sceintific | ||
| 手术刀 | Dahlhausen | 11.000.00.515 | |
| 用于解离细胞FISH的载玻片 | Thermo scientific | J1810AM1JZ | |
| 碳酸氢钠 | Sigma | 55761-500G | |
| 标准柠檬酸钠（SSC） | Fisher Scientific, Invitrogen | 10515203 | |
| 体视显微镜 IX 70 | Olympus | ||
| 靶标修复液 | Dako | GV80511-2 | |
| 胰蛋白酶 | Sigma | T4799 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | 85113 | |
| 二甲苯 | BOOM | 760518191000 |
参考文献
- Vander Borght, M., Wyns, C. Fertility and infertility: Definition and epidemiology. Clinical Biochemistry. 62, 2-10 (2018).
- Yatsenko, S. A., Rajkovic, A. Genetics of human female infertility. Biology of Reproduction. 101 (3), 549-566 (2019).
- Yahaya, T. O., et al....
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